一种酶法水解富集鱼油中epa、dha的方法
阅读说明：本技术 一种酶法水解富集鱼油中epa、dha的方法 (Method for enriching EPA and DHA in fish oil through enzymatic hydrolysis ) 是由 王永华 刘壮 蓝东明 杨博 刘萱 罗日明 李志刚 王卫飞 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明属富集油脂中特定脂肪酸的技术领域,公开了一种酶法水解富集鱼油中EPA、DHA的方法,包括如下步骤：(1)将鱼油、水和脂肪酶混合,20-70℃进行水解反应,水解产物酸价为60±15mg/g时停止反应；(2)离心步骤(1)水解产物,取上层油相,与水和偏甘油酯脂肪酶混合继续水解反应,水解产物酸价为70±15mg/g时,停止反应；(3)离心步骤(2)水解产物,取上层油相,分子蒸馏后所得重相为富含EPA、DHA的混合甘油酯。水解法直接使用鱼油和水作为原料,环境友好、绿色安全、操作简单,不消耗试剂,成本降低,两步水解后DHA、EPA在鱼油中占比可达45.53％-60.45％。(The invention belongs to the technical field of enriching specific fatty acid in grease, and discloses a method for enriching EPA and DHA in fish oil by enzymatic hydrolysis, which comprises the following steps: (1) mixing fish oil, water and lipase, and performing hydrolysis reaction at 20-70 deg.C until the acid value of the hydrolysate is 60 + -15 mg/g; (2) centrifuging the hydrolysate obtained in the step (1), taking the upper oil phase, mixing the upper oil phase with water and partial glyceride lipase to continue hydrolysis reaction, and stopping the reaction when the acid value of the hydrolysate is 70 +/-15 mg/g; (3) and (3) centrifuging the hydrolysate in the step (2), taking the upper oil phase, and performing molecular distillation to obtain a heavy phase which is mixed glyceride rich in EPA and DHA. The hydrolysis method directly uses the fish oil and the water as raw materials, is environment-friendly, green and safe, is simple to operate, does not consume reagents, and reduces the cost, and the DHA and the EPA can account for 45.53-60.45 percent of the fish oil after two steps of hydrolysis.)
技术领域
本发明属于富集油脂中特定脂肪酸的技术领域，具体涉及一种酶法水解富集鱼油中EPA、DHA的方法。
背景技术
二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)均属于ω-3多不饱和脂肪酸系列，后者还是大脑和视网膜组织的细胞膜的主要成分。
但EPA和DHA作为人体不能自身合成的必需脂肪酸，必须通过食物来摄取。目前人体EPA和DHA的补充主要来源于市售鱼油，但天然鱼油甘油酯中EPA和DHA含量普遍偏低(＜25％)，在医药和保健品领域不能满足人体的要求。因此通过市售天然鱼油富集EPA和DHA来满足人体需要具有极大的市场前景。DHA和EPA产品的富集形式主要有游离型、乙酯型、甘油酯型，其中游离型EPA和DHA因口味酸难以被人接受，且极易氧化腐败变质形成对人体有害的物质；乙酯型EPA和DHA食用难以被人体吸收消化，同时存在安全隐患；因而只有甘油酯型EPA和DHA能满足人体吸收消化需求，包括甘油二酯型EPA、DHA和甘油三酯型EPA、DHA。甘油二酯是甘油三酯(TAG)的一个脂肪酸被羟基取代的所形成的结构脂，由两个结构异构体1,2-DAG和1,3-DAG组成，是食用油天然组成的一部分。甘油二酯被美国食品药品监督局(FDA)列为安全食品(GRAS)，在食品领域具有广泛的应用。
