一种草莓白粉病抗性基因及其应用
阅读说明：本技术 一种草莓白粉病抗性基因及其应用 (Strawberry powdery mildew resistance gene and application thereof ) 是由 张俊祥 史册 王岩 姚晋湘 张志宏 代红艳 于 2021-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种草莓白粉病抗性基因及其应用,属于分子生物学中的基因工程领域。本发明的发明人从森林草莓中克隆了FvMYB46基因,并通过稳定转基因技术证明降低FvMYB46基因表达能够提高草莓对白粉病的抗性,表明FvMYB46负调控草莓白粉病抗性,同时发现FvMYB46是通过负调控PALs基因的表达来增强草莓对白粉病的抗病性。(The invention relates to a strawberry powdery mildew resistance gene and application thereof, belonging to the field of genetic engineering in molecular biology. The inventor clones FvMYB46 gene from forest strawberries, and proves that the resistance of the strawberries to powdery mildew can be improved by reducing the expression of the FvMYB46 gene through a stable transgenic technology, so that the resistance of the strawberries to the powdery mildew is negatively regulated and controlled by FvMYB46, and the fact that the disease resistance of the strawberries to the powdery mildew is enhanced by negatively regulating and controlling the expression of PAL gene is found.)
技术领域
本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种草莓白粉病抗性基因及其应用。
背景技术
草莓白粉病是由羽衣草单囊壳侵染所引起的，菌丝主要分布于叶片两面、叶柄、花、花梗和果实。草莓白粉病具有侵染草莓植株所用时间短，与植株建立寄生关系所需时间短，侵染植株的频率高等特点。草莓白粉病发生过程中主要影响因素有：草莓植株的生长状态和生长环境。植株生长状态不同，白粉病菌侵染效果也不同，研究表明在新叶上的侵染效率要远高于老叶。一般情况下，当环境中相对湿度达80％以上，温度在15～25℃时，草莓植株极易感染白粉病。
MYB转录因子是植物中数量最多的一类转录因子之一，含有由51-52个氨基酸为一个重复组成的高度保守的DNA结合域，大多数的MYB蛋白在N端含有一个MYB结构域，由一段氨基酸残基组成。根据其结构域数量，将MYB家族分为四大类，包括1R-MYB、 R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB蛋白。
MYB转录因子在植物的生长发育和调控中起到重要作用，它们组成了转录因子的一个大家族，其功能研究在模式植物拟南芥中进展较快，而草莓中MYB转录因子家族的功能只有部分得到解析。目前研究表明，MYB46主要在调节木质素合成中起作用，仅在拟南芥和小麦中发现参与调节病害(Vicente et al.,2011；Zheng et al.,2019)，但草莓MYB46编码区序列与拟南芥AtMYB16的相识度为45.81％，与小麦TuMYB46相识度为43.96％；草莓MYB46氨基酸序列与拟南芥AtMYB16的相识度为41.03％，与小麦TuMYB46相识度为40.78％(实施例1)。因此，与拟南芥、小麦MYB46的编码区和氨基酸序列相比，草莓MYB46与拟南芥、小麦MYB46的相识度很低，很难基于拟南芥和小麦MYB46的功能对草莓的功能进行预测和分析。因此，草莓MYB46是否参与白粉病等病害的调控？草莓中MYB46调节病害机理与上述作物是否相同仍不清楚，因此需要将草莓MYB46在草莓中进行功能分析，才能对其功能进行准确判断。
