具体实施方式

本公开提供了可以用作动物(例如家畜动物)的关节小病的客观指标的生物标志物。所述生物标志物可以用于诊断关节小病，监测关节小病的进展，确定何时需要治疗并监测治疗效率。

(I)生物标志物

本公开的一个方面涵盖一组与关节小病相关的血清生物标志物。所述生物标志物与骨和软骨的合成和降解有关。所述生物标志物可以用于区分健康动物与患有关节小病的动物(例如，跛行动物)，监测关节小病或关节疾病的进展，或监测治疗功效。

一种生物标志物是骨钙素。骨钙素也称为骨γ-羧谷氨酸包含蛋白(BGLAP)，是一种存在于骨和牙本质中的非胶原蛋白激素。骨钙素是骨合成的标志物。

另一种生物标志物是I型胶原C端端肽或CTX-1，其是骨降解或转换(turnover)的标志物。I型胶原占骨有机基质的约90％。CTX-1与骨转换有关，因为它是在骨吸收期间被破骨细胞切割的分子部分。CTX1是骨降解的标志物。

仍另一种生物标志物是II型前胶原C端前肽或P2CP，其是软骨合成的生物标志物。II型胶原是软骨的主要有机成分。P2CP是软骨合成的标志物。

另外的生物标志物是II型胶原C端端肽或CTX-2，其是软骨降解的生物标志物。在软骨降解后，CTX-2的片段被释放到循环中。CTX2是软骨降解的标志物。

又另一种生物标志物是II型胶原或C2C，其是软骨降解的生物标志物。

在确定健康动物和患有关节小病(自然发生的关节小病或化学诱导的关节小病)的动物中的关节小病生物标志物的水平后，可以将这些水平与跛行或关节小病的标准指标相关联以建立健康动物和患有关节小病/跛行的动物的生物标志物参考水平。合成/降解的比率(P2CP/C2C、P2CP/CTX2、骨钙素/CTX1)可能与跛行相关。

跛行或关节小病的标准指标包含视觉步态评分和测力板测试。观察动物的步态或运动并对其评分。步态可以用5分制评分，范围为从步态正常的动物的“0”到不愿意行走并用一条或多条腿承受重量的动物的“4”。测力板可以用于测量每个前肢的重量，其中差异表明动物偏向于一个肢体。通过将生物标志物水平与视觉跛行/关节小病标准相关联，可以建立健康和跛行动物的参考水平。

(II)用于诊断关节小病和/或监测关节小病进展的方法

本公开的另一方面提供了用于诊断动物的关节小病和/或监测动物的关节小病进展的方法。例如，所述方法可以用于区分健康动物和患有关节小病的动物，并且如果动物患有关节小病，则可以监测所述小病的进展。所述方法包括：(a)从所述动物收集血液样品；(b)确定所述血液样品中存在的本文公开的生物标志物中的至少一种生物标志物的水平；以及(c)对所述至少一种生物标志物的水平进行分析以确定所述动物是否患有或倾向于患有关节小病，其中所述分析包含将所述血液样品中的所述至少一种生物标志物的水平与所述至少一种生物标志物的关节小病阳性和/或关节小病阴性参考水平进行比较，以便确定所述动物是否患有或倾向于患有关节小病，和/或监测已知有关节问题的动物的关节小病的进展。

关节小病

如本文所使用的，“关节小病”是指关节或关节组织的疾病或病症。关节组织包含骨和结缔组织，即软骨、肌腱和韧带。关节小病包含关节炎或骨关节炎，其是由于一个或多个关节内的关节软骨的逐渐退化而引起的退行性关节疾病或病症。关节炎是对引起关节炎症的任何病状的一般描述。类风湿性关节炎是关节的慢性炎症性病症。其它关节小病包含骨软骨病、痛风性关节炎、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎、滑膜炎、强直性脊柱炎、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、银屑病关节炎和莱姆病(Lyme disease)。一些关节病症可能是由于蹄或足垫疾病或病症引起的。

步骤(a)

