一种检测碱性磷酸酶的生物传感器及其检测方法和应用
阅读说明：本技术 一种检测碱性磷酸酶的生物传感器及其检测方法和应用 (Biosensor for detecting alkaline phosphatase, detection method and application thereof ) 是由 张春阳 王黎娟 刘昊 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及检测分析技术领域,具体涉及一种检测碱性磷酸酶的生物传感器及其检测方法和应用,所述传感器包括DNA探针,末端脱氧核苷酸转移酶TdT和2'-脱氧胸苷-5'-三磷酸dTTPs。本发明的生物传感器及检测方法具有良好的特异性和高灵敏度,由于ALP催化去磷酸化和TdT介导的无模板聚合的高特异性,3'端修复驱动的poly-A MBs树突状自组装具有很高的扩增效率,以及无模板TdT辅助poly-A MBs延伸、组装和激活的方式非常容易,可以在等温条件下一步快速实现,只需一个DNA探针(即poly-A MB),且poly-A MB的延伸、组装和活化只需一个工具酶(即不依赖模板的TdT)即可完成；可以评价动力学参数,筛选潜在抑制剂,估算细胞抑制效应,甚至可以测定人类血清样本中的碱性磷酸酶,用于临床试验。(The invention relates to the technical field of detection and analysis, in particular to a biosensor for detecting alkaline phosphatase, a detection method and application thereof, wherein the biosensor comprises a DNA probe, terminal deoxynucleotidyl transferase TdT and 2 '-deoxythymidine-5' -triphosphate dTTPs. The biosensor and the detection method have good specificity and high sensitivity, because ALP catalyzes dephosphorylation and TdT mediated template-free polymerization has high specificity, the dendritic self-assembly of poly-A MBs driven by 3' end repair has high amplification efficiency, and the mode of template-free TdT assisted extension, assembly and activation of poly-A MBs is very easy, the biosensor and the detection method can be quickly realized in one step under isothermal conditions, only one DNA probe (namely poly-A MB) is needed, and the extension, assembly and activation of poly-A MB can be completed only by one tool enzyme (namely TdT independent of the template); kinetic parameters can be evaluated, potential inhibitors can be screened, cytostatic effects can be estimated, and even alkaline phosphatase in human serum samples can be assayed for clinical trials.)
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，具体涉及一种检测碱性磷酸酶的生物传感器及其检测方法和应用。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。碱性磷酸酶(ALP)是存在于人体所有组织中的一种必需的磷酸水解酶，它可以催化核酸、蛋白质、碳水化合物等多种生物分子中的磷酸基团的水解。在多种生物过程(如细胞分裂、增殖、凋亡和信号转导)的调节中发挥重要作用。成人正常人血清中ALP水平为40-190U/L,高于或低于正常阈值可诱发多种人类疾病(如骨病、心血管病、炎症性疾病)，和癌症(如口腔癌、前列腺癌、肝癌)。更重要的是，由于ALP具有催化活性高、底物特异性广、稳定性好、成本低的优点，被广泛应用于生物分子监测、组织化学染色和基因表达分析等领域。因此，建立简便、特异、灵敏、可靠的检测碱性磷酸酶活性的方法，对生物医学研究、临床诊断和肿瘤治疗具有重要意义。