大量的研究表明，培育和种植抗病品种是防治草莓白粉病最经济、有效和安全可靠的途径，而品种的抗病性鉴定、抗源的筛选和抗病新基因挖掘是提高草莓抗病性研究的基础。传统杂交育种耗时长、工作量大，物理、化学、生物等诱变手段很难做到精确定点突变。因此挖掘草莓抗白粉病基因，分析其抗病机理，对于培养抗白粉病草莓新品种具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种草莓白粉病抗性基因及其应用，所述的一种草莓白粉病抗性基因FvMYB46编码氨基酸序列如序列1所示，所述FvMYB46基因编码区核苷酸序列如序列2所示。
本发明提供利用RNAi沉默FvMYB46基因增强了草莓对白粉病菌的抗性。
本发明涉及FvMYB46基因通过负调控PALs基因的表达来增强草莓对白粉病菌的抗病性。
本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：
(1)草莓FvMYB46基因的克隆，并选取其中335bp片段进行干扰载体构建。
提取草莓叶片中的总RNA，然后将RNA反转录成cDNA；
以cDNA为模板，针对FvMYB46基因的保守区段，设计两对特定引物MYB46-RNAi-F1和MYB46-RNAi-R1，在上游引物MYB46-RNAi-F1上引入Xba1酶切位点，下游引 MYB46-RNAi-R1上引入Sal1酶切位点；MYB46-RNAi-F2和MYB46-RNAi-R2，在上游引物MYB46-RNAi-F2上引入Kpn1酶切位点，下游引物MYB46-RNAi-R2上引入Sac1酶切位点；PCR扩增得到引入相应酶切位点的FvMYB46基因的正反向片段；
其中，所述的特定引物是：
MYB46-RNAi-F1：5’-CGCTCTAGATGGTCTCAAATTGCAGCACG-3’
MYB46-RNAi-R1：5’-CGCGTCGACGTTGTAGTACCCGCCATGCT-3’
MYB46-RNAi-F2：5’-CGCGGTACCGTTGTAGTACCCGCCATGCT-3’
MYB46-RNAi-R2：5’-CGCGAGCTCTGGTCTCAAATTGCAGCACG-3’
注：MYB46-RNAi-F1、MYB46-RNAi-R1、MYB46-RNAi-F2和MYB46-RNAi-R2引物序列中前九个碱基，即CGCTCTAGA、CGCGTCGAC、CGCGGTACC和CGCGAGCTC，是保护碱基和酶切位点，是为构建载体而人为引入的碱基，不属于FvMYB46基因序列。
(2)RNAi干扰载体构建：
(a)以重组质粒pMD-T-FvMYB46为模板，以MYB46-RNAi-F1和MYB46-RNAi-R1 为引物,将FvMYB46基因正向片段克隆到pRI101-RNAi载体上；
(b)测序正确后，再以MYB46-RNAi-F2和MYB46-RNAi-R2为引物，将FvMYB46 基因反向片段克隆到成功连接正向片段的pRI101-RNAi载体上，命名为RNAi-FvMYB46。
(3)遗传转化、转基因草莓的培育：提取构建完成的RNAi干扰载体RNAi-FvMYB46质粒DNA，用冻融法转入农杆菌，用叶盘法遗传转化草莓，分子检测获得阳性转基因植株，上述所述的草莓为二倍体森林草莓Ruegen。
(4)白粉病鉴定：选取沈阳农业大学草莓试验基地自然发病的草莓白粉病菌株，使用喷雾法接种，孢子悬浮液浓度为1×106个/mL，分别接种对照以及RNAi-FvMYB46转基因草莓叶片，采用台盼蓝染色的方法鉴定叶片受损情况，发现FvMYB46基因负调控草莓白粉病的抗性。
(5)FvMYB46蛋白对FvPALs基因的调控：通过酵母单杂实验和萤火虫荧光素酶实验发现，FvMYB46负调控PALs基因的表达来增强草莓对白粉病的抗病性。
本发明的有益效果：
1.本发明通过功能分析揭示降低草莓FvMYB46的表达能显著提高草莓对白粉病菌的抗性，为将来通过基因编辑创制抗白粉病草莓新种质奠定了基础。
2.本发明首次发现FvMYB46通过负调控PALs基因的调控白粉病抗性。
附图说明
图1为FvMYB46基因编码区序列的扩增结果。
图2为转基因植株PCR鉴定电泳图；
其中，M：DL2000 Marker；转基因植株及对照植株标注如图所示。
图3RNAi-FvMYB46转基因植株中FvMYB46基因相对表达量
图4为RNAi干扰FvMYB46转基因植株表型。
图5FvMYB46干扰草莓植株白粉病菌的接种及台盼蓝染色观察。
图6草莓FvPALs成员FvPAL1.1和FvPAL1.2基因表达分析。
图7酵母单杂交分析FvMYB46对FvPAL1.1的调控。
图8萤火虫荧光报告试验分析FvMYB46对FvPAL1.1和FvPAL1.2的调控。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂盒生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1：草莓FvMYB46基因的克隆及与拟南芥、小麦MYB46序列的比较分析