目前富集EPA和DHA的方法分为传统方法和酶法富集。传统方法包括：低温结晶法、尿素包合法、分子蒸馏法、银离子络合法、超临界流体萃取法。传统方法在富集EPA和DHA中存在成本高、工艺复杂、产生大量固废、反应时间长、反应产率低等缺点，同时富集过程中还存在EPA和DHA的氧化损失。工业上富集EPA和DHA多采用酶法富集，其中主要是酶法合成甘油三酯型EPA、DHA进行富集。利用酶法催化富集EPA和DHA合成甘油三酯主要包括酯化、酯交换、水解三种催化形式，但由于EPA和DHA具有长碳链以及顺势双键，造成了EPA和DHA空间结构大，因而进行酯化和酯交换时，产率低且反应时间长，同时酶法合成甘油三酯型EPA和DHA前期需要用一些传统方法来富集游离EPA和DHA，存在传统方法固有的缺点。
李俊在其硕士论文《米曲霉脂肪酶制备高含量多不饱和脂肪酸鱼油的研究》中，以国产鳀鱼鱼油为原料，采用酶法醇解和酯酯交换反应两步法富集制备高含量EPA和DHA甘油酯产品，优化反应条件，反应48h后，产物甘油酯中EPA和DHA总含量可达到41.78％。李丽帆等人在《生物加工过程》2009年7卷6期发表了《固定化脂肪酶选择性水解废弃鱼油富集DHA和EPA甘油酯》，该文采用两次水解，第一次水解11.7h后进行第二次水解，经过两次水解，EPA和DHA质量分数分别从原始鱼油的4.2％和18.9％提高到8.5％和42％。刘芳在其硕士论文《酶法催化制备富含EPA和DHA甘油三酯研究》中，以精炼深海鱼油为原料，首先以脂肪酶Amano AY“Amano”400SD为催化剂对原料进行水解，然后用水解反应得到的甘油酯与浓缩鱼油乙酯在真空条件下通过酶催化酯交换反应合成甘油三酯，产品甘油酯中EPA和DHA的含量分别为25.3wt％、21.6wt％。上述这些方法均对EPA和DHA进行了一定量的富集，然而与本发明的两步水解法相比，上述方法存在反应时间长、能耗高、富集率低等缺点，同时上述方法富集得到的产品中含有一定量的单甘酯和游离脂肪酸，影响产品质量，不能作为工业富集EPA和DHA的方法。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有富集技术和EPA和DHA产品类型的不足，提供了一种酶法水解富集鱼油中EPA、DHA的方法，该方法富集EPA和DHA具有反应产率高、反应流程操作简便、反应速度快、降低成本同时不产生固废等优点。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种酶法水解富集鱼油中EPA、DHA的方法，包括以下步骤：
(1)将鱼油、水和脂肪酶混合、搅拌，20-70℃进行水解反应，当水解产物酸价为60±15mg/g时，停止反应；
(2)离心步骤(1)所得水解产物，取上层油相，与水和偏甘油酯脂肪酶混合、搅拌，20-70℃继续进行水解反应，水解产物酸价为70±15mg/g时，停止反应；
(3)离心步骤(2)所得水解产物，取上层油相，进行分子蒸馏，分子蒸馏后所得重相即为富含EPA、DHA的混合甘油酯。
优选地，步骤(1)所述脂肪酶：水：鱼油的质量比为(0.0001-0.0075)：(0.05-0.5)：1。
优选地，步骤(2)所述偏甘油酯脂肪酶：水：上层油相的质量比为(0.005-0.075)：(0.05-0.5)：1。
优选地，步骤(1)所述水解产物酸价为60±5mg/g时，停止反应；步骤(2)所述水解产物酸价为70±5mg/g时，停止反应。
优选地，步骤(1)所述水解反应温度为35～45℃，水解反应时间为1～6h；步骤(2)所述水解反应温度为35～45℃，水解反应时间为1～6h。
优选地，步骤(1)所述脂肪酶为Lipase TL100L、Lipase T1中的一种或两种的混合。
优选地，步骤(2)所述偏甘油酯脂肪酶为Lipase AOL、Lipase AOL-V269D和LipaseSMG1中的一种或两种以上的混合。
优选地，步骤(1)和步骤(2)所述水解反应的pH为6-8，所述水解反应在惰性气体保护下进行。
优选地，步骤(3)所述分子蒸馏处理的条件为真空度为0.01～0.2pa、跨膜转速为250～350rpm、进料速度为1.0～1.5ml/min，蒸馏温度为120℃～160℃。
优选地，步骤(1)所述水解反应搅拌速率为200-1000rpm；步骤(2)所述水解反应搅拌速率为200-1000rpm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)富集EPA和DHA过程中不涉及传统的物理化学富集方法，不会消耗试剂，因而降低成本。同时水解法直接使用鱼油和水作为原料，具有环境友好、绿色安全、操作简单的优点。
(2)本方法创造性的使用两种脂肪酶水解鱼油，首先利用脂肪酶Lipase TL100L对鱼油进行水解，测得酸价在60±5mg/g范围时，离心脱水除酶后进一步利用偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D选择性水解混合甘油酯中甘油二酯和单甘酯中的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，从而实现混合甘油酯中EPA和DHA的进一步纯化。
