具体实施方式

本申请的发明人已经发现，将非复制型质粒载体递送到宿主细胞中允许更好地控制所述质粒载体中所含的遗传物质的表达，从而使得在所述宿主细胞中对包括所述遗传物质表达的治疗方案的控制得到改进。因此，在一个方面，提供了一种重组益生菌乳酸菌，其中所述细菌包含非复制型质粒载体，所述非复制型质粒载体包含(a)肿瘤抑制基因或抗炎基因，其与引导所述肿瘤抑制基因或抗炎基因在哺乳动物细胞中表达的第一启动子可操作地连接；和(b)粘附素基因，其与引导所述粘附素基因在所述细菌中表达的第二启动子可操作地连接。

如本文所用的术语“重组细菌”指的是含有重组遗传物质，如一种或多种重组DNA分子的细菌。重组DNA分子通常是通过实验室遗传重组方法(如分子克隆)将来自多个来源的遗传物质汇集在一起形成的，从而产生原本不会在基因组中发现的序列。众所周知，大多数细菌的DNA包含在被称为细菌染色体的单个环状分子中。除了细菌染色体之外，细菌通常还含有质粒，所述质粒是与细菌染色体物理分离的小环状DNA分子，其可以独立复制。在一些实例中，所述重组细菌在质粒中含有一种或多种重组DNA分子。

如本文所用的术语“益生菌”指的是对宿主生物体发挥有益功能的非病原性和非产毒性微生物，特别是细菌。哺乳动物物种的胃肠道携带复杂的微生物生态系统，其含有大量不同种类的细菌。胃肠道中的常驻细菌群体对胃肠道功能具有重大影响，从而对宿主生物体的健康和福祉具有重大影响。在这些当中，一些细菌是机会性的或被认为是有害的并且会导致不良情况，如腹泻、感染、胃肠炎和内毒素血症，而一些细菌菌种被认为是“益生菌”，因为它们对宿主生物体发挥有益的功能。

如本文所用的术语“乳酸菌”或其语法上的变体指的是革兰氏阳性、低GC、耐酸性、一般不形成孢子、非呼吸性杆状(杆菌)或球形(球菌)细菌的一个目，其具有共同的代谢和生理特征。这些细菌通常存在于分解植物和奶制品中，产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。乳酸菌的实例包括乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、气球菌属(Aerococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)。

乳球菌属是乳酸菌的一个属。它们是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非运动性球菌，其单独、成对或成链地被发现。乳球菌属被称为同型发酵菌，这意味着它们产生单一产物，在这种情况下是乳酸，作为葡萄糖发酵的主要或唯一产物。目前识别出乳球菌属的十二种菌种：韩中乳球菌(L.chungangensis)、台湾桧木乳球菌(L.formosensis)、富士山乳球菌(L.fujiensis)、山羊乳酸乳球菌(Lactococcus hircilactis)、格氏乳球菌(L.garvieae)(格氏乳球菌格氏亚种(L.garvieae subsp.garvieae)、格氏乳球菌牛型亚种(L.garvieaesubsp.bovis))、乳酸乳球菌(L.lactis)(乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactissubsp.cremoris)、乳酸乳球菌霍氏亚种(L.lactis subsp.hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌鳟鱼亚种(L.lactis subsp.tructae))、洛迪乳球菌(L.laudensis)、鼻白蚁乳球菌(L.nasutitermitis)、鱼乳球菌(L.piscium)、植物乳球菌(L.plantarum)、棉子糖乳球菌(L.raffinolactis)和台湾乳球菌(L.taiwanensis)。

在一个具体实例中，所述重组益生菌乳酸菌属于乳酸乳球菌菌种。乳酸乳球菌是广泛用于生产酪乳和奶酪的革兰氏阳性细菌。乳酸乳球菌细胞是成对和短链群集的球菌，并且根据生长条件，呈卵形，具有0.5μm-1.5μm的典型长度。乳酸乳球菌不产生孢子(不形成孢子)并且不运动(非运动性)。乳酸乳球菌从糖产生乳酸。产生乳酸的能力是乳酸乳球菌成为乳制品行业中最重要的微生物之一的原因之一。基于乳酸乳球菌在食品发酵中的历史，乳酸乳球菌具有公认安全(GRAS)状态，很少有病例报告称其为机会性病原体。GRAS是美国食品和药物管理局(United States Food and Drug Administration，FDA)的指定，即添加到食品中的化学品或物质由专家认为是安全的，并且因此豁免通常的联邦食品、药物和化妆品法案(Federal Food,Drug,and Cosmetic Act，FFDCA)食品添加剂容许量要求。在一些实例中，如本文所公开的重组益生菌乳酸菌或重组产乳酸细菌或乳球菌属的细菌被分类为GRAS细菌。

如本文所用的术语“表达”或其语法上的变体指的是从DNA转录为至少部分地与基因的两条核酸链之一的区域互补的RNA核酸分子，继而从所述RNA核酸分子翻译，得到蛋白质或多肽或其部分。

如本文所用的术语“粘附素”指的是细菌的细胞表面组分或附属物，其促进粘附或附着到其它细胞或表面，通常是它们正在感染或生活在其中的宿主细胞。粘附是细菌致病或感染的必要步骤，是为定殖新宿主所必需的。在一些细菌中，粘附素还充当侵袭素，所述侵袭素是与细菌侵入宿主细胞中有关的一类蛋白质。侵袭素在细菌感染的初始阶段中起到促进进入的作用。在本发明的重组细菌中表达的粘附素的实例包括纤连蛋白结合蛋白和内化素。

纤连蛋白是在人体体液和多种人体组织和器官的细胞外基质中普遍存在的多结构域糖蛋白。在分泌后，纤连蛋白分子与跨膜整合素结合，促进二聚化和细胞骨架偶联。与整合素结合的纤连蛋白能够与ECM组分结合，如胶原蛋白和层粘连蛋白。人类纤连蛋白在细胞迁移、组织修复和粘附的调节中起主要作用。纤连蛋白也是胃肠道中细菌粘附素的共同靶标。已经在多种宿主相关细菌中鉴定出纤连蛋白结合蛋白(FnBP)。例如，对于金黄色葡萄球菌感染，纤连蛋白结合蛋白A(FnBPA)和FnBPB充当粘附素和/或侵袭素。

内化素是在单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)上存在的表面蛋白。它们以两种已知的形式存在，即InlA和InlB。细菌利用它们以分别通过钙粘蛋白跨膜蛋白和Met受体侵入哺乳动物细胞。在培养的细胞中，InlA是为促进李斯特菌进入人类上皮细胞中所必需的，而InlB是为李斯特菌在几种其它细胞类型中内化所必需的，包括肝细胞、成纤维细胞和上皮样细胞。如本文所用的术语“非复制型质粒载体”指的是在递送到哺乳动物宿主细胞中之后不能在哺乳动物宿主细胞中复制的质粒载体。本发明的发明人发现，使用非复制型质粒载体允许改进对涉及将质粒载体递送到哺乳动物宿主细胞中的治疗方案的控制。例如，在中断治疗后可以容易地控制或终止由于质粒载体的递送而引起的任何不良反应。这是因为感染了本发明的重组细菌的哺乳动物宿主细胞将无法将质粒载体传递给它们的子代细胞，因此任何不利影响将局限于已经受到感染的原代细胞，这将在受感染细胞的寿命结束时自然停止。使用非复制型质粒载体还允许随时间推移微调剂量(即质粒载体中所含的基因的表达)以实现最佳的临床功效，这可能因不同患者而异。非复制型质粒载体一般是使用细菌复制起点(ori)构建的，而没有可以促进在哺乳动物细胞中复制的其它因子，如EBV或SV40 ori和它们相应的抗原组分。因而，一种或多种所得的构建体能够在如本文所公开的重组细菌中复制，但是不能在哺乳动物宿主细胞中复制。

当已经向宿主生物体的胃肠道施用细菌时，在细菌中表达一种或多种粘附素允许所述细菌感染在宿主生物体的胃肠道中的其宿主细胞。由于益生菌乳酸菌是公认安全细菌，因此本发明的发明人假设，在宿主生物体的胃肠道中的细胞受所述细菌感染后，表达一种或多种粘附素的益生菌乳酸菌可以用于将遗传物质递送到宿主生物体的细胞中，特别是宿主生物体的胃肠道中的细胞。

优选的是，递送到宿主生物体的细胞中的遗传物质对宿主生物体有益。例如，当受细菌感染的宿主生物体的细胞是肿瘤细胞并且递送到所述细胞中的遗传物质编码肿瘤抑制蛋白时，则所述细菌可以用于治疗所述宿主生物体的肿瘤。在优选的实施方案中，递送到细胞中的遗传物质仅抑制肿瘤细胞的生长，但不抑制健康的非肿瘤细胞的生长。