(1)草莓FvMYB46基因的克隆
以二倍体森林草莓‘Ruegen’为试材，材料在温室大棚中生长。
RNA提取：用CTAB法进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程按照CTAB法RNA 提取流程，然后再以该总RNA为模板反转录得到cDNA第一链。
基因的克隆：以反转录的果实cDNA第一链为模板，利用引物FvMYB46-F和FvMYB46-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得1008bp的目的片段如图1所示。
FvMYB46-F：GCTCTAGAATGAGGAAGCCGGAACCCTA；
FvMYB46-R：CGGGATCCTCAACTCTGGTAGTCAAGTAAAG。
胶回收目的片段之后，将其连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10(购自北京天根生物技术有限公司)，筛选阳性单菌落，提取质粒，测序序列2所示。
(2)草莓FvMYB46基因与拟南芥、小麦MYB46序列比较分析
草莓MYB46编码区序列与拟南芥AtMYB16的相识度为45.81％，与小麦TuMYB46相识度为43.96％；草莓MYB46氨基酸序列与拟南芥AtMYB16的相识度为41.03％，与小麦TuMYB46相识度为40.78％。
实施例2：RNAi干扰FvMYB46转化森林草莓及其基因功能鉴定
1.植物干扰表达载体RNAi-FvMYB46的构建。
(1)利用Primer Primer 5.0软件分析设计引物并扩增FvMYB46正反片段
MYB46-RNAi-F1：5’-CGCTCTAGATGGTCTCAAATTGCAGCACG-3’
MYB46-RNAi-R1：5’-CGCGTCGACGTTGTAGTACCCGCCATGCT-3’
MYB46-RNAi-F2：5’-CGCGGTACCGTTGTAGTACCCGCCATGCT-3’
MYB46-RNAi-R2：5’-CGCGAGCTCTGGTCTCAAATTGCAGCACG-3’
(2)以PMD-T-FvMYB46为模板，进行PCR反应；
PCR反应体系为：取1μL PMD-T-FvMYB46质粒加入Ex Taq酶0.2μL,10×Ex Buffer2μL, dNTPs(2.5mmol·L-1)1.6μL,正反向引物各0.5μL，最后用水补足到20μL；
PCR反应程序:95 5min；95℃30s,58℃30s,72℃90s,35个循环；72℃延伸7min，4℃保存；产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(3)使用核酸纯化试剂盒(Takara公司)进行回收。
(4)回收后，使用XbaⅠ和SalⅠ限制性内切酶将回收的PCR产物与pRI101-RNAi载体上分别酶切，酶切后再次进行纯化回收，之后再载体进行连接。
PCR反应体系为：取7μL回收的PCR产物，1μL T4 DNA连接酶，10×T4 DNA连接酶Buffer 1μL，T4载体1μL；
PCR反应程序：16℃连接16h；
(5)进行大肠杆菌转化,在含Amp(60μg·mL-1)的LB培养基平板上，37℃培养12-16h。挑取单个白色克隆,分别涂布于新的含有Amp(60μg·mL-1)的LB培养基平板上(二转),37℃培养12-16h,之后进行菌落PCR扩增。将验证正确的菌株培养后,送苏州金唯智公司测序，测序正确，命名为RNAi-FvMYB46-正。
(6)以MYB46-RNAi-F2和MYB46-RNAi-R2为引物，以PMD-T-FvMYB46为模板，进行PCR反应，使用KpnⅠ和SacⅠ限制性内切酶将回收的PCR产物与RNAi-FvMYB46- 正载体分别酶切，酶切后再次进行纯化回收，之后经载体连接，载体连接完成后，进行大肠杆菌转化、菌落PCR验证、重组质粒提取，提取之后标注好名称，交由生工生物有限公司进行检验，使用DNAMAN软件进行分析，分析结果正确后即获得RNAi-FvMYB46重组载体。
2.RNAi干扰FvMYB46转化森林草莓及其基因功能鉴定
(1)农杆菌的转化
将RNAi-FvMYB46质粒导入农杆菌GV3101中，具体操作步骤如下：
(a)从超低温冰箱中取出两管GV3101农杆菌感受态，放置在冰上，静置3min，打开水浴锅，将温度设置为37℃，吸取RNAi-FvMYB46质粒10μl加入农杆菌感受态中，冰上静置10min。
(b)静置完成后，放入液氮中，快速冷冻1min。
(c)冷冻结束后，将其快速放入37℃水浴锅中，热激5min。