(3)本方法所得产品中富含甘油二酯型DHA、EPA，甘油二酯作为一种功能性油脂可以减少人体脂肪的过度积累，促进人体中的脂质代谢，因而本方法所得产品在食品和药品领域具有广泛的应用。
(4)两步水解后DHA、EPA在鱼油中占比高达45.53％-60.45％，比原始鱼油中EPA和DHA占比提高了18.14％-27.69％；两步水解后EPA和DHA在金枪鱼油中最高占比合计为60.45％，比现存技术中李丽帆(50.5％)、刘芳(46.9％)产物甘油酯中EPA和DHA总含量分别提高了9.95％和13.55％；两步水解后EPA和DHA在藻油中最高占比合计为59.68％，比现存技术中曾甜甜通过酶法水解富集DHA(最高占比为37.8％)提高了21.88％。
附图说明
图1为第二次水解反应图。
图2为第二次水解反应离心后效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例中使用的脂肪酶Lipase TL100L购自于丹麦诺维信公司；
偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL及Lipase AOL-V269D已在专利CN108504643A“一种来源于米曲霉的偏甘油酯脂肪酶及其制备方法和晶体结构”中公开。
金枪鱼油、三文鱼油、凤尾鱼油、冬化藻油均购自丰益油脂化学(上海)有限公司。
实施例1
在反应容器中加入500g金枪鱼油、蒸馏水、脂肪酶Lipase TL100L，充分搅拌使反应容器中的物质混合完全，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为金枪鱼油质量的15％，所述脂肪酶Lipase TL100L的添加量为金枪鱼油质量的0.1％。
反应3.5h后，检测到水解产物酸价为60.36mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。将水解产物10000rpm离心5min，取上层油相，加入蒸馏水、偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D继续进行水解反应，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为离心收集油相质量的20％，所述偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D的添加量为离心收集油相质量的2.0％。
再次反应1.5h后，检测到水解产物酸价为68.26mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。水解产物经高效液相色谱检测，其甘油酯组成如表1所示。
表1：金枪鱼油原油两步水解产物成分组成及含量
将此水解产物10000rpm离心5min，取上层油相进行分子蒸馏处理，所述分子蒸馏处理的条件为真空度为10-3mbar、跨膜转速为300rpm、进料量速度为1.0ml/min，蒸馏温度为140℃；收集分子蒸馏处理所得重相(即为富含DHA和EPA的混合甘油酯)244.7g，所得轻相(主要为脂肪酸)126.5g；实施例1制备获得的重相的产率为48.89％(注：产率＝重相质量/所述金枪鱼油原油的质量)。
经GC-FID分析，鉴定了实施例1中金枪鱼原油和分子蒸馏制备获得的重相油脂的成分，鉴定结果如表2所示。结果表明，通过两步水解后EPA和DHA在金枪鱼油中最高占比合计为56.45％，比金枪鱼原油中EPA和DHA占比(28.76％)提高了27.69％，现存技术中李俊通过酶法醇解和酯酯交换反应两步法富集制备高含量EPA和DHA甘油酯产品，产物甘油酯中EPA和DHA总含量仅达39.72％，本实施例比其提高了16.73％。
表2：金枪鱼油原油与分子蒸馏所得产品中主要脂肪酸含量
所得重相：离心两步水解产物，取上层油相进行分子蒸馏后，收集所得重相
实施例2
在反应容器中加入500g三文鱼油、蒸馏水、脂肪酶Lipase TL100L，充分搅拌使反应容器中的物质混合完全，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为三文鱼油质量的10％，所述脂肪酶Lipase TL100L的添加量为三文鱼油质量的0.15％。
反应3.5h后，检测到水解产物酸价为58.37mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。将水解产物10000rpm离心5min，取上层油相，加入蒸馏水、偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D继续进行水解反应，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为离心收集油相质量的20％，所述偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D的添加量为离心收集油相质量的2.5％。
