阅读说明：本技术 一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法 (Design and preparation method of DMSO-Free cell cryopreservation solution ) 是由 黄火能 于 2021-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法,包括以下步骤,S1：选取聚谷氨酸、透明质酸和海藻糖三种化合物作为保护液,分别进行细胞冻存实验；S3：确定成分为化合物聚谷氨酸、化合物透明质酸和化合物海藻糖的一种,按照保护液所占冻存液的配比不同,选出最优配方；S4：将聚谷氨酸*透明质酸、聚谷氨酸*海藻糖、透明质酸*海藻糖和聚谷氨酸*透明质酸*海藻糖等比例混合作为冻存保护液,进行细胞冻存；本发明不依托传统的思路寻找,而是通过已经高度发展的化妆品领域中的成分,发现可以应用在细胞冻存领域的材料,追求接近使用DMSO效果的细胞存活率,但却消除DMSO所附带的毒性,且采用低成本原料,使冻存液可广泛适用于医疗方面。(The invention discloses a design and preparation method of a DMSO-Free cell frozen stock solution, which comprises the following steps of S1: selecting three compounds, namely polyglutamic acid, hyaluronic acid and trehalose as protective solutions, and performing cell cryopreservation experiments respectively; s3: determining one of polyglutamic acid compound, hyaluronic acid compound and trehalose compound as a component, and selecting an optimal formula according to different proportions of the protective solution in the frozen stock solution; s4: mixing polyglutamic acid hyaluronic acid, polyglutamic acid trehalose, hyaluronic acid trehalose and polyglutamic acid hyaluronic acid trehalose in equal proportion to serve as a cryopreservation protection solution, and performing cell cryopreservation; the invention does not depend on the traditional idea for searching, but finds materials which can be applied to the field of cell cryopreservation through the components in the field of cosmetics which are highly developed, pursues the cell survival rate which is close to the effect of using DMSO, but eliminates the toxicity attached by the DMSO, and adopts low-cost raw materials, so that the cryopreservation liquid can be widely applied to the aspect of medical treatment.)

一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法

技术领域

本发明涉及一种设计和制备方法，特别涉及一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法，属于细胞冻存液技术领域。

背景技术

干细胞治疗是目前迅猛发展的一种非常有前景的治疗各类疾病的手段。而该技术的发展需要干细胞库建设为支撑，细胞的冷冻保存是其中的关键技术之一。冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列的理化变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变以及蛋白质变性等，严重时甚至会导致细胞死亡。因此，细胞冻存液需要添加甘油、DMSO等保护剂成分,以降低冰点，在缓慢降温条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。冻存液的优劣对冻存后细胞的质量有着举足轻重的影响。

目前普遍使用的细胞冻存液多含有二甲基亚砜在(DMSO)成分，尽管DMSO成本低效果好，但它能与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，对细胞具有一定的毒性，不能用于治疗用细胞的冻存。因此，研制不含DMSO-甚至化学成分明确的细胞冻存液是目前细胞冻存领域的一个热点，具有很高的实际应用价值，虽然国外已有类似的商业产品，但价格昂贵，难以在细胞库中大规模应用，而国内尚无成熟产品，为此，本项目拟从减少降温过程中细胞内冰晶形成的原理出发，寻找与DMSO性质相似的无毒替代物，通过比较细胞冻存后的存活率，确定细胞冻存液的配方，从而开发一种价廉高效的DMSO-Free细胞冻存液用于干细胞保存。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法，包括以下步骤：

S1：选取聚谷氨酸、透明质酸和海藻糖三种化合物作为保护液，分别进行细胞冻存实验；

S2：筛选出与DMSO效果最相近的化合物，并去除基本无冻存保护能力的化合物；

S3：确定成分为化合物聚谷氨酸、化合物透明质酸和化合物海藻糖的一种，按照保护液所占冻存液的配比不同，选出最优配方；

S4：将聚谷氨酸*透明质酸、聚谷氨酸*海藻糖、透明质酸*海藻糖和聚谷氨酸*透明质酸*海藻糖等比例混合作为冻存保护液，进行细胞冻存；

S5：判断所选到的保护剂间相互作用对胞冻存效果的影响，确定冻存液中保护剂的组成，得到混合物X，若效果都不理想，则选聚谷氨酸、透明质酸和海藻糖其中之一；

S6：若确定成分为混合物X，将混合物X按照各组分比例不同、保护液所占冻存液的配比不同进行实验，选出最优配方；

S7：通过控制降温过程等，筛选出适用于此保护液最优的冻存方法，获得DMSO-Free细胞冻存液配方。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S1中实验方法以5％-20％配比进行多组实验，并将DMSO以10％配比进行细胞冻存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法，不依托传统的思路寻找，而是通过已经高度发展的化妆品领域中的成分，发现可以应用在细胞冻存领域的材料，并加以应用。

2.本发明一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法，DMSO-free细胞冻存保护液，追求接近使用DMSO效果的细胞存活率，但却消除DMSO所附带的毒性，且采用低成本原料，使冻存液可广泛适用于医疗方面。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法的技术方案：

一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法，包括以下步骤：

S1：选取聚谷氨酸、透明质酸和海藻糖三种化合物作为保护液，分别进行细胞冻存实验；

S2：筛选出与DMSO效果最相近的化合物，并去除基本无冻存保护能力的化合物；

S3：确定成分为化合物聚谷氨酸、化合物透明质酸和化合物海藻糖的一种，按照保护液所占冻存液的配比不同，选出最优配方；

S4：将聚谷氨酸*透明质酸、聚谷氨酸*海藻糖、透明质酸*海藻糖和聚谷氨酸*透明质酸*海藻糖等比例混合作为冻存保护液，进行细胞冻存；

S5：判断所选到的保护剂间相互作用对胞冻存效果的影响，确定冻存液中保护剂的组成，得到混合物X，若效果都不理想，则选聚谷氨酸、透明质酸和海藻糖其中之一；

S6：若确定成分为混合物X，将混合物X按照各组分比例不同、保护液所占冻存液的配比不同进行实验，选出最优配方；

S7：通过控制降温过程等，筛选出适用于此保护液最优的冻存方法，获得DMSO-Free细胞冻存液配方。

步骤S1中实验方法以5％-20％配比进行多组实验，并将DMSO以10％配比进行细胞冻存。

具体使用时，本发明一种DMSO-Free细胞冻存液的设计和制备方法，选取聚谷氨酸、透明质酸和海藻糖三种化合物作为保护液，分别进行细胞冻存实验；筛选出与DMSO效果最相近的化合物，并去除基本无冻存保护能力的化合物；确定成分为化合物聚谷氨酸、化合物透明质酸和化合物海藻糖的一种，按照保护液所占冻存液的配比不同，选出最优配方，将聚谷氨酸*透明质酸、聚谷氨酸*海藻糖、透明质酸*海藻糖和聚谷氨酸*透明质酸*海藻糖等比例混合作为冻存保护液，进行细胞冻存，判断所选到的保护剂间相互作用对胞冻存效果的影响，确定冻存液中保护剂的组成，得到混合物X，若效果都不理想，则选聚谷氨酸、透明质酸和海藻糖其中之一；若确定成分为混合物X，将混合物X按照各组分比例不同、保护液所占冻存液的配比不同进行实验，选出最优配方；通过控制降温过程等，筛选出适用于此保护液最优的冻存方法，获得DMSO-Free细胞冻存液配方。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。