(d)热激完成后，转移到冰上静置2min。在超净工作台中，向离心管中加入900μlYEP 液体培养基(配方见附录)，用封口膜将离心管管口密封，放置在28℃恒温震荡培养箱中，震荡培养5h，培养箱设置为180rpm/min。
(e)震荡培养结束后，离心5min收集菌体，离心机设置转速为5000rpm/min。
(f)在超净工作台中，保留100μl上清液，将菌体悬浮起来，混合均匀后涂到YEP固体培养基(配方见附录)上，倒置于28℃恒温培养箱培养中培养2-3d。待其长出饱满单菌落，对其进行PCR验证。
(2)农杆菌介导草莓遗传转化
(a)侵染菌液的制备
取灭菌的150mL三角瓶，加入50mL YEP液体培养基、400μl利福平(25mg/L)和25μl卡那霉素(100mg/L)，瓶身标注名称，加入验证正确的菌体，放置在28℃恒温震荡培养箱内，充分震荡培养8-12h，直到菌液颜色变成橙色，并且浑浊无杂质。留下2mL菌液，重新加入50mL YEP液体培养基，继续放在28℃恒温震荡培养箱培养5h左右，使用分光光度计测量其OD600在0.5左右，此时可以收集菌体，将菌体转移到50mL离心管中，设置离心机转速为5500rpm/min，然后离心5min，在超级工作台中倒掉上清液，用灭菌后的 MS悬浮液重新悬浮菌体，使用分光光度计测定其OD600在0.4-0.6之间，此时将悬浮液放置在一旁备用。
(b)侵染外植体
剪取颜色绿，状态良好的二倍体‘Ruegen’组培草莓苗叶片，修剪为2-4mm的小方块，修剪好的外植体迅速放入液体共培养中，避免萎蔫，叶片全部修剪完毕后，将液体共培养倒掉，把叶片转移到灭菌的100mL小三角瓶中，在配制好的悬浮液中加入乙酰丁香酮，上下颠倒混匀后倒入小三角瓶中(此过程要迅速)，浸泡外植体8min，每2min摇晃震荡一次，使菌液充分接触外植体伤口。浸泡完成后，倒掉菌液，用镊子将叶片转移到滤纸上，吸干菌液，将叶片叶背朝上，均匀放置在固体共培养基(添加滤纸)上。
(c)外植体的培养
固体共培养：放置在黑暗条件下，温度设置为22-25℃，培养3d。
推迟培养：固体共培养培养3d后，更换到推迟培养基上，反转叶片使其叶背朝下，均匀的铺在推迟培养基上，放置在黑暗条件下，温度22-25℃，培养4d。
选择培养：推迟培养基培养4d后，换到选择培养基上，叶背朝下，均匀的铺在选择培养基上，放置在黑暗条件下，温度22-25℃，直到观察到外植体长出饱满黄绿色愈伤之后，将有愈伤的外植体转移到光下，温度22-25℃，促进外植体抽生不定芽。
分化培养：当选择培养基中不定芽长成小植株后，标注好株系名称，将小植株转移到分化培养基中进行分化培养，使其数量快速增多。
(3)PCR鉴定及基因功能初步鉴定:
(a)待抗性苗长至7-8片叶，提取草莓转基因植株幼嫩叶片DNA(CTAB法)，以清水和‘Ruegen’草莓植株作为阴性对照，RNAi-FvMYB46质粒作为阳性对照，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验，结果如图2所示，转基因植株出现了315bp片段，而对照植株没有，说明草莓FvMYB46沉默载体成功导入草莓中。
(b)待抗性苗长至7-8片叶，提取草莓转基因植株幼嫩叶片RNA，进行RT-PCR检测目的基因是否转入
上游引物:5'-GCCGGAACCCTATGCTGTAA-3',
下游引物:5'-GATCCAACGAAGCCTGCAAC-3',
结果如图3所示，从图3可见,转基因植株出现了350bp片段，而对照植株没有，说明草莓FvMYB46沉默载体成功导入草莓中。
(4)对转基因草莓表型观察
通过观察发现，转基因植株与对照植株相比，植株茎颜色相比于对照更红(图5)，但花、叶片大小和株高均无明显变化(图4)。
实施例3：FvMYB46干扰草莓植株白粉病菌的接种及台盼蓝染色观察
选取沈阳农业大学草莓试验基地自然发病的草莓白粉病叶片，去除表面杂质，用小号毛刷将白粉病孢子刷入干净的无菌水中，使用血球计数板计算孢子悬浮液浓度为1×106个/mL，使用手持型喷雾器将孢子悬浮液均匀喷洒在对照以及RNAi-FvMYB46三个株系的转基因草莓叶片上，保证叶片表面布满孢子悬浮液，接种后至于人工气候培养箱中，保持夜晚温度 18摄氏度，白天温度25摄氏度左右，相对湿度85％。10d后观察植株状况如下图5所示。相比于对照RNAi-FvMYB46三个株系的转基因草莓叶片上白粉病菌孢子不明显，之后采用台盼蓝染色的方法观察对照以及RNAi-FvMYB46三个株系的转基因草莓叶片受损情况，发现相比于对照RNAi-FvMYB46三个株系的转基因草莓叶片蓝色较浅，说明叶片受损伤没有对照严重，以上结果表明FvMYB46基因负调控草莓白粉病的抗性。
实施例4：FvMYB46蛋白对FvPALs基因的调控分析
1.草莓FvPALs成员FvPAL1.1和FvPAL1.2基因表达分析