再次反应1.5h后，检测到水解产物酸价为70.55mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。水解产物经高效液相色谱检测，其甘油酯组成如表3所示。
表3：三文鱼油原油两步水解产物成分组成及含量
将此水解产物10000rpm离心5min，取上层油相进行分子蒸馏处理，所述分子蒸馏处理的条件为真空度为10-3mbar、跨膜转速为300rpm、进料量速度为1.0ml/min，蒸馏温度为140℃；收集分子蒸馏处理所得重相(即为富含DHA和EPA的混合甘油酯)228.3g，所得轻相(主要为脂肪酸)128.6g；实施例2制备获得的重相的产率为45.66％(注：产率＝重相质量/所述三文鱼油原油的质量)。
经GC-FID分析，鉴定了实施例2中三文鱼原油和分子蒸馏制备获得的重相油脂的成分，鉴定结果如表4所示。结果表明，通过水解后EPA和DHA在三文鱼油中最高占比合计为49.11％，比三文鱼原油中EPA和DHA占比(25.08％)提高了24.03％。
表4：三文鱼油原油与分子蒸馏所得产品中主要脂肪酸含量
所得重相：离心两步水解产物，取上层油相进行分子蒸馏后，收集所得重相
实施例3
在反应容器中加入500g三文鱼油、蒸馏水、脂肪酶Lipase TL100L，充分搅拌使反应容器中的物质混合完全，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为45℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为三文鱼油质量的20％，所述脂肪酶Lipase TL100L的添加量为三文鱼油质量的0.1％。
反应2.0h后，检测到水解产物酸价为58.37mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。将水解产物10000rpm离心5min，取上层油相，加入蒸馏水、偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D继续进行水解反应，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为45℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为离心收集油相质量的15％，所述偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D的添加量为离心收集油相质量的1.5％。
再次反应2.0h后，检测到水解产物酸价为67.36mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。水解产物经高效液相色谱检测，其甘油酯组成如表5所示。
表5：三文鱼油原油两步水解产物成分组成及含量
将此水解产物10000rpm离心5min，取上层油相进行分子蒸馏处理，所述分子蒸馏处理的条件为真空度为10-3mbar、跨膜转速为300rpm、进料量速度为1.0mL/min，蒸馏温度为130℃；收集分子蒸馏处理所得重相(即为富含DHA和EPA的混合甘油酯)214.3g，所得轻相(主要为脂肪酸)144.8g；实施例3制备获得的重相的产率为42.86％(注：产率＝重相质量/所述三文鱼油原油的质量)。
经GC-FID分析，鉴定了实施例3中三文鱼原油和分子蒸馏制备获得的重相油脂的成分，鉴定结果如表6所示，结果表明，通过水解后EPA和DHA在三文鱼油中最高占比合计为46.8％，比三文鱼原油中EPA和DHA占比(25.08％)提高了21.72％。
表6：三文鱼油原油与分子蒸馏所得产品中主要脂肪酸含量
所得重相：离心两步水解产物，取上层油相进行分子蒸馏后，收集所得重相
实施例4
在反应容器中加入500g凤尾鱼油、蒸馏水、脂肪酶Lipase TL100L，充分搅拌使反应容器中的物质混合完全，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为凤尾鱼油质量的15％，所述脂肪酶Lipase TL100L的添加量为凤尾鱼油质量的0.1％。
反应3.5h后，检测到水解产物酸价为62.38mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。将水解产物10000rpm离心5min，取上层油相，加入蒸馏水、偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D继续进行水解反应，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为离心收集油相质量的25％，所述偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D的添加量为离心收集油相质量的2.0％。
再次反应1.5h后，检测到水解产物酸价为74.32mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。水解产物经高效液相色谱检测，其甘油酯组成如表7所示。
表7：凤尾鱼油原油两步水解产物成分组成及含量