如本文所用的术语“肿瘤抑制基因”或其语法上的变体指的是一种类型的基因，其产生有助于控制细胞生长的被称为肿瘤抑制蛋白的蛋白质。肿瘤抑制基因中的突变可能导致癌症。

如本文所用的术语“抗炎基因”或其语法上的变体指的是一种类型的基因，其产生有助于预防炎症或减轻炎症症状的蛋白质。

在一些实例中，所述肿瘤抑制基因或抗炎基因对胃肠道细胞具有肿瘤抑制或抗炎作用。肿瘤抑制基因的实例包括TP53、APC、CD95、PTEN、TRAIL、MDA7和PMAIP1。抗炎基因的实例包括IL10、IL11、IL13、IL1-ra和TGFb。在一些实例中，递送到宿主细胞中的抗炎基因可以诱导其它抗炎基因的表达，或抑制促炎基因的表达。促炎基因的实例包括IL1b、IL6、IL18和TNFα。

在一个具体实例中，递送到宿主生物体中的肿瘤抑制基因或抗炎基因是DUSP10基因。DUSP10是编码DUSP10(双特异性磷酸酶10)(也被称为MAP激酶磷酸酶5(MKP5))的蛋白质编码基因。DUSP10基因的示例性序列如SEQ ID NO:1所示，并且DUSP10蛋白的示例性序列如SEQ ID NO:10所示。

双特异性蛋白磷酸酶通过将磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸残基脱磷酸化来使它们的靶激酶失活。它们对与细胞增殖和分化有关的MAP激酶超家族的成员进行负调节。该双特异性磷酸酶家族的不同成员显示出不同的对MAP激酶的底物特异性、不同的组织分布和亚细胞定位以及不同的细胞外刺激诱导表达模式。

DUSP10靶向有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK，包括ERK 1/2)，所述有丝分裂原激活蛋白激酶在结肠直肠癌中高度表现的EGFR-KRAS-BRAF-MEK-ERK1/2通路的下游。该通路内导致ERK1/2活性增加的多个基因突变是结肠直肠癌的特征。由于DUSP10靶向下游效应子ERK1/2，因此它的治疗作用不太可能受到EGFR-KRAS-BRAF-MEK-ERK1/2通路的上游效应子中的突变的影响。此外，还可以控制受感染细胞的炎症状态/活性，这是因为DUSP10是MAKPs通路的负调节因子，该MAKPs通路是免疫应答发展的主要中间因子。

递送到宿主生物体的细胞中的遗传物质将引起所述遗传物质中一种或多种目标基因在宿主生物体的胃肠道的细胞内表达。这意味着在宿主生物体的胃肠道的细胞外/管腔隔室中的本发明的细菌中，一种或多种目标基因将优选地不表达或不显著表达。相反，所述细菌仅作为运载体，将遗传物质递送到宿主生物体的细胞中。优点在于诸如肿瘤抑制蛋白和/或抗炎蛋白的一种或多种基因产物将直接在其中要发挥肿瘤抑制和/或抗炎作用的细胞中表达。为了实现这一点，所递送的遗传物质中一种或多种目标基因应当受驱动所述一种或多种目标基因在真核细胞中表达的启动子调节，并且优选地受不驱动所述一种或多种目标基因在诸如细菌细胞的原核细胞中表达的启动子调节。如本文所用的术语“真核生物”或“真核”指的是属于系统发育域真核生物域(Eukarya)的生物体或由其衍生的细胞或组织，如动物(例如哺乳动物、昆虫、爬行动物和鸟类)、纤毛虫、植物(例如单子叶植物、双子叶植物和藻类)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫和原生生物。术语“原核生物”、“原核细胞”或“非真核生物体”指的是这样的生物体，包括但不限于古菌域(Archaea)和细菌域(Bacteria)的生物体。

在一些优选的实例中，宿主生物体，特别是哺乳动物生物体的细胞仅被所述重组细菌递送的遗传物质瞬时转染。因此，引导DUSP10基因表达的第一启动子可以是来自哺乳动物病毒的启动子。这样的启动子的实例包括(i)来自杆状病毒的多角体蛋白启动子(PH启动子)；(ii)来自巨细胞病毒的增强子和即刻早期启动子(CMV启动子)；(iii)来自猿猴空泡病毒40的早期启动子(SV40启动子)；(iv)来自HSV1的胸苷激酶启动子(TK启动子)；和(v)来自HIV的5'LTR启动子(LTR启动子)。这些示例性启动子的序列如表1中的SEQ ID NO:2-6所示。因此，在一些实例中，引导DUSP10基因在哺乳动物细胞中表达的第一启动子是PH启动子、CMV启动子、SV40启动子、TK启动子或LTR启动子。

表1：病毒启动子的示例性序列

将包含肿瘤抑制基因或抗炎基因的质粒载体插入益生菌乳酸菌中以便所述细菌将所述基因递送到所述细菌的宿主生物体的细胞中。为了表达肿瘤抑制基因或抗炎基因并且因此发挥其对细胞或宿主生物体的作用，将所述肿瘤抑制基因或抗炎基因与引导所述基因在宿主细胞，特别是哺乳动物细胞中表达的第一启动子可操作地连接。

如本文所用的术语“可操作地连接”或其语法上的变体意指目标基因、接头(如果有的话)和启动子连接为同一核酸分子的一部分，适当地定位和定向以从所述启动子启动目标基因的转录。在一些实例中，它意指肿瘤抑制基因或抗炎基因、第一启动子和任选的接头连接为质粒载体的一部分，适当地定位和定向以从第一启动子启动所述基因的转录。

如本文所用的术语“载体”指的是用作运载体以将外来遗传物质人工携带到另一细胞中的DNA分子，在所述细胞中它可以被复制和/或表达。不同的宿主细胞具有特征性和特定的用于蛋白质的翻译后加工和修饰的机制。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括复制起点、位于要表达的基因前面的启动子以及任何必要的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。

如本文所用的术语“质粒”指的是细胞内与染色体DNA物理分离并且可以独立复制的小DNA分子。它们最常作为细菌中的小环状双链DNA分子被发现。在自然界中，质粒通常携带可以有利于生物体存活(例如抗生素抗性)的基因。虽然染色体较大并且含有在正常条件下生存的所有必要遗传信息，但是质粒通常非常小并且仅含有在某些情况或特定条件下可能对生物体有用的附加基因。

外源性核酸编码序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在载体中可能另外需要提供外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将能够容易地确定这种需要并且提供必要的信号。公知的是，起始密码子必须与所期望的编码序列的阅读框同框(或同相)以确保整个插入序列的翻译。外源性翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，包括天然的和合成的。表达的效率可以通过包括适当的转录增强子元件或转录终止子来提高。在真核表达中，如果在原始克隆片段内不含适当的多聚腺苷酸化位点(例如5'-AATAAA-3')，也可以将其并入到转录单位中。通常，多聚腺苷酸添加位点位于蛋白质的终止位点下游约30个至2000个核苷酸处，位于转录终止之前的位置处。

重组细菌中的粘附素可以由包含粘附素基因或编码粘附素的基因的质粒载体表达，其中粘附素基因和编码粘附素的基因在本公开中可以互换使用。因此，在一些实例中，如本文所公开的重组细菌包含质粒载体，所述质粒载体包含粘附素基因，所述粘附素基因与引导所述粘附素基因在细菌中表达的第二启动子可操作地连接。在另一个实例中，如本文所公开的重组细菌包含质粒载体，所述质粒载体包含粘附素基因，所述粘附素基因与引导编码粘附素的基因在细菌中表达的第二启动子可操作地连接。纤连蛋白结合蛋白是粘附素的实例。纤连蛋白结合蛋白的非限制性实例包括纤连蛋白结合蛋白A(FnBPA)(SEQ IDNO:12)和纤连蛋白结合蛋白B(FnBPB)(SEQ ID NO:13)，其中FnBPA和FnBPB在它们与纤连蛋白的结合能力方面具有相似的功能。纤连蛋白结合蛋白A基因的示例性序列如SEQ ID NO:7所示，并且纤连蛋白结合蛋白B基因的示例性序列如SEQ ID NO:11所示。在一些优选的实例中，第二启动子不引导粘附素基因在宿主细胞，特别是哺乳动物宿主细胞中表达。例如，第二启动子可以是原核启动子。原核启动子通常在转录起始位点上游的-10和-35位置处包含两个短序列。在-10处的序列被称作Pribnow框或-10元件，并且通常由六个核苷酸TATAAT组成。Pribnow框对于在原核生物中启动转录至关重要。另一个在-35处的序列被称作-35元件，并且通常包含六个核苷酸TTGACA。在一个具体实例中，用于驱动粘附素基因表达的原核启动子是erm启动子。erm启动子的示例性序列如SEQ ID NO:8所示。在一些实例中，使用诱导型启动子。可以用于乳球菌的诱导型启动子的实例是乳酸链球菌肽启动子。乳酸链球菌肽启动子的示例性序列如SEQ ID NO:9所示。