为了验证FvMYB46对FvPAL1.1和FvPAL1.2的调控作用，通过实时荧光定量PCR对FvPAL1.1及FvPAL1.2基因在对照植株以及干扰转基因植株中的表达量进行测定。相比于对照，FvPAL1.1和FvPAL1.2基因在干扰转基因植株中，相对表达量均升高(图6)。在接种白粉病菌之后，FvPAL1.1和FvPAL1.2基因的表达量相比于对照都升高(图6)。以上实验说明，FvMYB46负调控FvPAL1.1和FvPAL1.2的表达，并且FvPAL1.1和FvPAL1.2受白粉病诱导。
2.酵母单杂交分析FvMYB46对FvPAL1.1的调控
为了验证FvMYB46是否能够结合到FvPAL1.1的启动子上，进行了酵母单杂交试验。先将pAbAi-proFvPAL1.1导入酵母细胞中，在SD/-Ura培养基上培养，筛选出ABA浓度150ug/L。之后将pGAD424-FvMYB46载体导入pAbAi-pro PAL1.1载体构建的酵母感受态中，完成两次酵母转化的酵母菌在150ug/L AbA的SD/-Leu培养基上能够生长。发现在加有AbA的SD/-Leu培养基上，作为阴性对照的pGAD424空载不能生长，而导入 pGAD424-FvMYB46的酵母细胞可以正常生长(图7)，结果表明FvMYB46本身能够结合到FvPAL1.1的启动子上，从而增强植株对白粉病的抗性。
3.萤火虫荧光报告试验分析FvMYB46对FvPAL1.1和FvPAL1.2的调控
FvMYB46可以结合到FvPAL1.1的启动子上，为了进一步验证，FvMYB46与PALs的调控关系，利用烟草的瞬时表达技术进一步分析FvMYB46对PALs基因表达的影响。将 pRI101-AN-FvMYB46作为本试验中的效应子。同时将pGreenII0800-LUC-proFvPAL1.1和pGreenII0800-LUC-proFvPAL1.2，作为本试验中的报告子，结果表明： pGreenII0800-LUC+pRI101空载体组合作为阴性对照荧光信号弱，FvMYB46转录因子与 proFvPAL1.1启动子参与的组合荧光较弱，没有FvMYB46转录因子参与的组合荧光较强(图 8)。说明FvMYB46转录因子负调控FvPAL1.1基因的表达。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 一种草莓白粉病抗性基因及其应用
<130> 2
<141> 2021-07-02
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 335
<212> PRT
<213> 森林草莓(Fragaria vesca)
<400> 1
Met Arg Lys Pro Glu Pro Tyr Ala Val Ser Asn Thr Gly Gly Lys Asn
1 5 10 15
Asn Lys Asn Asn Ser Gly Met Ser Ser Asn Asn Lys Leu Arg Lys Gly
20 25 30
Leu Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Lys Leu Met Arg Tyr Met Leu Asn
35 40 45
Asn Gly Gln Gly Cys Trp Ser Asp Val Ala Arg Asn Ala Gly Leu Glu
50 55 60
Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro
65 70 75 80
Asp Leu Lys Arg Gly Ala Phe Ser Pro Gln Glu Glu Asp Leu Ile Ile
85 90 95
His Phe His Ser Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Gln Ile Ala Ala Arg
100 105 110
Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Phe Trp Asn Ser Thr
115 120 125
Ile Lys Lys Arg Leu Lys Ile Leu Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Ser
130 135 140
Pro Asn Ala Ser Asp Ser Ser Ser Glu Gln Pro Asn Asn Asn Asp Phe
145 150 155 160
Phe Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Phe Met Asn Ile Ile Pro Pro
