尿液草酸含量检测体系及检测方法
阅读说明：本技术 尿液草酸含量检测体系及检测方法 (Urine oxalic acid content detection system and detection method ) 是由 黄性义 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了尿液草酸含量检测体系及检测方法,检测体系包括预处理试剂盒和检测试剂盒；预处理试剂盒包括：活性炭和样本处理液,检测试剂盒包括R1试剂和R2试剂；所述R1试剂包括以下组分：柠檬酸、DMAB和MBTH；R2试剂包括以下组分：pH值为5.6的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.1M,所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度大于50U/L,所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度大于5000U/L；所述R2试剂为干粉状态,使用时采用水复溶。本发明具有较高的检测限,能够用于尿液中草酸含量的检测,同时具有较高的检测灵敏度,且能够排除尿液中维C等物质的干扰,使检测结果更加准确。(The invention discloses a system and a method for detecting the oxalic acid content in urine, wherein the detection system comprises a pretreatment kit and a detection kit; the pretreatment kit comprises: activated carbon and a sample processing solution, wherein the detection kit comprises an R1 reagent and an R2 reagent; the R1 reagent comprises the following components: citric acid, DMAB, and MBTH; the R2 reagent includes the following components: buffer solution with pH value of 5.6, oxalate oxidase and peroxidase; the concentration of the buffer solution in the R2 reagent is 0.1M, the concentration of the oxalate oxidase in the R2 reagent is more than 50U/L, and the concentration of the peroxidase in the R2 reagent is more than 5000U/L; the R2 reagent is in a dry powder state and is redissolved by water when in use. The invention has higher detection limit, can be used for detecting the content of oxalic acid in urine, has higher detection sensitivity, and can eliminate the interference of substances such as vitamin C and the like in the urine, so that the detection result is more accurate.)
技术领域
本发明涉及尿液中草酸含量检测技术领域，具体涉及尿液草酸含量检测体系及检测方法。
背景技术
草酸对钙具有较强的螯合作用，因此能够影响人体对钙的吸收与代谢。首先，它可与膳食钙形成稳定的非水溶性螯合物，使钙难以进入人体内环境被人体吸收。其次，人体通过食物摄入和代谢产生的草酸又能与钙在体内形成沉淀，累积在肾小球，这是泌尿系结石的主要成因尿液中草酸的浓度与泌尿系结石密切相关，简便、精准地检测尿草酸含量对泌尿系结石的基础研究和临床治疗具有重要意义。草酸测定方法主要有滴定法、比色法、高压液相色谱法(HPLC)，离子色谱法、毛细管电泳法(CE)、酶法等。
滴定法通过选择一定的滴定剂滴定草酸提取液，以电位的突跃或指示剂的变色来指示滴定终点，再通过滴定溶液的消耗量来计算草酸的含量。滴定法作为一种经典方法至今仍在食品分析中广泛应用，但其灵敏度低，操作较繁琐、耗时；比色法将草酸通过预沉淀提取出来后用酸溶解，之后将草酸氧化或还原，或直接与一定的显色剂反应产生有色物质，通过比色来定量。比色法廉价、灵敏度高，但预沉淀操作难于完全将草酸提取出来，操作繁琐且重复性较差。离子色谱法(IC)借助离子在离子交换柱上，或在浸透过一种离子交换剂的薄膜上迁移率的差异，而进行离子分离的一种离子定性与定量的分析技术；毛细管电泳(CE)分析法高电压、快流速，减少了溶质在毛细管内的停留时间，降低了由于分子扩散而引起的区带扩展，突破性地解决了分析小分子离子的瓶颈，因此适用于微量检测；离子色谱法和毛细管电泳灵敏度高，操作也较简便，但该仪器尚未普及，且只适用于微量检测，不适用于常量检测。高效液相色谱法(HPLC)以邻苯二胺作为衍生剂，在与血和尿中的草酸反应后，可生成具有强紫外吸收的化合物—2,3-二羟基喹喔啉，通过反相C18柱分离，可检测草酸浓度。但高压液相色谱法在分离过程中无机酸的干扰较严重，且仪器昂贵，对操作人员要求较高，普及困难，适于在专业部门使用。
发明内容
本发明的目的在于提供尿液草酸含量检测体系，具有较高的检测限，能够用于尿液中草酸含量的检测，同时具有较高的检测灵敏度，且能够排除尿液中维C等物质的干扰，使检测结果更加准确。
此外，本发明还提供基于上述供尿液草酸含量检测体系的检测方法。
本发明通过下述技术方案实现：
尿液草酸含量检测体系，包括预处理试剂盒和检测试剂盒；
所述预处理试剂盒包括：
样品处理管和样本处理液，所述样本处理管和样本处理液包括以下组分：
样本处理管：0.04-1.5g的活性炭
样本处理液：pH5.7-8.0的缓冲液，EDTA和proclin300；
所述检测试剂盒包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.01-1M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.1-0.5mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.01-0.5mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为3.6-6的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.01-0.5M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度大于等于50U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度大于等于5000U/L；