包含肿瘤抑制基因或抗炎基因的质粒载体可以是与包含粘附素基因的质粒载体相同的质粒载体，前提条件是肿瘤抑制基因或抗炎基因和粘附素基因的表达由不同的启动子引导，以使得肿瘤抑制基因或抗炎基因将只有在宿主细胞受细菌感染后才在宿主细胞中表达，并且粘附素基因将在所述细菌中表达。优选的是，所述宿主细胞是哺乳动物生物体的细胞。因此，在一些实例中，所述重组细菌包含质粒载体，所述质粒载体包含：肿瘤抑制基因或抗炎基因，其与引导所述肿瘤抑制基因或抗炎基因在哺乳动物细胞中表达的第一启动子可操作地连接；和粘附素基因，其与引导所述粘附素基因在细菌中表达的第二启动子可操作地连接。在另一个实例中，所述重组细菌包含质粒载体，所述质粒载体包含：肿瘤抑制基因或抗炎基因，其与引导所述肿瘤抑制基因或抗炎基因在哺乳动物细胞中表达的第一启动子可操作地连接；和粘附素基因，其与引导编码粘附素的基因在细菌中表达的第二启动子可操作地连接。

包含肿瘤抑制基因或抗炎基因的质粒载体可以是与包含粘附素基因或编码粘附素的基因的质粒载体不同的质粒载体，前提条件是肿瘤抑制基因或抗炎基因和粘附素基因的表达由不同的启动子引导，以使得肿瘤抑制基因或抗炎基因将只有在宿主细胞受细菌感染后才在宿主细胞中表达，并且粘附素基因或编码粘附素的基因将在所述细菌中表达。优选的是，所述宿主细胞是哺乳动物生物体的细胞。因此，在一些实例中，所述重组细菌包含：第一质粒载体，所述第一质粒载体包含与引导肿瘤抑制基因或抗炎基因在哺乳动物细胞中表达的第一启动子可操作地连接的肿瘤抑制基因或抗炎基因；和第二质粒载体，所述第二质粒载体包含与引导粘附素基因在细菌中表达的第二启动子可操作地连接的粘附素基因。在另一个实例中，所述重组细菌包含：第一质粒载体，所述第一质粒载体包含与引导肿瘤抑制基因或抗炎基因在哺乳动物细胞中表达的第一启动子可操作地连接的肿瘤抑制基因或抗炎基因；和第二质粒载体，所述第二质粒载体包含与引导编码粘附素的基因在细菌中表达的第二启动子可操作地连接的编码粘附素的基因。

要指出的是，如所用的术语“第一”和“第二”并不表示或暗示启动子和/或质粒载体的相对位置或重要性。当质粒载体包含第一启动子和第二启动子这两者时，应当了解的是，第一启动子和第二启动子是不同的，以便这两个启动子分别引导粘附素基因或编码粘附素的基因和肿瘤抑制基因或抗炎基因的表达。类似地，当重组细菌包含第一质粒载体和第二质粒载体这两者时，应当了解的是，第一质粒载体和第二质粒载体是不同的，并且它们分别含有用于粘附素基因或编码粘附素的基因和肿瘤抑制基因或抗炎基因的表达盒。

本发明的重组细菌可以使用本领域已知的方法来构建，其一般包括构建一种或多种质粒载体；将一种或多种所得质粒载体转化到野生型益生菌乳酸菌中；鉴定和/或分离已经成功转化的细菌。

一种或多种质粒载体的构建可以通过修饰可以在益生菌乳酸菌中复制的市售载体骨架，特别是乳球菌载体骨架来进行。这样的载体骨架的实例包括pTRKH3-ermGFP(来自addgene公司的质粒编号27169)、pCD4、pHP003、pSRQ700、pSRQ800、pSRQ900、pK214、pAH90、pAH33、pAH82、pCIS3、pIL105、pWV01、pCI305、pCRL1127、pMN5、pBL1、pDR1-1B、pDR1-1、pS7b、pMRC01、pCRL291.1、pNZ4000、pBM02、pCL2.1、pWV02(在FEMS Microbiology Review(2006)30:243中综述)、pNZ8008、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150、pNZ9530和pSH71的衍生物。载体骨架将使用限制性内切酶进行消化以将载体骨架线性化并且产生用于DNA连接的位点。将一种或多种目标基因中的每一种(在这种情况下是粘附素基因和/或肿瘤抑制基因或抗炎基因)与线性化的载体骨架连接以形成待转化到细菌细胞中的一种或多种质粒载体。

可以使用本领域已知的方法将一种或多种质粒载体转化到细菌细胞中。这样的方法一般包括通过使细菌细胞暴露于在自然界中通常不会发生的条件下来使它们对DNA具有被动渗透性。常用的方法包括电穿孔法和热激法。在电穿孔法中，通常用10kV/cm-20kV/cm的电场将细菌细胞短暂电击，这被认为会在细胞膜中产生孔，一种或多种质粒载体可以通过这些孔进入。在电击后，细胞的膜修复机制会使这些孔迅速闭合。在热激法中，将细胞在低温条件下在含有二价阳离子的溶液中孵育，之后暴露于热脉冲(热激)。所述阳离子部分地破坏细胞膜，从而允许DNA进入宿主细胞。认为在低温条件下将细胞暴露于二价阳离子也可能改变或削弱细胞表面结构，从而使其对DNA更具渗透性。认为热脉冲会造成跨细胞膜的热失衡，迫使DNA通过细胞孔或受损的细胞壁进入细胞。

市售用于分子克隆的载体骨架通常含有一种或多种抗生素抗性基因。在已经进行转化步骤后，将所得的细菌放置在含有抗生素的培养板上以选择已经成功转化的细胞。由于未成功转化的细菌细胞不会获得抗生素抗性基因，因此只有那些已经成功转化的细菌细胞才能在板上存活并且形成菌落。每一个菌落含有一群相同的含有质粒的细菌。通常将选择几个菌落，并且将通过聚合酶链反应(PCR)测序和/或限制性消化，检查它们中的每一个以鉴定一个或多个含有一种或多种所期望的质粒载体的菌落。然后可以大量培养被鉴定为含有一种或多种所期望的质粒载体的细菌菌落。

本发明的重组细菌可以在体内或体外将外源性肿瘤抑制基因或抗炎基因递送到真核细胞中。该递送需要重组细菌被靶细胞接触和内化。内化可以通过一种或多种不同的机制发生。可以诱导重组细菌与靶细胞之间的接触在体内或体外发生。通常，该接触在体内发生。

由于肿瘤抑制基因或抗炎基因的表达水平增加可以抑制癌细胞增殖和/或减轻炎症，因此本发明的重组细菌可以用于治疗癌症和/或炎症。因此，在一个方面，提供了一种在受试者中治疗癌症或减轻炎症的方法，其中所述方法包括将药学有效量的本发明的重组益生菌乳酸菌施用到所述受试者的胃肠道中，并且其中所述癌症或炎症是胃肠道的癌症或炎症。

在一些实例中，提供了用于治疗的本发明的重组益生菌乳酸菌。在一些其它实例中，提供了用于在受试者中治疗癌症或减轻炎症的本发明的重组益生菌乳酸菌，其中所述癌症或炎症是胃肠道的癌症或炎症。在一些其它实例中，提供了本发明的重组益生菌乳酸菌用于制造用于在受试者中治疗癌症或减轻炎症的药物的用途，其中所述癌症或炎症是胃肠道的癌症或炎症。

在一些实例中，在受试者中治疗癌症或减轻炎症的方法还可以包括施用药学有效量的免疫检查点抑制剂。药学有效量的免疫检查点抑制剂的施用可以与本发明的重组细菌一起或分开施用。术语“免疫检查点抑制剂”指的是阻断或抑制检查点蛋白的一种类型的药物。检查点蛋白是免疫系统的调节因子，并且它们防止免疫应答过强，这有时会阻止免疫细胞杀死癌细胞。当这些检查点蛋白被阻断时，免疫细胞可以更有效地靶向和/或根除癌细胞。检查点蛋白可以由癌细胞或诸如B细胞或T细胞的免疫细胞产生。在一些实例中，免疫检查点抑制剂可以是但不限于程序性死亡配体1(PDL-1)、程序性死亡蛋白1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)的抑制剂。

在一些实例中，提供了用于治疗的本发明的重组益生菌乳酸菌和免疫检查点抑制剂。在一些其它实例中，提供了用于在受试者中治疗癌症或减轻炎症的本发明的重组益生菌乳酸菌和免疫检查点抑制剂，其中所述癌症或炎症是胃肠道的癌症或炎症。在一些其它实例中，提供了本发明的重组益生菌乳酸菌和免疫检查点抑制剂用于制造用于在受试者中治疗癌症或减轻炎症的药物的用途，其中所述癌症或炎症是胃肠道的癌症或炎症。

本申请的发明人还发现，已经用表达Fnb而没有任何肿瘤抑制基因的重组细菌处理的小鼠也显示出肿瘤负荷的降低。因此，在一个方面，提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，其中所述方法包括施用药学有效量的重组益生菌乳酸菌，其中所述细菌包含非复制型质粒载体，所述非复制型质粒载体包含与引导粘附素基因在细菌中表达的启动子可操作地连接的粘附素基因。在一个实例中，提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，其中所述方法包括施用药学有效量的重组益生菌乳酸菌，其中所述细菌包含非复制型质粒载体，所述非复制型质粒载体包含与引导编码粘附素的基因在细菌中表达的启动子可操作地连接的编码粘附素的基因。