165 170 175
Ser Met Met Pro Ile Tyr Pro Asp Ser Ser Met Gln Ala Thr Ser Leu
180 185 190
Ile Asn His Met Phe Asp Pro Phe Pro Met Val Glu His Gly Gly Tyr
195 200 205
Tyr Asn Asn Gly Asn Pro Cys Thr Ala Gln Ile Gly Ser Val Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Ser Thr Gly Asp Asp Cys Gly Phe Gly Gln Asn Ile Asp Val
225 230 235 240
Phe Gly Asn Val Asn Met Arg Val Glu Glu Asp Ile Tyr Val Pro Pro
245 250 255
Leu Glu Ser Val Ser Thr Ile Asp His Asp Gln Asn Asn Leu Lys Thr
260 265 270
Glu Thr Ile Phe Tyr Asp His Asn Asn Tyr Tyr Ser Asn Thr Asn Asn
275 280 285
Ile Ile Lys Gly Glu Asn Met Ile Gly Val Gly Asn Tyr Phe Glu Asp
290 295 300
Asp His Gln Asp Gln Gly Leu Thr Met Gly Glu Trp Asp Leu Glu Asp
305 310 315 320
Leu Met Lys Asp Val Ser Ser Phe Pro Leu Leu Asp Tyr Gln Ser
325 330 335
<210> 2
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
atgaggaagc cggaacccta tgctgtaagt aataccggcg ggaagaataa caagaacaac 60
agcggcatga gtagtaataa taagctgagg aagggtttgt ggtcgccgga agaagacgag 120
aagctgatga ggtacatgct caacaatggc caaggctgct ggagcgacgt ggcgagaaat 180
gctggccttg agaggtgcgg aaagagttgc aggcttcgtt ggatcaatta cttgagacct 240
gaccttaaga gaggtgcctt ttctccccaa gaagaagacc tcatcatcca tttccattcc 300
cttcttggca acaggtggtc tcaaattgca gcacgcttgc caggacgaac tgataacgaa 360
atcaagaact tctggaattc gaccataaag aaacgtctaa aaattctgtc ctcctcctcc 420
tccactgcct caccaaacgc gagtgattct tcctcggagc agcctaacaa caatgacttc 480
ttcgccgcgg ccggaggagg aggagggttc atgaacatca ttccaccgtc aatgatgccc 540
atttaccctg attcatcaat gcaagccacc tccctgatca accacatgtt tgatcccttt 600
ccgatggtcg agcatggcgg gtactacaac aatggaaacc catgcactgc tcagattggt 660
tcggtcggca gtggtagcag tactggtgat gattgtggct ttggacaaaa tattgacgtg 720
tttgggaacg tcaatatgag agtagaagaa gacatctatg tgcctcccct agagagcgta 780
agcaccattg accacgatca aaataatctc aaaactgaaa cgatcttcta tgatcataac 840
aattactaca gtaacactaa caatatcatc aagggtgaaa acatgattgg ggttgggaat 900
tactttgaag atgatcatca ggatcaaggg ttaacaatgg gggagtggga cttggaggat 960
ctgatgaaag atgtttcctc ctttccttta cttgactacc agagttga 1008