黄花蒿提取物在制备ad治疗或预防制剂中的应用
阅读说明：本技术 黄花蒿提取物在制备ad治疗或预防制剂中的应用 (Application of artemisia annua extract in preparation of preparation for treating or preventing AD ) 是由 郑文华 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了黄花蒿提取物在制备AD治疗或预防制剂中的应用。黄花蒿沸水提取物可以出人意料地提高阿尔兹海默病转基因模型小鼠的学习记忆能力,抗氧化损伤导致神经细胞死亡,促进线粒体跨膜电位恢复,减少淀粉样斑块的沉积和神经纤维的缠结及神经元丢失,为治疗阿尔兹海默病的临床研究提供实验基础。(The invention discloses application of artemisia annua extract in preparing an AD treatment or prevention preparation. The artemisia annua boiling water extract can unexpectedly improve the learning and memory capacity of a mouse of a transgenic model of the Alzheimer disease, prevent nerve cell death caused by oxidative damage, promote the recovery of the transmembrane potential of mitochondria, reduce the deposition of amyloid plaques, the entanglement of nerve fibers and the loss of neurons, and provide an experimental basis for clinical research on the treatment of the Alzheimer disease.)
技术领域
本发明涉及黄花蒿提取物的新应用，特别涉及黄花蒿水提取物在预防或治疗阿尔兹海默病(AD)中的应用。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)是影响老年人最具破坏性的疾病之一。淀粉样β(Aβ)积累和下游病理事件(如，炎症,氧化应激)在AD的发病机理中起关键作用。包括Tau过度磷酸化，神经胶质活化，神经炎症，神经元丢失，突触功能障碍，造成了极大的经济负担和社会压力。老年人中的老年痴呆症，其发病率随疾病(AD)逐年增加，是全世界人口老龄化的最常见形式，给家庭和社会造成了巨大的社会和经济负担。
目前对于阿尔茨海默病的病因仍然是不清楚的，大量研究表明β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)是主要的治病因素。近年来，许多通过免疫疗法或使用分泌酶抑制剂靶向Aβ的药物已进入临床试验，但均未能改善患者的认知功能。阿尔茨海默氏病(AD)是影响老年人最具破坏性的疾病之一。Aβ积累和下游病理事件(如，氧化应激)在AD的发病机理中起关键作用。当前临床试验失败的教训表明，针对AD发病机制的多个关键途径，以制止疾病进展是必要的。尽管近年来在了解AD发病机理方面取得的重大进展，但尚无有效的药物可以用于AD的治疗，因此研究AD有效的治疗意义重大。
黄花蒿(Artemisia aunna L.)为一年生的草本菊科植物，别名草蒿、青蒿、臭蒿、犱蒿等。作为传统的中药之一，黄花蒿具有亲热解毒、截疟抗菌等功效。有文献报道黄花蒿提取物所含有倍半萜类、黄酮类、挥发性油类和香豆素类等物质具有清热、解暑、截疟和健胃等功效。此外，黄花蒿提取物具有抗氧化、提高免疫能力、杀菌和抗病毒等功效(王鸿博，肖晥，华会明，等.黄花蒿的化学成分研究进展[J].现代药物与临床，2011，26(6)：430-433)但黄花蒿提取物对神经的保护作用则未见报道。黄花蒿活性物质提取方法包括水提法、传统的有机溶剂提取(乙醇提取法)等，主要有提取液、粉末等形式。其中青蒿素及其衍生物、青蒿多糖和青蒿精油是黄花蒿提取物的主要有效成分。青蒿素类化合物主要为脂溶性成分，在黄花蒿中的含量较低。青蒿素类化合物普通对热比较敏感，同时几乎不溶于水，一般使用醇提或有机溶剂提取，提取方法不当，其结构极易被破坏或提取不到青蒿素类化合物。目前，对于青蒿素及其衍生物活性作用除了抗疟外，其主要研究体现在抗氧化能力和免疫抗炎能力等。
