具体实施方式

本发明提供了一种基于食物链营养级联效应评价PE微塑料生态危害的方法，包括以下步骤：

1)将PE微塑料、指数生长的小球藻藻液和大型溞置于同一体系中，形成二级营养系统，同时设置不含PE微塑料的对照二级营养系统；

2)将PE微塑料、指数生长的小球藻藻液、大型溞和豆娘幼虫置于同一体系中，形成三级营养系统，同时设置不含PE微塑料的对照三级营养系统；

3)在同一时期分别统计二级营养系统、三级营养系统、对照二级营养系统和对照三级营养系统中藻细胞密度；

4)将得到的二级营养系统和三级营养系统中藻细胞密度带入公式I中，计算营养级联效应，将对照二级营养系统和对照三级营养系统中藻细胞密度带入公式I中，计算对照营养级联效应；

营养级联效应＝ln(Np+/Np-) 公式I

式中，Np+表示三级营养系统或对照三级营养系统中藻细胞密度，单位为cells/mL；

Np-表示二级营养系统或对照二级营养系统中藻细胞密度，单位为cells/mL；

5)将步骤4)中所述营养级联效应与对照营养级联效应进行统计分析，当两者存在显著性差异时，判断PE微塑料对生态产生危害，反之则没有产生危害；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

本发明将PE微塑料、指数生长的小球藻藻液和大型溞置于同一体系中，形成二级营养系统，同时设置不含PE微塑料的对照二级营养系统；将PE微塑料、指数生长的小球藻藻液、大型溞和豆娘幼虫置于同一体系中，形成三级营养系统，同时设置不含PE微塑料的对照三级营养系统

在本发明中，所述PE微塑料优选包括含PE微塑料的水体。所述同一体系中培养液优选为combo培养基。本发明对所述combo培养基的配方没有特殊限制，采用本领域所熟知的combo培养基配方即可。在本发明实施例中，所述combo培养基的配方如下：

在本发明中，所述小球藻藻液中小球藻的初始密度优选为1×10⁴～5×10⁴cells/mL，更优选为1×10⁴～2×10⁴cells/mL。本发明对所述小球藻的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的小球藻即可。所述大型溞的密度优选为100只·L^-1。所述大型溞进行预处理；所述预处理的方法优选为在置于同一体系前，对大型溞预先饥饿处理4～5h，以保证大型溞对小球藻的觅食活力。所述豆娘幼虫的密度优选为1只·L^-1。不同体系中优选投放健康活跃、且体重无显著差异的豆娘幼虫。豆娘幼虫作为大型溞的捕食者，作为食物链顶端。

在本发明中，所述二级营养系统或三级营养系统中PE微塑料的终浓度优选为0.01～40mg/L，更优选为10～20mg/L。所述PE微塑料的终浓度远低于现有技术报道的PE微塑料的致死浓度(57.3mg·L^-1)。本发明探讨低浓度微塑料如何通过影响自然界广泛存在的物种关系，最终改变群落组成和结构，能够得出更加安全的环境响应浓度，为正确制定污染物排放标准提供了依据。

在本发明中，对照二级营养系统是指将含有指数生长的小球藻藻液和大型溞置于同一体系。对照三级营养系统是指将含有指数生长的小球藻藻液、大型溞和豆娘幼虫置于同一体系。

培养后，本发明在同一时期分别统计二级营养系统、三级营养系统、对照二级营养系统和对照三级营养系统中藻细胞密度。

在本发明中，所述藻细胞密度的统计方法优选如下：

在400倍的生物显微镜下，用浮游植物计数框统计单位体积中的总藻细胞密度；选取浮游生物计数框的一条对角线，总计10个小方格，使用细胞计数器依次记录每个小方格中的藻细胞数量，带入公式II中计算藻细胞密度；

藻类细胞密度＝X×10×10×Y 公式II

式中：X——对角线上10个方格中藻细胞总数量；

Y——藻液的稀释倍数；藻类细胞密度的单位为cells·mL^-1。

在本发明中，所述藻细胞密度的统计时间优选为置于同一体系后1～5h，更优选为2～4h，最优选为3h。置于同一体系后，所述二级营养系统以及三级营养系统中高级生物对低级生物进行捕食，例如豆娘幼虫对大型溞开始捕食，同时大型溞对小球藻进行捕食。