术语“治疗”或其语法上的变体意指向患有不期望的病症或疾病(例如癌症)的受试者或系统施用组合物。向受试者施用组合物的效果可以是但不限于病症的特定症状的停止、病症的症状的减轻或预防、病症的严重程度的降低、病症的完全消融、特定事件或特征的发展或进展的稳定化或延迟，或特定事件或特征发生的可能性的最小化。

术语“减轻(reduce)”或“减轻(reduction)”或其语法上的变体指的是与参考的同一参数相比，指定参数的降低。例如，在“减轻炎症”的背景下，“减轻”指的是当与未治疗的炎症的严重程度相比时炎症的严重程度的降低。在一些实例中，与未治疗的炎症相比，炎症的严重程度降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。

如本文所用的术语“炎症”指的是身体的白细胞和其产生的物质保护身体防止受诸如细菌和病毒的外来生物体感染的过程。炎症的严重程度可以通过本领域已知的方法测量，如测量空腹胰岛素、血红蛋白A1C(HbA1c)、C-反应蛋白(CRP)、血清铁蛋白和血红细胞宽度(RDW)水平的血液检查。

如本文所用的术语“药学有效量”、“有效量”或“治疗有效量”意指足以治疗、抑制或减轻所治疗的疾病状态的一种或多种症状或以其它方式提供所期望的药理和/或生理作用的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，如受试者相关变量(例如年龄、免疫系统健康状况等)、疾病和所施用的治疗。药学有效量的作用可以相对于对照。这样的对照是本领域已知的，并且可以是例如在施用药物或药物组合之前或在不施用药物或药物组合的情况下受试者的状况，或在药物组合的情况下，所述组合的作用可以与仅施用一种药物的作用进行比较。鉴于本文所含的教导，药学有效量可通过本领域已知的手段来确定，而无需过度的实验。在一些实例中，细菌的量应当足以对受试者发挥肿瘤抑制作用，同时仍对受试者无毒。在一些其它实例中，细菌的量应当足以减轻受试者的炎症，同时仍对受试者无毒。如本文所用的术语“无毒”指的是已经减毒到足够的程度以使得向动物宿主施用减毒的生物体不会引起任何可检测或可测量的疾病的先前有毒的生物体。一般，这样的无毒可以通过LD50、定殖器官的数量或CFU的数量减少到1/10或1/100或1/1000或更低来显示。

药学有效量将取决于特定的受试者、细菌菌种、所涉及的癌症/炎症的类型和癌症/炎症的分期和/或严重程度。剂量和/或给药频率也将根据单个受试者的年龄、体重和响应而变化。一般，总日剂量范围是每天约10⁵至10¹¹CFU(菌落形成单位)的细菌，或每天约10⁸至5×10¹⁰CFU的细菌，或每天约2×10⁹CFU的细菌(粉末形式)，或每天9×10⁸至1×10¹⁰CFU的细菌(液体制剂)，以单次剂量或分次剂量施用。治疗过程的时间长度应当为至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少7周、至少10周、至少13周、至少15周、至少20周、至少6个月或至少1年。在一些情况下可能需要使用在这些范围之外的剂量，如对于本领域技术人员而言将显而易见的那样。在某些实例中，可以施用重组细菌一段时间直到症状得到控制或疾病已经部分或完全消退时为止。此外，应当指出的是，临床医生或治疗医师将知道如何以及何时结合单个患者的响应来中断、调整或终止作为药物的重组细菌的使用。

如本文所用的术语“CFU”指的是菌落形成单位，其是用于估计样品中活细菌或真菌细胞数量的单位。活的被定义为在受控条件下通过二分裂繁殖的能力。使用菌落形成单位进行计数需要培养微生物并且仅对活细胞进行计数，相比之下，显微镜检查对所有细胞(活的或死的)进行计数。在一些实例中，一个CFU含有约10⁵-10⁷个细胞。

根据受试者，对于癌症患者的治疗益处包括抑制或延缓癌症的生长和/或癌症扩散到身体其它部位(即转移)、减轻癌症的症状、提高患有癌症的受试者的存活概率、延长受试者的预期寿命、改善受试者的生活质量和/或降低在成功的治疗过程(例如手术、化疗或放疗)后复发的概率。本发明的细菌对癌症的发展和进展的影响可以通过本领域技术人员已知的任何方法来监测，包括但不限于：a)使用成像技术，如计算机断层扫描(CT)或超声波扫描图测量肿瘤尺寸和形态的变化；和b)测量癌症风险的生物标志物水平的变化。

如本文所用的术语“抑制”或其语法上的变体意指阻止或限制特定特征。应当了解的是，这通常是相对于某个标准或预期值，即它是相对的，但是并不总是需要参考该标准或相对值。例如，“抑制表达”意指相对于标准或对照，阻止、干扰或限制基因的表达或活性。“抑制活性”也可以意指相对于标准或对照，阻止或限制诸如蛋白质的基因产物的合成、表达或功能。

如本文所用的术语“胃肠道”(或简称为“GI道”)指的是动物，特别是哺乳动物的器官系统，其摄取食物，消化食物以提取和吸收能量和营养素，并且排出剩余的废物。胃肠道由口腔、食道、胃、小肠、大肠、盲肠、阑尾、直肠、肛门、肝脏和胆囊组成。

胃肠道癌症指的是影响胃肠道的任何部分的癌症。胃肠道癌症的实例包括食道癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆囊和胆道癌以及肛门癌。在一个具体实例中，癌症是结肠直肠癌。

结肠直肠癌是作为胃肠道的最后一部分的结肠和直肠(或大肠)的癌症。当食物进入结肠时，水分被吸收并且食物残渣被细菌转化为废物(粪便)。直肠是结肠的末端部分，其在粪便通过肛门排出之前储存粪便。在结肠和直肠的内壁上可能会形成息肉。这些是良性肿块，在超过50岁的人群中相当常见。然而，某些类型的息肉可能会发展成癌症。结肠直肠癌在早期阶段通常没有症状。以下体征可能表示结肠直肠癌：便血、排便习惯改变、腹痛或不适、贫血和腹部存在肿块。定期筛查可以及早检测出息肉或结肠直肠癌。以下测试通常单独或组合用于检测结肠直肠癌的早期阶段：粪便免疫化学测试(FIT)、结肠镜检查和可屈性乙状结肠镜检查。FIT是检测粪便中存在少量血液的初步测试。结肠镜检查包括在镇静状态下使用通过肛门引入的柔性光纤仪器检查结肠和直肠。除了具有诊断用途之外，结肠镜检查还可以用于治疗，如去除息肉、对癌性肿块进行活检以及对出血点进行止血。可屈性乙状结肠镜检查检查大肠下端的内壁。将短的柔性的发光管插入直肠中并且缓慢地引导到乙状结肠中。

待接受本发明的重组细菌施用的受试者可以是任何脊椎动物，优选地是哺乳动物，包括家养动物、运动动物和灵长类动物，包括人类。

本发明的重组细菌可以通过任何常规的施用途径施用到受试者的胃肠道，包括但不限于口服施用、通过胃饲管施用、通过十二指肠饲管施用和直肠施用。

在一些实例中，口服施用是优选的施用途径。本发明的重组细菌可以单独口服施用。所述重组细菌也可以制造成口服组合物。可以使用任何剂型为受试者提供有效剂量的口服组合物。剂型包括片剂、胶囊、分散体、悬浮液、溶液等。在一些实例中，适用于口服施用的组合物可以作为离散单元呈现，如胶囊、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的本发明的重组细菌；作为粉末或颗粒或作为于水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液中的溶液或悬浮液呈现。一般，通过将活性成分与液体载体或微细的固体载体或这两者均匀且紧密地混合，然后，如果需要的话，将产品成型为所期望的呈现形式来制备所述组合物。

口服组合物可以另外包括粘合剂(例如预胶凝化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；粘结剂或填充剂(例如乳糖、戊聚糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂或胶囊可以通过本领域公知的方法进行包衣。口服组合物还可以含有另外的成分，包括但不限于药学上可接受的载体或赋形剂、维生素、草药(包括传统中药产品)、草药提取物、矿物质、氨基酸、调味剂、着色剂和/或防腐剂。还可以将重组细菌添加到受试者将要食用的食物中。如相关领域技术人员所知，可以使用许多方法在细菌细胞保持存活的同时将本发明的重组细菌与食物混合。在一些实例中，在即将食用之前将包含细菌细胞的培养肉汤直接添加到食物中。也可以将细菌细胞的干粉复原并且在即将食用之前直接添加到食物中。优选地，本发明的重组细菌在诸如约0℃至4℃的温度的条件下制备和储存。如本文所用的术语“食物”泛指任何种类的材料(液体或固体)，其用于滋养动物以及用于维持包括人类在内的动物的正常或加速生长。许多类型的食物产品或饮料，诸如但不限于果汁、草药提取物、茶基饮料、乳制品、大豆制品和米制品可以用于形成包含本发明的重组细菌的营养组合物。

由于本发明的重组细菌是口服施用的，因此在施用细菌时健康专业人员的辅助一般不是必需的。

在某些受试者中，可能无法口服施用本发明的重组细菌。在这样的情况下，可以使用替代的施用途径，如通过胃饲管施用、通过十二指肠饲管施用和直肠施用。当使用这样的替代施用途径时，优选的是，本发明的重组细菌呈液体制剂的形式。