所述R2试剂为干粉状态，使用时采用水复溶。
本发明的R1试剂为无色透明液体，R2试剂冻干后为白色干粉末，复溶后为无色或淡黄色透明液体。
本发明的检测原理如下：
尿液中的草酸盐通过下述的偶联反应产生着色复合物可用自动化仪器测定；
本发明的核心成分为草酸氧化酶和过氧化物酶，但草酸氧化酶和过氧化物酶的最适pH不同，本发明通过合理设计R2试剂的配方，保证两种酶的较高活性，进而达到高灵敏度的特点，同时通过合理设计R1试剂的配方，使得整个试剂盒不仅灵敏度高，且检测限高，能够适用于尿液中草酸的检测。
本申请由于具有较高的线性，为180mg/L，在检测尿液中草酸含量时，无需对样本进行稀释就可直接进行测量。
在现有草酸测量中，大部分检测试剂盒的检测限均较低，基本都是在9-45mg/L，只能适用于血液中草酸含量的检测，当将其用于尿液中草酸含量检测时，需要对样本进行稀释，导致降低了检测结果的准确度。
同时，由于本发明的检测体系还包括用于对尿液样本进行预处理的预处理试剂盒，预处理试剂盒中包括样本处理管和样本处理液，其中，样本处理液用于维持预处理时的pH值，所述样本处理管吸附尿液中大部分干扰物质。
本发明通过对尿液样本进行预处理，能最大程度的降低尿液中其他物质(如维C)对草酸检测的干扰，继而进一步使检测更稳定，在保证高线性范围的条件下，灵敏度更高。
进一步地，处理液中pH5.7-8.0的缓冲液的浓度为0.1M，EDTA的浓度为1-10Mm，proclin300的质量分数为0.01-0.2％。
进一步地，活性炭的重量为0.07-0.5g。
进一步地，R2试剂的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液有0.1M的柠檬酸和0.1M的柠檬酸钠按体积比11:29混合获得。
进一步地，柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.05-0.3M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.15-0.3mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.09-0.3mM。
进一步地，pH值为4-6的缓冲液，所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.05-0.2M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为50-1000U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为5000-20000U/L
进一步地，检测试剂盒还包括草酸标准品。
基于上述尿液草酸含量检测体系的检测方法，包括以下步骤：
S1、预处理：
将尿液样本和样本处理液按比例加入到试管中，混合，然后将混合液加入到样本处理管中，然后离心分离，留取上清液待测；
S2、检测：
将步骤S1获得的上清液，以及R1试剂和R2试剂放置在仪器的对应位置，启动仪器直接测量。
仪器为BioSystems A400全自动特定蛋白分析仪。
进一步地，步骤S1中，尿液样本和样本处理液的比例为1:1。
进一步地，处理液中pH5.7-8.0的缓冲液的浓度为0.1M，EDTA的浓度为1-10Mm，proclin300的质量分数为0.01-0.2％，样本处理管中活性炭的重量为0.04-1.5g。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明草酸检测试剂盒使草酸氧化酶和过氧化物酶在合适的PH条件下，均达到较高的活性，提高了检测灵敏度。
2、本发明测得草酸检测试剂盒线性范围为1.8-180mmol/L。
3、本发明通过对尿液样本进行预处理，能最大程度的降低尿液中其他物质(如维C)对草酸检测的干扰，继而进一步使检测更稳定，在保证高线性范围的条件下，灵敏度更高。
4、本发明的检测体系自动化仪器操作，在保证检测结果准确的同时，操作更加方便，快捷。
附图说明
：图1为实施例1的线性图；
图2为实施例2的线性图；
图3为实施例3的线性图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
尿液草酸含量检测体系，包括预处理试剂盒和检测试剂盒；
所述预处理试剂盒包括：
所述预处理试剂盒包括：
样本处理管和样本处理液，所述样本处理液包括以下组分：
pH5.7的缓冲液，EDTA和proclin300；所述样本处理液中pH5.7的缓冲液的浓度为0.1M，EDTA的浓度为2Mm，proclin300的质量分数为0.2％；
样本处理管中活性炭的重量为0.1g；
所述检测试剂盒包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.07M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.18mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.09mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为5的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.06M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为100U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为5000U/L；所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液有0.06M的柠檬酸和0.06M的柠檬酸钠按体积比41：59混合获得；
所述R2试剂为干粉状态，使用时采用水复溶。
本实施例的检测方法以下步骤：
S1、预处理：
将尿液样本和样本处理液按比例加入到试管中，混合，然后将混合液加入到样本处理管中，离心分离，留取上清液待测；
S2、检测：
将步骤S1获得的上清液，以及R1试剂和R2试剂放置在仪器的对应位置，启动仪器直接测量，仪器采用BioSystems A400全自动特定蛋白分析仪。
实施例2：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于，各个组分的浓度不同，具体地：
所述样本处理液中pH7.8的缓冲液的浓度为0.1M，EDTA的浓度为9Mm，proclin300的质量分数为0.02％；
样本处理管中活性炭的重量为0.07g；