得到各系统的藻细胞密度数据后，本发明将得到的二级营养系统和三级营养系统中藻细胞密度带入公式I中，计算营养级联效应，将对照二级营养系统和对照三级营养系统中藻细胞密度带入公式I中，计算对照营养级联效应；

营养级联效应＝ln(Np+/Np-) 公式I

式中，Np+表示三级营养系统或对照三级营养系统中藻细胞密度，单位为cells/mL；

Np-表示二级营养系统或对照二级营养系统中藻细胞密度，单位为cells/mL。

得到营养级联效应，本发明将所述营养级联效应与对照营养级联效应进行统计分析，当两者存在显著性差异时，判断PE微塑料对生态产生危害，反之则没有产生危害。

在本发明中，通过设置只有小球藻和PE微塑料的体系，结果表明小球藻的密度不随PE微塑料的浓度变化而变化，而在二级营养系统中，小球藻密度随着PE浓度的增加而增加，但藻密度始终低于只有藻类的系统。这表明二级营养系统中因PE微塑料的存在，影响了大型溞对小球藻的采食。在三级营养系统中，藻密度始终高于不加豆娘幼虫的二级营养系统，且藻密度的变化趋势与二级营养系统相似，均随PE浓度的增加而增加，但在该系统中藻密度的增幅更为明显。这表明，营养级联效应受PE浓度的显著影响，且随PE浓度的增加而持续增加，因此以营养级联效应为判断指标评价PE微塑料的生态危害。

在本发明中，为了明确PE微塑料对大型溞行为、豆娘幼虫的行为以及大型溞的运动频率与豆娘幼虫的攻击频率之间的关系的影响，还进一步测定二级营养系统和三级营养系统中大型溞心跳和运动频率、三级营养系统中大型溞的存活率、观察豆娘幼虫的行为(对大型溞定向、攻击和捕获三种行为频率)以及分析大型溞的运动频率与豆娘幼虫的攻击频率的相关性。结果表明，PE微塑料的浓度与大型溞心跳和运动频率呈负相关，与大型溞的存活率呈负相关，而与豆娘幼虫的行为呈正相关。因此，本发明PE微塑料对生态产生危害的评价方法还优选包括以大型溞心跳和运动频率数据、豆娘幼虫的行为数据和/或大型溞的运动频率与豆娘幼虫的攻击频率的相关性为评价指标进行评价。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于食物链营养级联效应评价PE微塑料生态危害的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

2020年11月20日，在云南省昆明市云南大学内进行了具体实验，步骤如下：

(1)配制大型溞所用的combo培养基。

(2)选择合适实验对象：选择指数生长的小球藻用于实验，藻类初始密度均为5×10⁴cells·mL^-1，实验前随机挑选出龄期为24～48h、体型相近的幼溞作为实验材料，然后饥饿处理4h，以保证实验中食草动物的觅食活力，大型溞密度为100·L^-1，每个处理(1L体积的体系)中放入1只健康活跃、体长相近的豆娘幼虫。

(3)实验设计：

只有藻类的系统中，在实验1、3和5h取藻样，观察藻密度的变化情况。

藻-溞二级营养系统中，在实验1、3和5h取藻样，同时拍摄大型溞的心跳和运动视频，观察食草动物大型溞行为的变化。

藻-溞-豆娘幼虫三级营养系统中，实验1、3和5h取藻样，同时记录大型溞的存活数量、拍摄大型溞和豆娘幼虫的行为视频，实验结束时录制大型溞心跳视频。拍摄大型溞心跳和运动频率视频，观察并分析，其中拍摄大型溞的心跳频率视频时，从每个实验烧杯里随机选取5只大型溞，放入圆形浮游生物计数框中，然后在5倍的生物显微镜下通过图像软件拍摄大型溞的心跳过程，录制时长为1min。实验后期利用图像处理软件Potplayer在0.5倍速下观看视频，记录每只大型溞1min的心跳频率。观测大型溞运动频率时，在实验台上放置三脚架安置摄像机(FDR-AX30；Sony,Japan；spatial resolution，3840×2160pixels)，两台摄像机在距离烧杯投影平面20cm的地方垂直放置，在光照均匀的条件下同时记录大型溞在水平和垂直方向的行为。实验开始时机械振荡烧杯，让大型溞在实验环境中适应10min，当处理时间为1、3、5h时，以50frame·s^-1的帧率进行视频录制，录制时长为5min。录制完毕，实验后期利用图像处理软件Potplayer在0.5倍速下观看视频，在每个实验烧杯里随机选取5只大型溞，分别读取5min的跳跃频率(跳跃被定义为大型溞触角下的第二根天线向下推进并回到初始位置)。