液体制剂可以采用溶液或悬浮液的形式，或它们可以作为在使用前用水或其它合适的媒介物复原的干燥产品呈现。用于复原干燥产品的液体的温度一般应当低于65℃。这样的液体制剂可以通过常规手段，使用药学上可接受的添加剂来制备，如助悬剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。本发明的重组细菌可以与其它类型的治疗方式结合或交替使用，诸如但不限于手术、化疗剂和放疗。

在优选实例中，所述重组细菌在施用到受试者的胃肠道时是活的。在一些其它实例中，在施用到受试者的胃肠道时，所述重组细菌是灭活的或死的。活重组细菌可以是减毒的或未减毒的。如本文所用的术语“减毒”和其语法上的变体指的是减弱或降低野生型生物体的毒力。因此，如本文所用的术语“未减毒”和其语法上的变体意指与野生型生物体相比，生物体的毒力没有减弱或降低。在一些实例中，当乳球菌属的细菌对它的宿主生物体无毒或无害时，不需要对所述细菌进行减毒。

本文说明性描述的发明可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和措辞已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和措辞时排除所示的和所述的特征或其部分的任何等同方案，但应当认识到的是，各种改动方案在要求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当了解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确地公开了本发明，但是本文所公开的其中所体现的发明的改动方案和变化方案可以由本领域技术人员所采取，并且这些改动方案和变化方案被认为落入本发明的范围内。

已经在本文中广泛地和一般性地描述了本发明。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明本发明，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。

其它实施方案在以下权利要求和非限制性实施例内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。

实验部分

以下实施例说明了可以用于实施本发明的方面的方法或可以制备的适合于实施本发明的某些实施方案的材料。

实施例1：高DUSP10表达与CRC患者中更好的总存活率相关

最近，越来越多的研究已经证实DUSP表达的失调与多种癌症有关，并且经常报道DUSP的功能改变与肿瘤中MAPK活性的改变有关。对来自Marisa L等(PLoS Med.2013.10,e1001453)和癌症基因组图谱(TCGA)(Nature 2012.487,330-337)的公开的CRC存活率数据集进行了详细分析以研究DUSP10水平与CRC患者存活率之间似乎合理的关系。如图2中所示，在来自Marisa L等的患者群组中患有具有高DUSP10表达的肿瘤的患者的无复发存活(RFS)概率趋向于略微更高(P＝0.1)(图2A，左图)。在针对ERK表达进行样品分层后，发现肿瘤中的高DUSP10与具有高ERK表达的患者的存活概率提高约20％相关(图2B，右图)。在TCGA群组中患者存活率的改善更为显著(图2B)。在进行或不进行ERK2分层的情况下，到60个月为止，具有高DUSP10表达的患者的存活率增加了约20％。总之，这些数据表明DUSP10表达对于在患者中控制肿瘤发展从而产生更好的存活率可能在功能上很重要。

实施例2：DUSP10在人类CRC细胞中的过表达抑制癌细胞的生长和转移

为了确认DUSP10的肿瘤抑制功能，产生了稳定过表达DUSP10的人类CRC细胞系Caco2和DLD1以用于作为肿瘤异种移植物植入免疫功能低下的小鼠体内。结果显示DUSP10过表达减少了体内肿瘤生长(图3)。这两种细胞系之间的关键区别在于在DLD1中存在KRAS突变(G13D)，而在Caco2中发现野生型KRAS。这表明无论KRAS状态如何，DUSP10的过表达可以有效抑制肿瘤细胞的生长。有趣的是，在携带Kras突变(G13D)的HCT116人类CRC细胞中DUSP10的过表达引起了肝脏转移减少(图4)。在本实验中，将过表达DUSP10或对照载体的HCT116细胞注射到免疫功能低下的NSGS小鼠的脾脏中以便在3周内发生转移。在注射了过表达DUSP10的HCT116细胞的小鼠的肝脏中，更小尺寸的宏观转移性病变减少到约1/2。KRAS是最常突变的基因之一，其导致对药物治疗的抗性以及随后增加的ERK1/2激活和细胞增殖。因此，上述发现证实了DUSP10过表达治疗用于KRAS野生型和突变型肿瘤的潜力以及减少转移性疾病进展的可能性。

实施例3：用于递送DUSP10表达质粒的表达纤连蛋白结合蛋白的乳酸乳球菌(乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10)的开发

通过修饰载体骨架pTRKH3-ermGFP(Addgene公司)来构建携带(1)金黄色葡萄球菌来源的纤连蛋白结合蛋白(Fnb)和(2)人类DUSP10的基因插入序列的DNA质粒(图5)。将所得的DNA质粒通过电穿孔转化到乳酸乳球菌(ATCC)中并且基于红霉素抗性进行选择。随后分离单个阳性克隆并且储存在20％无菌甘油中直到需要使用为止。对于所有后续的感染实验，实施了三种不同的对照，包括未处理组、感染了携带载体骨架的乳酸乳球菌(“乳酸乳球菌-载体”)的组以及感染了携带仅具有Fnb基因插入序列的载体骨架的乳酸乳球菌(乳酸乳球菌-Fnb)的组。

实施例4：在用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10处理后体外和体内肿瘤细胞生长减少

为了在体外确定乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10的功能，使用Caco2(人类CRC细胞系)以用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10或对照(MOI：1500)进行感染。如图6中所示，在感染后24小时，在感染了乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10的Caco2细胞中DUSP10的mRNA和蛋白质水平均增加。在功能上，与对照未感染的细胞相比，在每天用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10感染3天后检测到Caco2增殖减少20％(图6c)。更重要的是，在AOM/DSS诱发的CRC小鼠模型中，每天通过经口灌胃乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10(剂量＝1.5×10⁹CFU的细菌)处理7周成功地抑制了肠道肿瘤的发展(图7)。与未处理的小鼠和用乳酸乳球菌-载体处理的小鼠相比，接受乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10的小鼠的肿瘤负荷降低了约70％和约60％。有趣的是，接受乳酸乳球菌-Fnb的小鼠也显示出肿瘤负荷降低约41％，这需要进一步的研究(这可能是因为在乳酸乳球菌-Fnb处理后轻微诱导了DUSP10，参见图6b)。尽管如此，乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10将肿瘤抑制作用再进一步增强了约30％。此外，在用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10处理的小鼠中，总体肿瘤尺寸减小了约56％。还使用人类CRC细胞系移植模型确定了乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10的功效。在本先导实验中，在免疫功能低下小鼠的盲肠中移植并且建立了3×3mm²的人类Ls174T肿瘤异种移植物，持续2周，之后通过经口灌胃用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10处理。如图8中所示，在用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10处理2周的小鼠中移植的Ls174T异种移植物的尺寸更小。这些体内结果证实了乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10治疗很有前景，具有与当前的CRC治疗相结合的潜力，并且应当开发用于临床应用。

实施例5：在用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10处理后体内结肠炎症减轻

向小鼠给予2％DSS(硫酸葡聚糖钠)以诱发结肠炎症，之后开始乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10处理。向小鼠施用不同的处理(具有载体的乳酸乳球菌对照；乳酸乳球菌-Fnb和乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10)。如图9中所示，与对照组相比，用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10处理显著地减轻了结肠炎症。

实施例6：在用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10和抗PDL-1进行组合处理后体外和体内的肿瘤细胞生长减少

为了确定乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10是否可以与免疫检查点抑制剂组合用于治疗癌症，用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10和抗PDL-1的组合处理小鼠。通过腹膜内注射向10周大的小鼠给予单次剂量10mg/kg的氧化偶氮甲烷(AOM)(美国密苏里州的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,MO,USA))以诱发结肠肿瘤。使小鼠休息1周，之后对它们进行3个周期的1％DSS施用，持续5天，休息2周。在AOM注射后16周之后，小鼠开始接受乳酸乳球菌和/或抗PDL-1的每天处理(具有载体的乳酸乳球菌对照；乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10、抗PDL-1、抗PDL-1+乳酸乳球菌-载体以及抗PDL-1+乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10)，持续4周，之后将小鼠处死并且确定肿瘤负荷。与未处理的小鼠和用乳酸乳球菌-载体处理的小鼠相比，接受抗PDL-1和抗PDL-1+乳酸乳球菌-载体的小鼠的肿瘤负荷降低了约68％和约70％。用乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10处理的小鼠的肿瘤负荷降低了约83％。有趣的是，接受抗PDL-1+乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10的小鼠显示出最大的效果，其中肿瘤负荷降低了约90％(图10b)。这证实了当与免疫检查点抑制剂组合使用时，乳酸乳球菌-Fnb-DUSP10的抗肿瘤作用可以进一步增强。