所述方法的第一步骤包括从动物收集血液样品。收集血液、尿液或滑液的各种方法是本领域已知的。通常，收集血液的方法包括使用皮肤穿刺元件进入血液并且将其中的血液收集到某种类型的收集装置中。进入血液还可以涉及使用流体通路、毛细通道(例如，毛细管)、流体传输介质(例如，亲水性多孔材料)或与皮肤穿刺元件结合的某种机械或真空构件。一般而言，样品收集方法优选地维持样品的完整性，使得可以准确测量每个分子特征的丰度值。血液样品可以是全血样品、血浆样品或血清样品。

步骤(b)

所述方法的第二步骤包括确定血液样品中存在的至少一种生物标志物的水平。可以使用多种方法来确定一种或多种生物标志物的水平或浓度。可以使用基于抗体的检测方法检测和定量生物标志物。例如，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定生物标志物的水平。ELISA可以是直接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA或反向ELISA。检测方法可以是光学的(即，比色或荧光)或电化学的。在具体实施例中，可以使用夹心ELISA和比色检测来检测一种或多种生物标志物。

在其它实施例中，基于抗体的检测方法可以包括蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、蛋白质印迹或蛋白质免疫染色。在仍其它实施例中，可以使用高效液相色谱法(HPLC)或液相色谱-质谱法(LC/MS)来对一种或多种生物标志物的水平进行定量。

步骤(c)

所述方法的下一个步骤包括对至少一种生物标志物的水平进行分析，以确定动物是否健康、是否倾向于或可能罹患关节小病，或是否患有关节小病。所述分析包括将血液样品中的至少一种生物标志物的水平与至少一种生物标志物的关节小病阳性和/或关节小病阴性参考水平进行比较。如果至少一种生物标志物的水平落在关节小病阴性参考水平的范围内，则动物是健康的并且未患有关节小病。如果至少一种生物标志物的水平落在关节小病阳性参考水平的范围内，则动物患有关节小病。关节小病的严重程度可以基于至少一种生物标志物的水平来估计。可以通过比较至少一种生物标志物随时间推移的水平来监测关节小病的进展。

在一些实施例中，可以确定两种生物标志物的水平。例如，可以确定骨钙素和CTX1的水平和/或可以确定骨钙素/CTX1的比率。可替代地，可以确定P2CP和C2C的水平和/或可以确定P2CP/C2C的比率。在其它实施例中，可以确定三种生物标志物的水平。在另外的实施例中，可以确定四种生物标志物的水平。在仍其它实施例中，可以确定所有五种生物标志物的水平。

动物

合适的动物包含但不限于家畜动物、伴侣动物、实验室动物和动物学动物。在具体实施例中，动物可以是家畜动物。合适的家畜动物的非限制性实例可以包含猪、牛、家禽、山羊、绵羊、美洲驼、羊驼、水生动物等。在示例性实施例中，所述动物可以是猪，例如母猪。在其它实施例中，所述动物可以是奶牛。

在其它实施例中，所述动物可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可以包含宠物，如狗、猫、马、兔子、鸟或啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)。在又其它实施例中，所述动物可以是动物学动物。如本文所使用的，“动物学动物”是指可以在动物园发现的动物。此类动物可以包含非人灵长类动物、大型猫科动物、狼、熊、河马、袋鼠等。在仍其它实施例中，所述动物可以是实验室动物。实验室动物的非限制性实例可以包含啮齿动物、犬科动物、猫科动物和非人类灵长类动物。

(III)用于治疗或预防关节小病的方法

本公开的另一方面提供了用于治疗或预防动物的关节小病的方法。所述方法还可以用于监测治疗方法的功效，其中可以相应地修改所述治疗方法。所述方法包括：(a)从所述动物收集血液样品；(b)确定所述血液样品中存在的本文公开的生物标志物中的至少一种生物标志物的水平；(c)对所述至少一种生物标志物的水平进行分析以确定所述动物是否患有或倾向于患有关节小病，其中所述分析包含将所述血液样品中的所述至少一种生物标志物的水平与所述至少一种生物标志物的关节小病阳性和/或关节小病阴性参考水平进行比较，以便确定所述动物是否患有或倾向于患有关节小病；以及(d)如果所述动物被确定患有或倾向于患有关节小病，则向所述动物施用有效量的金属螯合物。