近期有研究表明，青蒿素及其部分衍生物对神经退行性疾病也有一定的治疗或预防作用。如CN107802621A公开了青蒿素B在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用，其中，所述的神经退行性疾病是以学习记忆障碍为特征的，其中，所述的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病，帕金森，亨氏顿氏病。CN109394757A公开了蒿甲醚在预防及治疗阿尔兹海默病中的应用。CN105147666A公开了一种治疗和缓解神经变性疾病的化合物，该化合物为青蒿素(Artemisinin)衍生物，所述的青蒿素(Artemisinin)衍生物包含蒿甲醚(Artemether)、蒿乙醚(Arteether)、青蒿琥酯(Artesunatum)、双氢青蒿素(Dihydroartemisinin)和药学上可接受的辅料。它可以治疗早老性痴呆、帕金森氏综合征和亨廷顿病。
由于青蒿素类化合物在黄花蒿中含量较低，同时几乎不溶于水或难溶于水。一般认为黄花蒿水提取物(总提取物)中不含有青蒿素类化合物。黄花蒿水提取物的功效研究比较少，郭鸿儒,沈慧敏,杨顺义,et al.黄花蒿化感物质对受体燕麦化感作用机理的初步研究[J].甘肃农业大学学报,2008,43(1).测定了不同浓度的黄花蒿水提取物对燕麦植株体内几种酶活性(12～60h)的影响.结果表明:黄花蒿水提取物可抑制燕麦体内多酚氧化酶(PPOD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等抗性酶的活性,提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。葛水莲,叶嘉,陈建中,等.黄花蒿提取物离体抑菌活性研究[J].江苏农业科学,2013,041(003):291-292.采用滤纸片法和孢子萌发法,以黑曲霉、青霉、绵霉为供试菌种,对黄花蒿提取物的离体抑菌活性进行研究.结果显示:各类黄花蒿提取物的抑菌效果均随浓度的升高而增强；水提物对绵霉抑菌活性最高,最大抑菌圈直径达28.3mm,最大孢子萌发抑制率为45.45％；50％乙醇粗提物对青霉和黑曲霉的抑菌效果最好,最大抑菌圈直径分别为15.6、14.5mm,最大孢子萌发抑制率分别为31.58％、27.08％。
发明内容
本发明的目的在于提供黄花蒿水提取物在制备阿尔兹海默病治疗或预防制剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
黄花蒿水提取物在制备阿尔兹海默病治疗或预防制剂中的应用。
在一些实例中，所述黄花蒿水提取物的提取温度不低于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、沸腾温度。
在一些实例中，所述黄花蒿水提取物的提取时间不少于30min、1h、2h、3h、4h、5h。
在一些实例中，所述黄花蒿水提取物的制备方法包括以下步骤：
1)取黄花蒿加入水充分浸泡，加热沸腾提取，取滤液；
2)在药渣中加入水，加热沸腾提取，取滤液；
3)合并两次提取得到的滤液，浓缩、干燥，得到黄花蒿水提取物。
在一些实例中，所述阿尔兹海默病是由神经元的丢失、神经元的功能障碍或神经元氧化损伤引起的。
本发明的第二个方面，提供：
黄花蒿水提取物在制备改善学习记忆或认知功能障碍制剂中的应用，所述黄花蒿水提取物如本发明第一个方面所述。
在一些实例中，所述认知功能障碍包括但不限于老年及阿尔兹海默病所致的学习记忆或认知功能障碍。
本发明的第三个方面，提供：
一种治疗或预防阿尔兹海默病的制剂，所述制剂的活性成分包括本发明第一个方面所述的黄花蒿水提取物。
在一些实例中，所述制剂选自口服剂、功能性食品。
在一些实例中，所述口服剂选自颗粒剂、片剂、胶囊，或者悬浮液；所述功能性食品选自固体饮料、糖果、烘焙食品、非饮用乳制食品、畜肉和禽肉、谷物和面粉、冷冻水果和蔬菜制品。
本发明的有益效果是：
发明人发现，在阿尔兹海默病小鼠模型中，通过饮水方式给予黄花蒿提取物ZWH2880(沸水提取物)后，可有效避免注射导致的二次损伤，黄花蒿沸水提取物能够改善小鼠学习、记忆能力，保护神经细胞丢失以及降低阿尔兹海默病模型小鼠淀粉样斑块沉积和神经纤维缠结的能力；同时可改善阿尔兹海默病转基因模型小鼠学习记忆能力，改善阿尔兹海默病转基因模型小鼠氧化损伤，在神经细胞(PC12，SY5Y)和原代神经元细胞模型中，黄花蒿沸水提取物可抗Aβ诱发的神经毒性，减少Aβ/氧化应急引起的ROS堆积及线粒体跨膜电位的丢失(早期细胞凋亡/死亡指征)。实验结果表明黄花蒿沸水提取物可以提高MAPK/ERK关信号通路的活性，通过MAPK/ERK关键信号通路改善阿尔兹海默病病理病变，对AD具有较好的治疗或预防作用。