SEQ ID的描述

下表2详述了本文提到的SEQ ID NO和表1中未提到的它们的相应序列。还提供了所述序列的简要描述。

序列表

<110> 新加坡国立大学

<120> 重组细菌和其用途

<130> 10104SG1252

<150> SG 10201901828T

<151> 2019-02-28

<160> 13

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DUSP10

<400> 1

atgcctccgt ctcctttaga cgacagggta gtagtggcac tatctaggcc cgtccgacct 60

caggatctca acctttgttt agactctagt taccttggct ctgccaaccc aggcagtaac 120

agccaccctc ctgtcatcgc caccaccgtt gtgtccctca aggctgcgaa tctgacgtat 180

atgccctcat ccagcggctc tgcccgctcg ctgaattgtg gatgcagcag tgccagctgc 240

tgcactgtgg caacctacga caaggacaat caggcccaaa cccaagccat tgccgctggc 300

accaccacca ctgccatcgg aacctctacc acctgccctg ctaaccagat ggtcaacaat 360

aatgagaata caggctctct aagtccatca agtggggtgg gcagccctgt gtcagggacc 420

cccaagcagc tagccagcat caaaataatc taccccaatg acttggcaaa gaagatgacc 480

aaatgcagca agagtcacct gccgagtcag ggccctgtca tcattgactg caggcccttc 540

atggagtaca acaagagtca catccaagga gctgtccaca ttaactgtgc cgataagatc 600

agccggcgga gactgcagca gggcaagatc actgtcctag acttgatttc ctgtagggaa 660

ggcaaggact ctttcaagag gatcttttcc aaagaaatta tagtttatga tgagaatacc 720

aatgaaccaa gccgagtgat gccctcccag ccacttcaca tagtcctcga gtccctgaag 780

agagaaggca aagaacctct ggtgttgaaa ggtggactta gtagttttaa gcagaaccat 840

gaaaacctct gtgacaactc cctccagctc caagagtgcc gggaggtggg gggcggcgca 900

tccgcggcct cgagcttgct acctcagccc atccccacca cccctgacat cgagaacgct 960

gagctcaccc ccatcttgcc cttcctgttc cttggcaatg agcaggatgc tcaggacctg 1020

gacaccatgc agcggctgaa catcggctac gtcatcaacg tcaccactca tcttcccctc 1080

taccactatg agaaaggcct gttcaactac aagcggctgc cagccactga cagcaacaag 1140

cagaacctgc ggcagtactt tgaagaggct tttgagttca ttgaggaagc tcaccagtgt 1200

gggaaggggc ttctcatcca ctgccaggct ggggtgtccc gctccgccac catcgtcatc 1260

gcttacttga tgaagcacac tcggatgacc atgactgatg cttataaatt tgtcaaaggc 1320

aaacgaccaa ttatctcccc aaaccttaac ttcatggggc agttgctaga gttcgaggaa 1380

gacctaaaca acggtgtgac accgagaatc cttacaccaa agctgatggg cgtggagacg 1440

gttgtgtga 1449

<210> 2

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PH启动子

<400> 2

atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 60

gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca 120

tcgggcgcg 129

<210> 3

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CMV启动子

<400> 3

tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60

cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120

atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360

cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420

ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480

aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540

gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576

<210> 4

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40启动子

<400> 4

ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 60

atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 120

gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta 180

actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 240

ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag 300

tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctc 345

<210> 5

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TK启动子

<400> 5

aaatgagtct tcggacctcg cgggggccgc ttaagcggtg gttagggttt gtctgacgcg 60

gggggagggg gaaggaacga aacactctca ttcggaggcg gctcggggtt tggtcttggt 120

ggccacgggc acgcagaaga gcgccgcgat cctcttaagc acccccccgc cctccgtgga 180

ggcgggggtt tggtcggcgg gtggtaactg gcgggccgct gactcgggcg ggtcgcgcgc 240

cccagagtgt gaccttttcg gtctgctcgc agacccccgg gcggcgccgc cgcggcggcg 300

acgggctcgc tgggtcctag gctccatggg gaccgtatac gtggacaggc tctggagcat 360

ccgcacgact gcggtgatat taccggagac cttctgcggg acgagccggg tcacgcggct 420

gacgcggagc gtccgttggg cgacaaacac caggacgggg cacaggtaca ctatcttgtc 480

acccggaggc gcgagggact gcaggagctt cagggagtgg cgcagctgct tcatccccgt 540

ggcccgttgc tcgcgtttgc tggcggtgtc cccggaagaa atatatttgc atgtctttag 600

ttctatgatg acacaaaccc cgcccagcgt cttgtcattg gcgaattcga acacgcagat 660

gcagtcgggg cggcgcggtc ccaggtccac ttcgcatatt aaggtgacgc gtgtggcctc 720

gaacaccgag cgaccctgca gcgacccgct taa 753

<210> 6

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LTR启动子

<400> 6

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca 180

acaaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatggaatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gacatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agc 633