所述方法的步骤(a)、(b)和(c)如上文部分(II)所述，合适的关节小病和动物也是如此。

步骤(d)

如果在步骤(c)中确定动物患有或倾向于患有关节小病，则下一个步骤包括向所述动物施用有效量的金属螯合物。

所述金属螯合物包括至少一种配体和至少一种金属离子。所述配体可以是氨基酸、羟基酸(例如，α羟基酸)、有机酸、糖醇、蛋白质、蛋白质水解物(例如，大豆蛋白水解物)、多糖或多核酸。

在一些实施例中，所述配体可以是氨基酸。合适的氨基酸衍生物包含丙氨酸盐、精氨酸盐、天冬酰胺酸盐、天冬氨酸盐、半胱氨酸盐、谷氨酰胺酸盐、谷氨酸盐、组氨酸盐、高半胱氨酸盐、异亮氨酸盐、赖氨酸盐、甲硫氨酸盐、苯丙氨酸盐、脯氨酸盐、丝氨酸盐、苏氨酸盐、色氨酸盐、酪氨酸盐和缬氨酸盐。

在其它实施例中，所述配体可以是有机酸。合适的有机酸部分的非限制性实例包含己二酸盐、抗坏血酸盐、辛酸盐、柠檬酸盐、黄腐酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、戊二酸盐、甘油磷酸盐、腐植酸盐、乳酸盐、酮戊二酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、乳清酸盐、草酸盐、泛酸盐、吡啶甲酸盐、吡酮酸盐、癸二酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐。

在仍其它实施例中，所述配体可以是糖醇。合适的糖醇包含但不限于山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇和氢化淀粉水解物(HSH)。

在具体实施例中，所述配体是式(I)化合物。

其中R¹是甲基或乙基并且n为1或2。在示例性实施例中，R¹是甲基并且n为2，并且式(I)化合物是甲硫氨酸羟基类似物(或2-羟基-4-(硫甲基)丁酸，HMTBA)。

所述至少一种金属离子可以是钙、铬、钴、铜、锗、铁、锂、镁、锰、钼、镍、钾、钠、铷、锡、钒、锌或其组合。在某些实施例中，所述至少一种金属离子可以是钙、铬、钴、铜、铁、镁、锰、镍、钾、钠、锌或其组合。在具体实施例中，所述至少一种金属离子可以是铜、锰、锌或其组合。

在所述金属螯合物中，所述至少一种配体和所述至少一种金属离子的比率可以变化。例如，配体与金属的比率可以在1:1到约3:1或更高的范围内。在金属离子为二价的实施例中，配体与金属的比率可以是2:1。

在特定实施例中，所述金属螯合物可以包括甲硫氨酸羟基类似物铜(即，MHA-Cu到(HMTBA)₂-Cu)、甲硫氨酸羟基类似物锰(即，MHA-Mn或(HMTBA)₂-Mn)、甲硫氨酸羟基类似物锌(即，MHA-Zn或(HMTBA)₂-Zn)或前述物质中的任何或全部物质的组合(其可从诺伟司国际公司(Novus International,Inc.)以商品名获得)。

施用于所述动物的所述金属螯合物的有效量可以并且将会变化，这取决于例如动物的类型和年龄和/或关节小病的严重程度。本领域技术人员可以容易地确定合适的量。

通常，所述金属螯合物包含在动物的饲料配量中。饲料配量通常被调配成满足特定动物的营养物和能量需求。已经测量了许多常见动物饲料成分的营养物和能量含量并且可用于公众。国家研究委员会(National Research Council)出版了含有常见饲料成分以及它们相应的所测量的营养物和能量含量的表格的书籍。另外，还为不同生命阶段、年龄、性别或用途的动物提供了营养物和维持能量需求的估计值。本领域的技术人员可以利用此信息以估计动物的营养和维持能量需求，并确定动物饲料成分的营养物和能量含量。