附图说明
如无特别说明，图中3xTg小鼠指的是3xTg AD小鼠。
图1是不同浓度的黄花蒿提取物ZWH288对阿尔兹海默病模型小鼠提高学习记忆能力的作用。(A)ZWH288对小鼠逃避潜伏期(学习能力)的影响；(B)ZWH288对小鼠在目标象限穿过平台的次数(记忆)的影响。(C)ZWH288对小鼠记忆的影响。实验分为正常小鼠对照组(WT)(给予等量饮用水)，模型组(3xTg AD小鼠)(给予等量饮用水)，模型组+ZWH2880 20mg/kg，模型组+ZWH2880 6.7mg/kg，模型组+ZWH2880 2mg/kg。(图中3xTg代表的是3xTg AD小鼠，下同)。结果显示ZWH2880改善老年AD小鼠(3xTg-AD)的学习记忆能力。#/*P<0.05，##/**P<0.01，###/***P<0.001(two-way or one-way ANOVA).Error bar，SEM。
图2是黄花蒿水提物ZHW2880对老年3xTg AD小鼠中Aβ沉积和Tau磷酸化的影响结果。(A).Aβ大脑海马区切片的免疫荧光染色(β-淀粉样蛋白免疫荧光染色，6E10标记淀粉样变性)；(B)各组中β-淀粉样蛋白的免疫印迹；(C)各组中β-淀粉样蛋白的免疫印迹的统计学结果分析(各组中β-淀粉样蛋白表达的定量分析结果)；(D)各组中p-Tau-Thr181的免疫荧光染色；(E)各组中p-Tau蛋白的免疫印迹。结果显示老年3xTg AD小鼠脑中Aβ沉积和Tau蛋白的磷酸化显著增加，而ZWH2880处理显著降低了3xTg AD小鼠脑中这两个标志蛋白的表达。
图3是不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对原代神经元的影响。(A)通过免疫荧光染色检测细胞形态特征。(B)通过MTT试验，检查神经元细胞活力。JUJ1是神经元标记。结果显示β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)降低原代神经元的细胞活力(引起原代神经元死亡)而ZWH2880处理显著抑制β-淀粉样蛋白的作用，提高原代神经元的细胞活力，减少了原代神经元细胞的死亡。
#/*P<0.05，##/**P<0.01，###/***P<0.001(two-way or one-way ANOVA).Errorbar，SEM。
图4是不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对神经元抗氧化功能的影响。结果显示(A)黄花蒿提取物ZWH2880降低了ROS的水平，(B)定量分析黄花蒿提取物ZWH2880对ROS的水平的影响。#/*P<0.05，##/**P<0.01，###/***P<0.001(two-way or one-way ANOVA).Errorbar，SEM。ZWH2880处理减少神经元ROS的水平，减少了原代神经元细胞的死亡。
图5是不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对神经细胞PC12的保护作用。(A)PC12细胞用黄花蒿提取物ZWH2880和Aβ1-42处理24小时，黄花蒿提取物ZWH2880对Aβ诱导的神经毒性具有明显的保护作用。(B)PC12细胞用黄花蒿提取物ZWH2880和Aβ1-42处理24小时，黄花蒿提取物ZWH2880对P12细胞没有毒性。
图6是不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对神经细胞内ROS和线粒体膜电位产生的影响。结果显示黄花蒿提取物ZWH2880可恢复Aβ1-42诱导的PC12细胞线粒体跨膜电位的降低，降低Aβ1-42诱导的ROS积累和凋亡。(A)线粒体跨膜电位(图上部)和ROS(图下部)荧光染色分析；(B)线粒体跨膜电位(图上部)的统计学结果分析，显示ZWH2880剂量依赖性地逆转Aβ1-42诱导的PC12细胞线粒体跨膜电位的降低；(C)ROS(图下部)的统计学结果分析，显示ZWH2880剂量依赖性地降低ROS的水平。所有结果表明，黄花蒿提取物ZWH2880可能通过促进线粒体膜电位恢复，减少ROS的堆积而抗细胞的氧化损伤。