(4)录制视频，一次进行以下数据分析：

①大型溞数据分析：心跳和运动频率分析

结果：心跳频率和运动频率都随着PE微塑料浓度的升高而降低，尤其是在暴露1小时后和整个实验期间，暴露于5、40和160mg·L^-1的PE微塑料1小时后，心跳率分别降低了5.88％、9.26％和11.18％；跳跃频率分别降低了4.02％、10.26和25.35％，实验数据如图1、图2所示。

②对于豆娘幼虫的行为分析：对于肉食性捕食者豆娘幼虫来说，在三级营养级系统中，其对大型溞定向、攻击和捕获三种行为频率的影响随实验中PE浓度的升高而增加。此外，在整个实验过程中，随着PE浓度增加，大型溞存活率显著降低，且存活率随实验时间增加也显著降低，结果如图3。

③分析大型溞的运动频率和捕食者豆娘幼虫的攻击频率：结果表示随着PE浓度升高大型溞的运动频率下降，豆娘幼虫行为频率增加，大型溞的存活率下降。

④藻类密度与营养级联强度对微塑料的响应分析：在400倍的生物显微镜(Olympus BX43 with a DP27 imaging system,Olympus,Tokyo,Japan)下利用浮游植物计数框统计单位体积中的总藻细胞密度。具体操作如下：选取浮游生物计数框的一条对角线，总计10个小方格，使用细胞计数器依次记录每个小方格中的藻细胞数量。记录所有原始数据后，通过以下公式II计算藻细胞密度：

1mL样液中藻类细胞密度(cells·mL^-1)＝X×10×10×Y 公式II

式中：X——对角线上10个方格中藻细胞总数量；

Y——藻液的稀释倍数。

在只有藻类的系统中，小球藻细胞密度不受PE浓度的影响，而在二级营养系统中，藻密度随着PE浓度的增加而增加，但藻密度始终低于只有藻类的系统。在三级营养系统中，藻密度始终高于不加豆娘幼虫的二级营养系统，且藻密度的变化趋势与二级营养系统相似，均随PE浓度的增加而增加，但在该系统中藻密度的增幅更为明显。以上的实验结果表明，营养级联效应受PE浓度和实验时间的显著影响，且随PE浓度和实验时间的增加而持续增加，如图4所示。

⑤微塑料对营养级联效应的影响因素分析：计算营养级联效应方法是对数比转换法估算捕食者对初级生产力的自上而下的级联效应的强度。

营养级联效应＝ln(Np+/Np-)公式I

式中：Np+——有豆娘幼虫，即藻-大型溞-豆娘幼虫体系中藻类密度(cells·mL^-1)；

Np-——无豆娘幼虫，即藻-大型溞体系中藻类密度(cells·mL^-1)。

结论：三级营养级体系中，微塑料对营养级联效应的影响与大型溞的存活率之间呈显著的负相关性。

由上述实施例可知，在整个实验的各个观测时间中豆娘幼虫的定向、攻击和捕获频率，均随着PE浓度的增加而增加。因此，随着PE浓度的增加，大型溞被捕食的风险增加，存活率显著下降。在这种情况下，随着PE浓度的增加，大型溞的密度和滤食效率降低，最终导致藻密度急剧增加，同时营养级联效应也随之增加。具体来说，20mg·L^-1的PE微塑料即可对生态系统功能产生显著影响，该浓度远低于采用急性毒性实验或者个体实验开展研究得出的安全剂量范围(57.3mg·L^-1)(Short-term exposure with high concentrations ofpristine microplastic particles leads to immobilisation of Daphnia magna，Saskia Rehse,Werner Kloas,Christiane Zarfl,2016)，充分说明了本发明方法的必要性和严谨性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。