实例

以下实例说明了本公开的各个实施例。

实例1：方案描述

在此研究中评估两种不同的跛行模型(自然发生的和化学诱导的)。在这两种模型中，将跛行的客观测量(血清生物标志物、测力板、热成像)与视觉步态评分进行比较。研究设计是由两种饮食处理(螯合微量矿物质与无机微量矿物质)和两个猪群(跛行与健康非跛行)组成的2×2因子排列。螯合微量矿物质(MTX)包括甲硫氨酸羟基类似物(MHA)螯合物(即，MHA-Cu、MHA-Mn和/或MHA-Zn)，并且无机微量矿物质(ITM)包括无机硫酸盐。

对四组猪(每组8头跛行/8头非跛行，总共32头跛行/32头非跛行/总共64头)投喂饮食处理，持续两个月的时间段。对于试验的自然发生部分(实例2)，在基线(d0)、第1个月(d28)和第2个月(d53)进行跛行测量。在2个月时间段结束时，然后仅向健康动物(每组n＝8；对于MTX，4头，并且对于ITM，4头)的右后远端指间关节中注射尿酸钠晶体(10mg/mL，并且注射体积为0.2mL)(实例3)。

用于步态评分的大多数方法是基于不均匀或不对称的承重。如表1所示，使用了5分制(0-4)，其中4分最严重。

测力板分析对每个肢体施加到四个单独的加载单元的力的量进行了定量。在2分钟的持续时间内每秒捕获两个数据点。跛行动物通常在疼痛或结构不健全的肢体上承受较少的重量。

热成像测量以红外辐射的形式从体表发出的热量。临床疾病研究表明，两个相同解剖区域之间的差异大于1℃指示存在异常，如炎症。动物左侧和右侧之间的高度对称性是诊断与跛行相关的单侧问题的重要要素。因此，跛行的这些客观量度应该与也是基于不对称承重的视觉步态评分相关。

所有统计分析均利用SAS、使用猪作为实验单位进行。所有跛行测量均使用双向方差分析(ANOVA)进行分析，以测试饮食处理的主要影响和健康与跛行以及其相互作用；还比较了前肢与后肢的差异。另外，还使用混合模型评估数据，包含天数、跛行、饮食处理、体重、组和性别。天数作为使用自回归协方差结构的重复量度包含在内，并且在研究开始前一天收集的数据作为协变量包含在内(仅针对测力板数据)。

皮尔逊(Pearson)相关系数和回归分析用于探索客观测量值与步态评分之间的关系。

实例2.健康动物和自然发生的跛行动物的生物标志物水平

在第0天、第25天和第53天(2个月)测量健康(H)和跛行(L)动物(n＝48)的血清生物标志物。根据商业试剂盒(例如，MyBiosource)中描述的程序，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血清CTX1、骨钙素(OC)、C2C、P2CP和CTX2的水平。结果在表2中呈现。

^1.处理(ITM或MTX)。

这些结果揭示了生物标志物能够区分健康与跛行，并且证明了MTX的有益作用。在跛行动物中，软骨降解标志物CTX2(P＝0.0002)和C2C(P＝0.0176)升高，并且软骨合成/降解比率(P2CP/CTX2；P＝0.0908)降低(表2)。还观察到饮食处理差异：软骨合成生物标志物(P2CP，P＝0.0114)和软骨合成/降解的比率(P2CP/CTX2，P＝.0267)随着MTX而增加(表2)。如图1所示，不存在饮食(ITM与MTX)*健康与跛行的相互作用(P＝0.9727)。这表明MTX处理增加了健康猪和跛行猪两者的软骨合成，并且可能具有预防性关节健康作用。