图7是不同浓度的黄花蒿对细胞内信号通过激活的影响。结果表明，黄花蒿提取物ZWH2880可能激活MAPK/ERK信号通络，发挥保护作用。
图8是不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对人神经细胞保护作用和抗氧化损伤作用。(A)SY5Y细胞用黄花蒿提取物ZWH2880和Aβ1-42处理24小时，黄花蒿提取物ZWH2880对Aβ诱导的神经毒性具有明显的保护作用。(B)表明ZWH2880降低Aβ1-42诱导的ROS积累和凋亡，黄花蒿提取物ZWH2880降低了ROS的水平，(C)是Aβ1-42诱导的ROS统计分析。结果表明ZWH2880对人神经细胞具有保护作用和抗氧化损伤作用。
具体实施方式
方便比较起见，以下实验中使用的黄花蒿提取物ZWH2880按如下方法制备得到。
黄花蒿提取物ZWH2880的制备
S1)取黄花蒿加入10倍水浸泡2h后开始加热，待水沸腾时开始计时，保持沸腾提取2h，
取滤液；
S2)在药渣中加入8倍水，加热沸腾提取2小时，取滤液；
S3)浓缩：合并两次提取液，浓缩器温度升至65℃、真空度-0.08MPa，将浸膏相对密度浓缩至1.12；
S4)喷雾干燥：设备控制进风温度180℃、出风温度在90℃，将待喷雾浓缩液进行干燥，
得到的产物记为黄花蒿提取物ZWH2880。
不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对阿尔兹海默病模型小鼠提高学习记忆能力的作用
首先，将阿尔兹海默病转基因小鼠模型(3xTg AD)饲分布养至9月龄时，每天用不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对小鼠饮用，给药3个月后，进行Morris水迷宫实验，之后取材进行后续实验。
取40只阿尔兹海默病转基因小鼠分成4组，每组10只。给药前分别称取体重。将黄花蒿提取物ZHW2880溶液灭菌水，配置成3个不同的浓度，每天给药一次，给药3个月后进行Morris水迷宫实验。Morris水迷宫由可移动的站台构成，池壁上有四个等距离的标记点，作为小鼠的入水点，分水池为四个象限。实验过程中水温要保持恒定，温度维持在22～26℃。实验开始前1个小时，将小鼠提前置于放置水迷宫的实验室，使其适应环境。每次水迷宫实验前5天为定位航行实验(place navigation test)，第6天为空间探索实验(spatialprobe test)。定位航行实验时，平台固定放置于其中一个象限中部，距离水面约1cm。每天固定上午某一时刻进行实验，记录小鼠找到平台的时间，即为小鼠的潜伏期。每次实验开始时，所有的小鼠均面朝池壁，从任意的四个象限之一放入水中，每只小鼠进行四次实验，每次游泳时间为60s。若小鼠能在60s内找到平台，则小鼠可在平台上休息10s；若60s内不能找到平台，则有实验人员将小鼠引导至平台，同样休息10s，此时小鼠的潜伏期为60s，通过摄像系统和软件采集系统记录小鼠寻找平台的时间及运动路线。第2，3，4，5天重复上述操作。统计各组小鼠5天定位航行实验中的平均潜伏期作为评判小鼠学习能力的指标。定位航行实验结束24h后，撤出隐藏于水下的站台，进行空间探索实验。
选取离平台较远的点为入水点将小鼠放入水中，记录小鼠在60s内运动轨迹，穿越站台的次数以及小鼠在站台所在象限的停留时间。统计各组小鼠在平台象限的时间百分比，以衡量小鼠的空间定位能力及记忆能力。所有数据的采集和处理均由Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成。
结果如图1所示。图1中显示各组小鼠随着训练时间的延长，小鼠平均逃避潜伏期逐渐下降，表明小鼠经过训练，对水下平台的位置产生了记忆(学习能力)；3xTg AD小鼠的逃避潜伏期显著长于WT小鼠，而给予黄花蒿提取物ZWH2880处理后的小鼠的逃避潜伏期均短于3xTg AD小鼠。空间探索实验说明给予黄花蒿提取物ZWH2880处理后的3xTg AD小鼠的目标象限穿过平台次数高于未给药的3xTg AD小鼠。说明黄花蒿提取物ZWH2880对阿兹海默症模型小鼠有提高学习记忆能力的作用，改善AD小鼠的认知障碍。
不同浓度的黄花蒿对阿尔兹海默病转基因小鼠模型(3xTg AD)脑内淀粉样斑块沉积和的影响
取40只阿尔兹海默病转基因小鼠分成4组，每组10只。给药前分别称取体重，并根据体重计算用药量。每天给药，给药3月后，断头处死小鼠，一半脑组织速冻保存-80℃冰箱保存，用于后续Western Blot实验，另一半脑组织固定，包埋，切片备用。