所述检测试剂盒包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.2M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.29mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.2mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为5.8的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.2M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为300U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为10000U/L；所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液有0.2M的柠檬酸和0.2M的柠檬酸钠按体积比47:153混合获得
实施例3：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于，各个组分的浓度不同，具体地：
所述样本处理液中pH6.5的缓冲液的浓度为0.1M，EDTA的浓度为3Mm，proclin300的质量分数为0.1％；
活性炭的重量为0.5g；
所述检测试剂盒包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.15M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.2mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.15mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为5的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.13M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为200U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为8000U/L；所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液有0.13M的柠檬酸和0.13M的柠檬酸钠按体积比41：59混合获得；
对比例1：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于，样本处理液的pH不同，具体为pH值为2。
对比例2：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于，样本处理管里面的活性炭重量不同，没有添加活性炭。
对比例3：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于，样本处理管里面的活性炭重量不同，具体为2g。
对比例4：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于，样本处理液的pH不同，具体PH值为10。
对实施例1-实施例3，对比例1-对比例4进行准确度、重复性、干扰性实验：
1、准确度数据，配置90mg/L的草酸盐溶液，检测其准确性，结果如表1所示：
表1
准确度
实施例1
实施例2
实施例3
对比例1
对比例2
对比例3
对比例4
1
90.34
89.44
92.15
13.55
81.31
78.60
17.16
2
89.76
88.86
90.32
8.90
78.09
78.09
24.24
3
87.67
86.79
89.70
11.22
78.03
76.27
22.79
4
91.23
91.73
87.77
4.56
82.11
79.37
12.77
5
90.61
89.29
92.15
9.90
81.55
78.83
9.97
6
88.66
88.52
91.56
15.65
79.79
77.13
16.85
7
89.93
89.03
89.42
15.45
80.94
78.24
9.89
8
87.54
86.66
87.63
12.34
78.79
76.16
13.13
9
86.78
85.91
89.87
13.02
78.10
75.50
16.49
10
89.97
88.52
89.07
14.54
80.07
78.27
10.80
平均值
89.25
88.48
89.96
11.91
79.88
77.65
15.41
相对偏差
-0.83％
-1.69％
-0.04％
-86.76％
-11.25％
-13.73％
-82.88％
SD
1.49
1.68
1.62
3.42
1.56
1.30
5.08
CV
1.67％
1.90％
1.80％
28.69％
1.95％
1.67％
32.97％
2、线性数据：
应用尿液标本，进行稀释，验证其试剂线性，实施例1-实施例3的线性数据分别如图1-图3所示。
由附图1-附图3可知：
本发明的测得草酸检测试剂盒线性范围为1.8-180mmol/L。
3、重复性数据：
浓度(80mg/L)的数据如表2所示：
表2
重复次数
实施例1
实施例2
实施例3
对比例1
对比例2
对比例3
对比例4
1
82.32
81.50
83.14
16.46
72.36
74.91
24.70
2
81.55
82.37
80.73
34.67
71.68
75.03
23.12
3
79.66
78.86
80.46
45.32
70.02
74.88
12.34
4
82.23
83.05
81.41
23.43
72.28
74.83
9.13
5
80.19
79.39
80.99
12.32
70.49
72.97
11.23
6
79.33
80.12
78.54
7.99
69.73
72.19
14.56
7
78.98
78.19
79.77
32.23
69.42
71.87
22.45
8
76.89
77.66
76.12
24.32
67.59
69.97
19.02
9
79.08
78.29
79.87
9.19
69.51
71.96
25.44
10
80.23
81.03
79.43
11.98
70.52
73.01
27.99
11
81.90
81.08
82.72
13.67
71.99
74.53
13.23
12
82.22
83.04
81.40
18.32
72.27
74.82
15.34
13
81.45
80.64
82.26
23.31
71.59
74.12
16.35
14
82.11
82.93
81.29
32.11
72.17
74.72
34.55
15
84.44
83.60
85.28
23.12
74.22
76.84
21.67
AVG
80.84
80.78
80.89
21.90
71.06
73.78
19.41
SD
1.88
1.98
2.13
10.66
1.65
1.74
7.10
CV
2.32％
2.45％
2.63％
48.66％
2.32％
2.36％
36.58％
浓度(10mg/L)的数据如表3所示：
表3
4、干扰性数据如表4所示：
表4
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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