实例3：尿酸盐诱导的跛行

在两个月结束时，将尿酸钠晶体(10mg/mL，并且注射体积为0.2mL)注射到来自四组中的每个组的健康猪的右后远端指间关节中。因此，在试验的尿酸盐诱导部分期间，对于MTX，总共评估了16头猪，并且对于ITM，总共评估了16头猪。与尿酸盐注射时间相关的数据收集发生在基线(d-1/d53)处、注射后6和12小时(d0/d54)、24小时(d1/55)、48小时(d2/56)、72小时(d3/57)和144小时(d6/60)。

如图2所示，投喂了MTX的猪的步态评分较低(饮食的主要影响：P＝0.0057)。另外，投喂了MTX的猪在跛行高峰时的步态评分(注射尿酸盐后12小时P＝0.0244，注射尿酸盐后48小时P＝0.0155)较低。由于猪在注射尿酸盐之前已经接受了2个月的饮食处理(MTX与ITM)，所以这些发现表明补充MTX降低了尿酸盐诱导的跛行的严重程度。

尿酸盐施用后血清生物标志物的时间过程示出在图3A-3C中。生物标志物的变化与步态评分的变化密切相关。例如，类似于步态评分，软骨降解生物标志物(C2C和CTX2)在尿酸盐注射后12小时达到峰值(图3A、3B)，骨合成生物标志物(骨钙素)在尿酸盐注射后12小时与48小时之间达到峰值(图3C)。类似于步态评分，在72小时后(如果不是更早)，这三种生物标志物(C2C、CTX2、骨钙素)返回到基线或相对于初始浓度趋于稳定。

表3-5呈现了施用尿酸盐后的生物标志物水平(无协变量)。如图3A-3C所指示的，对于C2C(P＝0.0853)、CTX2(P＝0.1014)和骨钙素(OC，P＝0.0011)存在时间(小时)的明显或显著影响。还观察到MTX的有益作用；骨合成生物标志物(OC，P＝0.0700)和骨合成/降解的比率(OC/CTX1；P＝0.0470)两者均增加，并且软骨合成/降解的比率(P2CP/C2C；P＝0.0990)随着MTX而降低。

尽管预测骨和软骨合成/降解都会随着MTX而增加，但基于相关性分析，骨和软骨合成呈负相关(表6以及表7中骨钙素(+)和P2CP(-)的相反斜率)。类似地，Billinghurst等人(《美国兽医研究杂志(Am J Vet Res)》,2004,65(2):143-50)报告了在患有骨软骨病的马驹中骨与软骨合成之间的负方向(例如，骨钙素减少并且P2CP增加)。

如表7所示，对于尿酸盐诱导的跛行模型，相关性和回归分析证明生物标志物与跛行或步态评分显著相关。在评估的8种生物标志物中，五种生物标志物以P<0.05显著相关；两种生物标志物以P<0.10相关；只有一种生物标志物不相关。此外，斜率在预期方向上：对于软骨和骨降解标志物为正，对于骨和软骨的合成/降解的比率为负，并且对于合成标志物为混合(对于骨钙素为正斜率；对于P2CP为负斜率)。

测力板分析在图4A-4D中呈现。这些分析还证明了MTX对承重具有有益影响。对于注射尿酸盐的足部(右后部，RR)，在MTX动物注射后的所有时间点都发生了更高的承重(图4D；在D+3和D+6时明显更高)。在MTX动物的对侧后腿上也发生了更高的承重(图4C；在注射后D+1和D+2时更高)。这些发现表明，在投喂了MTX的猪中跛行不太严重，这与步态评分结果一致(图2；对于投喂了MTX的猪，步态评分不太严重)。

总之，在跛行猪中，软骨降解的血清生物标志物(C2C、CTX2)增加并且骨合成生物标志物(骨钙素)改变。这些生物标志物可以客观地用于测量猪的跛行。投喂MTX通过使骨合成(骨钙素)相对于降解(骨钙素/CTX1比率)增加并且使软骨合成(P2CP)相对于降解(P2CP/CTX2比率)增加来改善骨和软骨的代谢。总之，跛行增加了软骨降解生物标志物并改变了骨合成生物标志物，投喂MTX相对于降解提高了骨和软骨合成，从而减少跛行。