具体实施方法如下：
免疫荧光染色：
1)处理好的细胞吸掉培养液，用PBS洗1-2次，用4％多聚甲醛(4％PFA)室温固定30min；
2)用PBS洗去4％PFA，加0.2％Tritron透膜，室温30min；
3)用PBS洗去透膜液，加3％BSA，室温封闭1h；
4)加一抗(一抗用1％BSA稀释相应倍数)，于4℃过夜；
5)次日，用清洗液洗3-5次10min，PBS洗3-5次10min，加二抗和DAPI(二抗和DAPI用1％BSA稀释相应倍数)，室温孵育60min；
6)用清洗液洗3-5次10min，PBS洗3-5次10min，加适量PBS，4℃保存，待观察。
Western blot实验：
S1)在每10mL的RIPA蛋白裂解液中加入100μL的PMSF，浓度为100mM；以及加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，充分混匀，置于冰上放置20min备用；
S2)将各组小鼠处死，解剖分离脑组织并去掉嗅球，取出完整无损的大脑；
S3)将小鼠的脑组织在冰上充分剪碎，放入裂解液中，在冰上用研磨棒进行充分的组织匀浆；
S4)12000rpm，4℃，离心15min，获得的上清液即为蛋白提取物，进行Western Blot试验，对β-Amyloid蛋白的表达情况进行检验。
结果如图2所示。图2A中显示的免疫荧光显示各组小鼠脑内淀粉样斑块沉积(AD的重要指征)情况，图2B和图2C中显示的是Western blot显示各组小鼠脑内淀粉样斑块沉积情况，黄花蒿提取物ZWH2880可以减少3xTg AD小鼠海马中Aβ(图中6E10是β-Amyloid的特导抗体，能特异标记Aβ的位置及表达水平)的沉积。并且采用Western Blot对相关蛋白进行了定量分析(图2C)，同样说明黄花蒿提取物ZWH2880可以减少3xTg AD小鼠Aβ的沉积。图2D和图2E显示黄花蒿提取物ZWH2880能降低3xTg AD小鼠海马中Tau的过度磷酸化(AD的另一重要指征)。
上述结果证明黄花蒿提取物ZWH2880能改善改善AD小鼠的认知障碍，逆转的各项病理变化，对AD有较好防治作用。
不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对原代神经元的影响
原代神经元分离培养：为了进一步测试黄花蒿提取物ZWH2880在体外对Aβ毒性的保护作用，从新生的WT小鼠大脑中分离了原代皮层神经元，并在聚D-赖氨酸包被的盖玻片上培养7d接种，然后与2μM Aβ寡聚物一起孵育。同时不使用不同浓度的ZWH2880共培养24小时后，进行免疫荧光染色和MTT实验。
免疫荧光染色：
(1)处理好的细胞吸掉培养液，用PBS洗1-2次，用4％多聚甲醛(4％PFA)室温固定30min；
(2)用PBS洗去4％PFA，加0.2％Tritron透膜，室温30min；
(3)用PBS洗去透膜液，加3％BSA，室温封闭1h；
(4)加一抗(一抗用1％BSA稀释相应倍数)，于4℃过夜；
(5)次日，用清洗液洗3-5次10min，PBS洗3-5次10min，加二抗和DAPI(二抗和DAPI用1％BSA稀释相应倍数)，室温孵育60min；
(6)用清洗液洗3-5次10min，PBS洗3-5次10min，加适量PBS，4℃保存；
(7)待观察。
MTT实验：将培养好的神经元细胞，与2μM Aβ寡聚物一起孵育。同时不使用不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880共培养24小时后，加入MTT在37度孵育4h，去除MTT，每孔加入100μl的DMSO进行显色反应，然后混匀，在酶标仪测OD。
结果如图3所示。显示分离的原代细胞具有神经元的形态特征，表达神经元标记TUJI1(A)，黄花蒿提取物ZWH2880能够抗Aβ毒性，提高原代神经元细胞活力(B)。
不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对神经元抗氧化功能的影响
取培养7天的原代神经元细胞与2μM Aβ寡聚物一起孵育。同时不使用不同浓度的ZWH2880共培养24小时后。检查ROS的水平。
结果如图4所示。对照组ROS含量低于Aβ处理组，用不同浓度ZWH2880处理，ROS水平显著下降。结果说明黄花蒿提取物ZWH2880，能够减少细胞中ROS的累积，从而抑制(抗)ROS引起细胞凋亡。
不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对鼠神经细胞保护作用。