将此水解产物10000rpm离心5min，取上层油相进行分子蒸馏处理，所述分子蒸馏处理的条件为真空度为10-3mbar、跨膜转速为300rpm、进料量速度为1.0ml/min，蒸馏温度为140℃；收集分子蒸馏处理所得重相(即为富含DHA和EPA的混合甘油酯)255.4g，所得轻相(主要为脂肪酸)118.7g；实施例4制备获得的重相的产率为51.08％(注：产率＝重相质量/所述凤尾鱼油原油的质量)。
经GC-FID分析，鉴定了实施例4中凤尾鱼原油和分子蒸馏制备获得的重相油脂的成分，鉴定结果如表8所示。结果表明，通过水解后EPA和DHA在凤尾鱼油中最高占比合计为45.53％，比凤尾鱼原油中EPA和DHA占比(21.05％)提高了24.48％。
表8：凤尾鱼油原油与分子蒸馏所得产品中主要脂肪酸含量
所得重相：离心两步水解产物，取上层油相进行分子蒸馏后，收集所得重相
实施例5
在反应容器中加入500g金枪鱼油、蒸馏水、脂肪酶Lipase TL100L，充分搅拌使反应容器中的物质混合完全，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为45℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为金枪鱼油质量的20％，所述脂肪酶Lipase TL100L的添加量为金枪鱼油质量的0.2％。
反应1.5h后，检测到水解产物酸价为57.97mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。将水解产物10000rpm离心5min，取上层油相，加入蒸馏水、偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D继续进行水解反应，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为45℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为离心收集油相质量的20％，所述偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D的添加量为离心收集油相质量的1.5％。
再次反应1.5h后，检测到水解产物酸价为68.82mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。水解产物经高效液相色谱检测，其甘油酯组成如表9所示。
表9：金枪鱼油原油两步水解产物成分组成及含量
将此水解产物10000rpm离心5min，取上层油相进行分子蒸馏处理，所述分子蒸馏处理的条件为真空度为10-3mbar、跨膜转速为300rpm、进料量速度为1.0ml/min，蒸馏温度为160℃；收集分子蒸馏处理所得重相(即为富含DHA和EPA的混合甘油酯)207.6g，所得轻相(主要为脂肪酸)142.8g；实施例5制备获得的重相的产率为41.52％(注：产率＝重相质量/所述金枪鱼油原油的质量)。
经GC-FID分析，鉴定了实施例5中金枪鱼原油和分子蒸馏制备获得的重相油脂的成分，鉴定结果如表10所示。结果表明，通过水解后EPA和DHA在金枪鱼油中最高占比合计为60.45％，比金枪鱼原油中EPA和DHA占比(28.76％)提高了18.14％。现存技术中李丽帆通过两步水解法富集制备高含量EPA和DHA甘油酯产品，产物甘油酯中EPA和DHA总含量最高为50.5％，刘芳通过酶法水解制备高含量EPA和DHA甘油酯产品，产物甘油酯中EPA和DHA总含量最高为46.9％，本实施例与李丽帆、刘芳相比，分别提高了9.95％和13.55％。
表10：金枪鱼油原油与分子蒸馏所得产品中主要脂肪酸含量
所得重相：离心两步水解产物，取上层油相进行分子蒸馏后，收集所得重相
实施例6
由于藻油脂肪酸与鱼油相似，也富含EPA和DHA，因此本发明同样适用于从藻油中提取富含EPA和DHA的混合甘油酯。在反应容器中加入500g冬化藻油、蒸馏水、脂肪酶LipaseTL100L，充分搅拌使反应容器中的物质混合完全，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为冬化藻油质量的20％，所述脂肪酶Lipase TL100L的添加量为冬化藻油质量的0.1％。
反应6h后，检测到水解产物酸价为55.23mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。将水解产物10000rpm离心5min，取上层油相，加入蒸馏水、偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D继续进行水解反应，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，水的添加量为离心收集油相质量的25％，所述偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D的添加量为离心收集油相质量的2.0％。