<210> 7

<211> 3280

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白结合蛋白A

<400> 7

gcatttaaag ggagatatta tagtgaaaaa caatcttagg tacggcatta gaaaacataa 60

attgggagca gcatcagtat tcttaggaac aatgatcgtt gttgggatgg gacaagataa 120

agaagctgca gcatcagaac aaaagacaac tacagtagaa gaaaatggga attcagctac 180

tgataataaa gtaaacgaaa cacaaacaac tacaactaac gttaatacta tagatgaaac 240

acaatcatac agcgcaacag caacagaaca accgtcaaac gcaacacaag taacaactga 300

aaaagcacca aaagcagtac aagcaccaca aactgcacaa ccagcaaatg tagaaacagt 360

taaagaagag gtagttaagg aagaagcgaa ccctcaagtt aaggaaacga cacaatctca 420

agacaatagc ggagatcaaa gacaagtaga tttaacacct aaaaaggcta cacaaaatca 480

agcagcagaa acacaagttg aagtggcaca gccaagaacg gtatcagaaa gtaaaccacg 540

tgtgacaaga tcagcagatg tagcggaagc taaggaagct agtgacgcga aagtggaaac 600

gggtacagat gtgacaagta aagttacagt ggaaagtggt tctattgagg cacctcaagg 660

aaataaagta gagccacatg ctggtcaacg tgtcgtactg aaatacaaat tgaaattcga 720

aaagggttta cacaaaggag attattttga tttcaccttg tctaataatg taaatactta 780

tggagtttca acagctagaa aagtaccaga aatcaaaaat ggttcagtcg taatggcgac 840

aggtcaactt cttggaaatg ggaaaattag gtatacattt acagactata ttgattataa 900

agtaaatgtg actgctgatt tagaaatcaa tttatttatt gatcctaaaa ctgtacaaag 960

caatggacaa caaacaataa cttcaacgtt gaatgataag gaaacaaaaa acacattgcc 1020

aatagaatat aatccaggag taagtaatag ctatgctaat gtaaatggat ctattgaaac 1080

ttttgataaa gggaacaata aattcactca tgtagcttac ataaaaccac aaaatgggca 1140

taaatcagat agcgtttcaa ttactggtac actaactcaa ggtagcaaag ctaatggaaa 1200

tgttccaact gtaaaagtat atgaagtctt aaaggatgct aaagaattac cagaaagtgt 1260

atatgcaaac atatcagact ctacaatgtt taaagatgta actcaggaaa tgaaagataa 1320

attaaaagta gaaaataatg ggagttataa attagacatt gagaaattag aaaaaagtta 1380

tgttatacac tatgatggtg aatacttaag tggttcagat caagtgaatt ttagaacgca 1440

tatgtttgga tatccagaac agcagtataa gtactactat actcatttgg gataccaact 1500

tacatgggat aatggattag ttttatatag taacaaagca aaaggtgatg gaacgaatgg 1560

aacaataaca gaatcgaata atatgacatt tgatgaagaa tatggaactg gagttattac 1620

aggtcaatat gataagaatt tagtaactac tgttgaagaa gaatatgatt cttcaactct 1680

tgacattgat taccacacag ctatagatgg tgaaggtggt tatgttgatg gatacattga 1740

aacaatagaa gaaacggatt catcagctat tgatatcgat taccatactg ctgtggatag 1800

cgaagcgggt cacgttggag gatacactga gtcctctgag gaatcaaatc caattgactt 1860

tgaagaatct acgcatgaaa attcaaaaca tcacgctgat gttgttgaat atgaagagga 1920

tacaaaccca ggtggtggtc aggttactac tgagtctaac ttagttgaat ttgacgaaga 1980

gtctacaaaa ggtattgtaa ctggcgcagt gagcgaccat acaacaattg aagatacgaa 2040

agaatataca actgaaagta atctgattga actagtagat gaactacctg aagaacatgg 2100

tcaagcacaa ggaccaatcg aggaaattac tgaaaacaat catcatattt ctcattctgg 2160

tttaggaact gaaaatggtc acggtaatta tggtgtgatt gaagaaatcg aagaaaatag 2220

ccatgttgat attaagagtg aattaggtta tgaaggtggc caaaatagcg gtaaccagtc 2280

attcgaggaa gacacagaag aagataaacc taaatatgaa caaggtggca atatcgtaga 2340

tatcgatttc gatagtgtac ctcaaattca tggtcaaaat aaaggtgatc agtcattcga 2400

agaagataca gagaaagaca aacctaagta tgaacaaggt ggtaatatca ttgatatcga 2460

cttcgacagt gtgccacaaa ttcatggatt caataagcat aatgaaatta ttgaagaaga 2520

tacaaacaaa gataaaccaa attatcaatt cggtggacac aacattgttg attttgaaga 2580

agatacactt ccgaaagtaa gcggtcaaaa tgaaggtcaa caaacgattg aagaagatac 2640

aacgccgcca acgccaccga caccagaagt accgagtgag ccggaaacac caacaccacc 2700

gacgccggaa gtaccgagtg agccagaaac accaacgcca ccgacaccag aagtaccaag 2760

tgagccggaa acaccaacac cgccaacacc agaggtacca agtgagccgg aaacaccaac 2820

accgccaaca ccagaggtac cagttgaacc tggtaaacca gtaccacctg ctaaagaaga 2880

acctaaaaaa ccttctaaac cagtggaaca aggtaaagta gtaacacctg ttattgaaat 2940

caatgaaaag gttaaagcag tggcaccaac taaacaaaaa caatctaaga aatctgaact 3000

acctgaaaca ggtggagaag aatcaacaaa caaaggtatg ttgttcggcg gattattcag 3060

cattctaggt ttagcgttat tacgtagaaa taaaaagaat aacaaagcat aattaacaaa 3120

aattgacggg tttatttcat aaattacatg aagtaagcct gtttttttta tattaaatca 3180

aatttttaat agaaaattag agtgttttct gattgcttca ttggtttatg tctgatgatt 3240

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<210> 8

<211> 559

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> erm启动子

<400> 8

cggtatcgat aagcttagtc tagaatcgat acgattttga agtggcaaca gataaaaaaa 60

agcagtttaa aattgttgct gaacttttaa aacaagcaaa tacaatcatt gtcgcaacag 120

atagcgacag agaaggcgaa aacattgcct ggtcgatcat tcataaagca aatgcctttt 180

ctaaagataa aacgtataaa agactatgga tcaatagttt agaaaaagat gtgatccgta 240

gcggttttca aaatttgcaa ccaggaatga attactatcc cttttatcaa gaagcgcaca 300

aaaagaaaaa cgaaatgata caccaatcag tgcaaaaaaa gatataatgg gagataagac 360

ggttcgtgtt cgtgctgact tgcaccatat cataaaaatc gaaacagcaa agaatggcgg 420

aaacgtaaaa gaagttatgg aaataagact tagaagcaaa cttaagagtg tgttgatagt 480

gcagtatctt aaaattttgt ataataggaa ttgaagttaa attagatgct aaaaatttgt 540

aattaagaag gagtgaatt 559

<210> 9

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 乳酸链球菌肽启动子

<400> 9

ctcctgtttt acaaccgggt gtacatagcg aaatacttgt aatgcgtggt gatgcacctg 60

aatctttctt cgaaacagat accaaatcca agctaaaatc ttttgtactc attttgagtg 120

cctccttata atttattttg tagttccttc gaacgaaatc attgtatcta acaaacttca 180

gaatttaatc agagccgttt attatgctcg cgttatcgac aataatatta ttaccaatac 240

tttctcaaga tagaattaag actgttttag atttgttaat gtttctattg tcagtatagt 300

tataagact 309

<210> 10

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DUSP10

<400> 10

Met Pro Pro Ser Pro Leu Asp Asp Arg Val Val Val Ala Leu Ser Arg

1 5 10 15

Pro Val Arg Pro Gln Asp Leu Asn Leu Cys Leu Asp Ser Ser Tyr Leu

20 25 30

Gly Ser Ala Asn Pro Gly Ser Asn Ser His Pro Pro Val Ile Ala Thr

35 40 45

Thr Val Val Ser Leu Lys Ala Ala Asn Leu Thr Tyr Met Pro Ser Ser

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Arg Ser Leu Asn Cys Gly Cys Ser Ser Ala Ser Cys

65 70 75 80

Cys Thr Val Ala Thr Tyr Asp Lys Asp Asn Gln Ala Gln Thr Gln Ala

85 90 95

Ile Ala Ala Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ile Gly Thr Ser Thr Thr Cys

100 105 110

Pro Ala Asn Gln Met Val Asn Asn Asn Glu Asn Thr Gly Ser Leu Ser

115 120 125

Pro Ser Ser Gly Val Gly Ser Pro Val Ser Gly Thr Pro Lys Gln Leu

130 135 140

Ala Ser Ile Lys Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Leu Ala Lys Lys Met Thr

145 150 155 160

Lys Cys Ser Lys Ser His Leu Pro Ser Gln Gly Pro Val Ile Ile Asp

165 170 175

Cys Arg Pro Phe Met Glu Tyr Asn Lys Ser His Ile Gln Gly Ala Val

180 185 190

His Ile Asn Cys Ala Asp Lys Ile Ser Arg Arg Arg Leu Gln Gln Gly

195 200 205

Lys Ile Thr Val Leu Asp Leu Ile Ser Cys Arg Glu Gly Lys Asp Ser

210 215 220

Phe Lys Arg Ile Phe Ser Lys Glu Ile Ile Val Tyr Asp Glu Asn Thr

225 230 235 240

Asn Glu Pro Ser Arg Val Met Pro Ser Gln Pro Leu His Ile Val Leu

245 250 255

Glu Ser Leu Lys Arg Glu Gly Lys Glu Pro Leu Val Leu Lys Gly Gly

260 265 270

Leu Ser Ser Phe Lys Gln Asn His Glu Asn Leu Cys Asp Asn Ser Leu

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Gln Leu Gln Glu Cys Arg Glu Val Gly Gly Gly Ala Ser Ala Ala Ser

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Ser Leu Leu Pro Gln Pro Ile Pro Thr Thr Pro Asp Ile Glu Asn Ala

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Glu Leu Thr Pro Ile Leu Pro Phe Leu Phe Leu Gly Asn Glu Gln Asp

325 330 335

Ala Gln Asp Leu Asp Thr Met Gln Arg Leu Asn Ile Gly Tyr Val Ile

340 345 350

Asn Val Thr Thr His Leu Pro Leu Tyr His Tyr Glu Lys Gly Leu Phe

355 360 365

Asn Tyr Lys Arg Leu Pro Ala Thr Asp Ser Asn Lys Gln Asn Leu Arg

370 375 380

Gln Tyr Phe Glu Glu Ala Phe Glu Phe Ile Glu Glu Ala His Gln Cys

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Gly Lys Gly Leu Leu Ile His Cys Gln Ala Gly Val Ser Arg Ser Ala

405 410 415

Thr Ile Val Ile Ala Tyr Leu Met Lys His Thr Arg Met Thr Met Thr

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Asp Ala Tyr Lys Phe Val Lys Gly Lys Arg Pro Ile Ile Ser Pro Asn

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Leu Asn Phe Met Gly Gln Leu Leu Glu Phe Glu Glu Asp Leu Asn Asn

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Gly Val Thr Pro Arg Ile Leu Thr Pro Lys Leu Met Gly Val Glu Thr