PC12细胞在DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's)培养基中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和100μg/ml链霉素，并保持在37℃和5％CO 2的湿润环境中与2μM Aβ寡聚物一起孵育。同时不使用不同浓度的ZWH2880共培养24小时后，进行免疫荧光染色和MTT实验。此外，用ZWH2880与PC12单独孵育24h，检查ZWH2880对P12细胞毒性作用。
结果如图5所示。说明ZWH2880浓度依赖性地保护神经细胞，且黄花蒿提取物ZWH2880本身对神经细胞没有毒性。
不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对神经细胞内ROS和线粒体膜电位产生的影响
PC12细胞在DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's)培养基中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和100μg/ml链霉素，并保持在37℃和5％CO2的湿润环境中与2μM Aβ寡聚物一起孵育。同时不使用不同浓度的ZWH2880共培养24小时后，检查细胞内ROS水平和细胞膜电位的变化情况。
结果如图6所示。显示黄花蒿提ZWH2880浓度依赖性地逆转Aβ所致线粒体跨膜电位降低，从而抗线粒体损伤导致神经细胞凋亡。黄花蒿提取物ZWH2880浓度依赖性地减少了细胞内的ROS水平，降低ROS引起的细胞神经凋亡。
不同浓度的黄花蒿对细胞内信号通过激活的影响
PC12细胞在DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's)培养基中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和100μg/ml链霉素，并保持在37℃和5％CO2的湿润环境中。收获蒿甲醚预处理或未处理及Aβ1-42诱导及未诱导的各组细胞，加入裂解液中，在冰上研磨获得的上清液进行Western Blot试验。
具体实施方法如下：
1)收集用蒿甲醚处理或未作处理的细胞，用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并在含有新加入的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1X样品裂解缓冲液中冰上裂解细胞；
2)将裂解的细胞以13，000rpm离心15分钟，用于蛋白质定量。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质并转移至PVDF膜；
3)将膜在PBST中的5％脱脂乳中封闭1小时。随后加入一抗，并在4℃温育下过夜；
4)第二天将膜用1X TBST洗涤三次，然后与辣根过氧化物酶缀合的二抗，在室温下孵育1小时，并使用ECL检测试剂盒进行曝光。从而在体外进一步检验对AMPK信号通路相关蛋白的表达情况。
结果如图7所示。表明黄花蒿提取物ZWH2880浓度依赖性地激活MAPK/ERK信号通路，表明黄花蒿提取物ZWH2880可能通过激活AMPK/ERK发挥神经的保护作用。
不同浓度的黄花蒿提取物ZWH2880对人神经细胞保护作用
人胶质母瘤细胞(SY5Y cells)在DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's)培养基中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和100μg/ml链霉素，并保持在37℃和5％CO 2的湿润环境中与2μM Aβ寡聚物一起孵育。同时不使用不同浓度的ZWH2880共培养24小时后，进行免疫荧光染色和MTT实验。此外，用ZWH2880与SY5Y细胞单独孵育24h，检查ZWH2880对SY5Y细胞毒性作用。
结果如图8所示。ZWH2880浓度依赖性地保护神经细胞(A)；而图8B-C结果则表明ZWH2880浓度依赖性减少Aβ诱导的ROS堆积，抑制神经细胞凋亡。结果说明黄花蒿提取物ZWH2880，能够减少SY5Y细胞中ROS的累积，抗ROS引起细胞凋亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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