再次反应2.5h后，检测到水解产物酸价为66.32mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。水解产物经高效液相色谱检测，其甘油酯组成如表11所示。
表11：冬化藻油原油两步水解产物成分组成及含量
将此水解产物10000rpm离心5min，取上层油相进行分子蒸馏处理，所述分子蒸馏处理的条件为真空度为10-3mbar、跨膜转速为300rpm、进料量速度为1.0ml/min，蒸馏温度为140℃；收集分子蒸馏处理所得重相(即为富含DHA和EPA的混合甘油酯)266.5g，所得轻相(主要为脂肪酸)118.4g；实施例6制备获得的重相的产率为53.30％(注：产率＝重相质量/所述冬化藻油原油的质量)。
表12：冬化藻油原油与分子蒸馏所得产品中主要脂肪酸含量
所得重相：离心两步水解产物，取上层油相进行分子蒸馏后，收集所得重相
经GC-FID分析，鉴定了实施例6中冬化藻油原油和分子蒸馏制备获得的重相油脂的成分，鉴定结果如表12所示。结果表明，通过水解后EPA和DHA在藻油中最高占比合计为59.68％，比冬化藻原油中EPA和DHA占比(39.96％)提高了19.72％，现存技术中曾甜甜通过酶法水解富集DHA，最高占比仅为37.8％，本实施例比其提高了21.88％。
对比例1
在反应容器中加入500g金枪鱼油、蒸馏水、脂肪酶Lipase TL100L，充分搅拌使反应容器中的物质混合完全，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为金枪鱼油质量的15％，所述脂肪酶Lipase TL100L的添加量为金枪鱼油质量的1.5％。
反应1.0h后，检测到水解产物酸价为78.26mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。将水解产物10000rpm离心5min，取上层油相，加入蒸馏水、偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D继续进行水解反应，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为离心收集油相质量的20％，所述偏甘油酯脂肪酶Lipase AOL-V269D的添加量为离心收集油相质量的2.0％。
再次反应1.5h后，检测到水解产物酸价为106.78mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。水解产物经高效液相色谱检测，其甘油酯组成如表13所示。
表13：金枪鱼油原油两步水解产物成分组成及含量
将此水解产物10000rpm离心5min，取上层油相进行分子蒸馏处理，所述分子蒸馏处理的条件为真空度为10-3mbar、跨膜转速为300rpm、进料量速度为1.0ml/min，蒸馏温度为140℃；收集分子蒸馏处理所得重相(即为富含DHA和EPA的混合甘油酯)179.8g，所得轻相(主要为脂肪酸)258.6g；对比例1制备获得的重相的产率为35.96％(注：产率＝重相质量/所述金枪鱼油原油的质量)。
经GC-FID分析，鉴定了对比例1中金枪鱼原油和分子蒸馏制备获得的重相油脂的成分，鉴定结果如表14所示。结果表明，通过水解后EPA和DHA在金枪鱼油中最高占比合计仅为34.09％，分析原因是由于加酶量过高，水解过程迅速，反应难以控制。
表14：金枪鱼油原油与分子蒸馏所得产品中主要脂肪酸含量
所得重相：离心两步水解产物，取上层油相进行分子蒸馏后，收集所得重相
对比例2
在反应容器中加入金枪鱼油、蒸馏水、脂肪酶Lipase TL100L，充分搅拌使反应容器中的物质混合完全，通入氮气保护反应产物，然后将反应容器进行密封，控制反应体系的温度为40℃，搅拌速度为200rpm；其中，所述水的添加量为金枪鱼油质量的15％，所述脂肪酶Lipase TL100L的添加量为金枪鱼油质量的0.15％。
反应2.0h后，检测到水解产物酸价为61.22mg/g，此时停止搅拌终止水解反应。水解产物经高效液相色谱检测，其甘油酯组成如表15所示。
表15：金枪鱼油原油两步水解产物成分组成及含量
将此水解产物10000rpm离心5min，取上层油相进行分子蒸馏处理，所述分子蒸馏处理的条件为真空度为10-3mbar、跨膜转速为300rpm、进料量速度为1.0ml/min，蒸馏温度为150℃；收集分子蒸馏处理所得重相(即为富含DHA和EPA的混合甘油酯)288.6g，所得轻相(主要为脂肪酸)133.2g；对比例2制备获得的重相的产率为57.72％(注：产率＝重相质量/所述金枪鱼油原油的质量)。
经GC-FID分析，鉴定了对比例2中金枪鱼原油和分子蒸馏制备获得的重相油脂的成分，鉴定结果如表16所示。结果表明，仅通过一步水解，EPA和DHA在金枪鱼油中的最高占比仅为33.21％，效果远远不及两步水解。
表16：金枪鱼油原油与分子蒸馏所得产品中主要脂肪酸含量
所得重相：离心一步水解产物，取上层油相进行分子蒸馏后，收集所得重相
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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