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Val Val

<210> 11

<211> 2823

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白结合蛋白B

<400> 11

gtgaaaagca atcttagata cggcataaga aaacacaaat tgggagcggc ctcagtattc 60

ttaggaacaa tgatcgttgt tggaatggga caagaaaaag aagctgcagc atcggaacaa 120

aacaatacta cagtagagga aagtgggagt tcagctactg aaagtaaagc aagcgaaaca 180

caaacaacta caaataacgt taatacaata gatgaaacac aatcatacag cgcgacatca 240

actgagcaac catcacaatc aacacaagta acaacagaag aagcaccgaa aactgtgcaa 300

gcaccaaaag tagaaacttc gcgagttgat ttgccatcgg aaaaagttgc tgataaggaa 360

actacaggaa ctcaagttga catagctcaa ccaagtaacg tctcagaaat taaaccaaga 420

atgaaaagat caactgacgt tacagcagtt gcagagaaag aagtagtgga agaaactaaa 480

gcgacaggta cagatgtaac aaataaagtg gaagtagaag aaggtagtga aattgtagga 540

cataaacaag atacgaatgt tgtaaatcct cataacgcag aaagagtaac cttgaaatat 600

aaatggaaat ttggagaagg aattaaggcg ggagattatt ttgatttcac attaagcgat 660

aatgttgaaa ctcatggtat ctcaacactg cgtaaagttc cggagataaa aagtacagat 720

ggtcaagtta tggcgacagg agaaataatt ggagaaagaa aagttagata tacgtttaaa 780

gaatatgtac aagaaaagaa agatttaact gctgaattat ctttaaatct atttattgat 840

cctacaacag tgacgcaaaa aggtaaccaa aatgttgaag ttaaattggg tgagactacg 900

gttagcaaaa tatttaatat tcaatattta ggtggagtta gagataattg gggagtaaca 960

gctaatggtc gaattgatac tttaaataaa gtagatggga aatttagtca ttttgcgtac 1020

atgaaaccta acaaccagtc gttaagctct gtgacagtaa ctggtcaagt aactaaagga 1080

aataaaccag gggttaataa tccaacagtt aaggtatata aacacattgg ttcagacgat 1140

ttagctgaaa gcgtatatgc aaagcttgat gatgtcagca aatttgaaga tgtgactgat 1200

aatatgagtt tagattttga tactaatggt ggttattctt taaactttaa taatttagac 1260

caaagtaaaa attatgtaat aaaatatgaa gggtattatg attcaaatgc tagcaactta 1320

gaatttcaaa cacacctttt tggatattat aactattatt atacaagtaa tttaacttgg 1380

aaaaatggcg ttgcatttta ctctaataac gctcaaggcg acggcaaaga taaactaaag 1440

gaacctatta tagaacatag tactcctatc gaacttgaat ttaaatcaga gccgccagtg 1500

gagaagcatg aattgactgg tacaatcgaa gaaagtaatg attctaagcc aattgatttt 1560

gaatatcata cagctgttga aggtgcagaa ggtcatgcag aaggtaccat tgaaactgaa 1620

gaagattcta ttcatgtaga ctttgaagaa tcgacacatg aaaattcaaa acatcatgct 1680

gatgttgttg aatatgaaga agatacaaac ccaggtggtg gtcaggttac tactgagtct 1740

aacctagttg aatttgacga agattctaca aaaggtattg taactggtgc tgttagcgat 1800

catacaacaa ttgaagatac gaaagaatat acgactgaaa gtaatctgat tgaactagta 1860

gatgaactac ctgaagaaca tggtcaagcg caaggaccaa tcgaggaaat tactgaaaac 1920

aatcatcata tttctcattc tggtttagga actgaaaatg gtcacggtaa ttatggcgtg 1980

attgaagaaa tcgaagaaaa tagccacgtg gatattaaga gtgaattagg ttacgaaggt 2040

ggccaaaata gcggtaatca gtcatttgag gaagacacag aagaagataa accgaaatat 2100

gaacaaggtg gcaatatcgt agatatcgat ttcgatagtg tacctcaaat tcatggtcaa 2160

aataatggta accaatcatt cgaagaagat acagagaaag acaaacctaa gtatgaacaa 2220

ggtggtaata tcattgatat cgacttcgac agtgtgccac atattcacgg attcaataag 2280

cacactgaaa ttattgaaga agatacaaat aaagataaac caaattatca attcggtgga 2340

cacaatagtg ttgactttga agaagataca cttccacaag taagtggtca taatgaaggt 2400

caacaaacga ttgaagaaga tacaacacct ccaatcgtgc caccaacgcc accgacacca 2460

gaagtaccaa gcgagccgga aacaccaaca ccaccgacac cagaagtacc aagcgagccg 2520

gaaacaccaa caccgccaac gccagaggta ccaactgaac ctggtaaacc aataccacct 2580

gctaaagaag aacctaaaaa accttctaaa ccagtggaac aaggtaaagt agtaacacct 2640

gttattgaaa tcaatgaaaa ggttaaagca gtggtaccaa ctaaaaaagc acaatctaag 2700

aaatctgaac tacctgaaac aggtggagaa gaatcaacaa acaacggcat gttgttcggc 2760

ggattattta gcattttagg tttagcgtta ttacgcagaa ataaaaagaa tcacaaagca 2820

taa 2823

<210> 12

<211> 1029

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白结合蛋白A

<400> 12

Met Lys Asn Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala

1 5 10 15

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Thr Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys Val Thr Val Glu Ser Gly Ser Ile

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Val Leu Lys Tyr Lys Leu Lys Phe Glu Lys Gly Leu His Lys Gly Asp

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Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asn Asn Val Asn Thr Tyr Gly Val Ser

245 250 255

Thr Ala Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Asn Gly Ser Val Val Met Ala

260 265 270

Thr Gly Gln Leu Leu Gly Asn Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Phe Thr Asp

275 280 285

Tyr Ile Asp Tyr Lys Val Asn Val Thr Ala Asp Leu Glu Ile Asn Leu

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Phe Ile Asp Pro Lys Thr Val Gln Ser Asn Gly Gln Gln Thr Ile Thr

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Ser Thr Leu Asn Asp Lys Glu Thr Lys Asn Thr Leu Pro Ile Glu Tyr

325 330 335

Asn Pro Gly Val Ser Asn Ser Tyr Ala Asn Val Asn Gly Ser Ile Glu

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Thr Phe Asp Lys Gly Asn Asn Lys Phe Thr His Val Ala Tyr Ile Lys

355 360 365

Pro Gln Asn Gly His Lys Ser Asp Ser Val Ser Ile Thr Gly Thr Leu

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Thr Gln Gly Ser Lys Ala Asn Gly Asn Val Pro Thr Val Lys Val Tyr

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Glu Val Leu Lys Asp Ala Lys Glu Leu Pro Glu Ser Val Tyr Ala Asn

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Ile Ser Asp Ser Thr Met Phe Lys Asp Val Thr Gln Glu Met Lys Asp

420 425 430

Lys Leu Lys Val Glu Asn Asn Gly Ser Tyr Lys Leu Asp Ile Glu Lys

435 440 445

Leu Glu Lys Ser Tyr Val Ile His Tyr Asp Gly Glu Tyr Leu Ser Gly

450 455 460

Ser Asp Gln Val Asn Phe Arg Thr His Met Phe Gly Tyr Pro Glu Gln

465 470 475 480

Gln Tyr Lys Tyr Tyr Tyr Thr His Leu Gly Tyr Gln Leu Thr Trp Asp

485 490 495

Asn Gly Leu Val Leu Tyr Ser Asn Lys Ala Lys Gly Asp Gly Thr Asn

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Asn Asn His His Ile Ser His Ser Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gly His

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Gly Asn Tyr Gly Val Ile Glu Glu Ile Glu Glu Asn Ser His Val Asp

725 730 735

Ile Lys Ser Glu Leu Gly Tyr Glu Gly Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln

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Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly

755 760 765

Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly

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Gln Asn Lys Gly Asp Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys

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Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser

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Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ile

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<211> 940

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白结合蛋白B

<400> 13

Met Lys Ser Asn Leu Arg Tyr Gly Ile Arg Lys His Lys Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ala Ser Val Phe Leu Gly Thr Met Ile Val Val Gly Met Gly Gln Glu

20 25 30

Lys Glu Ala Ala Ala Ser Glu Gln Asn Asn Thr Thr Val Glu Glu Ser

35 40 45

Gly Ser Ser Ala Thr Glu Ser Lys Ala Ser Glu Thr Gln Thr Thr Thr

50 55 60

Asn Asn Val Asn Thr Ile Asp Glu Thr Gln Ser Tyr Ser Ala Thr Ser

65 70 75 80

Thr Glu Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Val Thr Thr Glu Glu Ala Pro

85 90 95

Lys Thr Val Gln Ala Pro Lys Val Glu Thr Ser Arg Val Asp Leu Pro

100 105 110

Ser Glu Lys Val Ala Asp Lys Glu Thr Thr Gly Thr Gln Val Asp Ile

115 120 125

Ala Gln Pro Ser Asn Val Ser Glu Ile Lys Pro Arg Met Lys Arg Ser

130 135 140

Thr Asp Val Thr Ala Val Ala Glu Lys Glu Val Val Glu Glu Thr Lys

145 150 155 160

Ala Thr Gly Thr Asp Val Thr Asn Lys Val Glu Val Glu Glu Gly Ser

165 170 175

Glu Ile Val Gly His Lys Gln Asp Thr Asn Val Val Asn Pro His Asn

180 185 190

Ala Glu Arg Val Thr Leu Lys Tyr Lys Trp Lys Phe Gly Glu Gly Ile

195 200 205

Lys Ala Gly Asp Tyr Phe Asp Phe Thr Leu Ser Asp Asn Val Glu Thr

210 215 220

His Gly Ile Ser Thr Leu Arg Lys Val Pro Glu Ile Lys Ser Thr Asp

225 230 235 240

Gly Gln Val Met Ala Thr Gly Glu Ile Ile Gly Glu Arg Lys Val Arg

245 250 255

Tyr Thr Phe Lys Glu Tyr Val Gln Glu Lys Lys Asp Leu Thr Ala Glu

260 265 270

Leu Ser Leu Asn Leu Phe Ile Asp Pro Thr Thr Val Thr Gln Lys Gly

275 280 285

Asn Gln Asn Val Glu Val Lys Leu Gly Glu Thr Thr Val Ser Lys Ile

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Phe Asn Ile Gln Tyr Leu Gly Gly Val Arg Asp Asn Trp Gly Val Thr

305 310 315 320

Ala Asn Gly Arg Ile Asp Thr Leu Asn Lys Val Asp Gly Lys Phe Ser

325 330 335

His Phe Ala Tyr Met Lys Pro Asn Asn Gln Ser Leu Ser Ser Val Thr

340 345 350

Val Thr Gly Gln Val Thr Lys Gly Asn Lys Pro Gly Val Asn Asn Pro

355 360 365

Thr Val Lys Val Tyr Lys His Ile Gly Ser Asp Asp Leu Ala Glu Ser

370 375 380

Val Tyr Ala Lys Leu Asp Asp Val Ser Lys Phe Glu Asp Val Thr Asp

385 390 395 400

Asn Met Ser Leu Asp Phe Asp Thr Asn Gly Gly Tyr Ser Leu Asn Phe

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