鉴于碱性磷酸酶在生物学和临床研究中的重要作用，人们大力发展对碱性磷酸酶的分析研究。传统的检测ALP的方法有比色法、电化学、表面增强共振拉曼散射(SERRS)和荧光法。比色法采用TiO2纳米颗粒(NPs)或G20-Cu(II)催化过氧化氢氧化3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，生成彩色的oxTMB，实现了对ALP的可视化检测，但它们纳米材料的制备耗时较长。电化学方法是通过ALP去磷酸化二茂铁苯基磷酸盐来释放二茂铁胺，从而实现对ALP的比率检测，但它需要费力的固定抗体和重复的洗涤步骤。SERRS法是通过ALP催化5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)合成靛蓝染料衍生物，但不可避免地需要复杂的操作和昂贵的光谱仪。荧光法由于操作简单、灵敏度高的优点，近年来受到越来越多的关注，经常被用于碱性磷酸酶的测定。目前报道的荧光分析法主要分为纳米材料法和合成化学探针法。在基于纳米材料的荧光分析中，常用碳点、石墨烯量子点、量子点、铜纳米粒子、银纳米团簇来监测ALP诱导的荧光变化。在基于合成化学探针的荧光分析中，三甲胺乙内酯修饰的聚乙烯亚胺、moc-K(FITC)FFYp、聚集诱导发射(AIE)荧光素、双光子荧光探针、四聚二烯探针都用于ALP的定量检测。然而，这些荧光分析方法合成复杂、表征费力，而且受到许多因素的干扰(如荧光光漂白、激发强度、发射收集效率和介质极性)，限制了其实际应用。值得注意的是，目前开发的检测ALP的方法大部分仅仅依靠ALP的催化反应进行信号读出，简单但缺乏信号放大策略，灵敏度较差。因此，建立一套新颖、功能强大、简单、特异、灵敏的检测碱性磷酸酶的系统，用于各种诊断和治疗是非常必要的。
近年来，DNA以沃森-克里克双螺旋结构编码独特的结构信息(即可预测的结构、可编程的序列和精确的分子长度(0.34nm bp-1)，已成为分子构建块的标志性生物材料。并在一个新兴领域被称为“超分子DNA组装”，以产生更高阶的功能纳米结构(例如，DNA树突状分子、DNA四面体和DNA纳米线)。由于DNA具有高度的可定制性、空间寻址性和优良的生物相容性，它可以为设计用于传感、计算和驱动的设备提供一个通用的平台，在生物、化学和物理科学中有着广泛的应用。然而，DNA纳米结构的构建通常是基于大量支架的识别、组装和消耗，使得探针设计、构象动态和传感系统更加复杂、昂贵、费时。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测碱性磷酸酶的生物传感器及其检测方法和应用，利用TdT的独特性和分子信标(MB)的内在优势，首次证明了poly-A MBs的3'-末端修复驱动的树突状纳米组装的可行性，并将其用于人血清中ALP的一步定量；本发明中设计了一个3'-磷酸化的分子信标，将poly-A嵌入环中(即poly-A MB)，它既是ALP的催化底物，也是树突状DNA纳米结构的构建模板。ALP的存在可以催化poly-A MBs的去磷酸化，诱导TdT介导的无模板聚合，产生长链的聚胸苷(T)序列，poly-T链可以作为锚定模板与游离的poly-A MBs杂化，导致FAM-BHQ1对解离，链上所有3'-羟基化的poly-A MBs都可以通过TdT连续延伸，产生分支的poly-T链，导致更多游离的poly-A MBs杂化，使得更多的FAM-BHQ1对解离，poly-A MBs经过多轮延伸、组装和活化，形成了树突状的DNA纳米结构，使得大量荧光团从FAM-BHQ1对中解离，产生指数放大的荧光信号。本发明的生物传感器对检测碱性磷酸酶具有良好的特异性和高灵敏度，并且在等温条件下仅需一个DNA探针(即poly-A MB)就能快速实现，且poly-A MB的延伸、组装和活化只需一个工具酶(即不依赖模板的TdT)即可实现，在生物化学和临床研究中具有巨大的应用前景。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一种检测碱性磷酸酶的生物传感器，所述传感器包括DNA探针(即poly-A MB)，末端脱氧核苷酸转移酶TdT和2'-脱氧胸苷-5'-三磷酸dTTPs；
在一种或多种实施方式中，所述DNA探针的核苷酸序列为：5′-CGA TGC AGA AAAAAA AAA AAA AAA AAA ACT GCA TCG-P-3′(“P”表示修饰的磷酸基团，斜体的“C”和“T”表示修饰了淬灭分子BHQ1和荧光分子FAM)；
所述DNA探针是聚腺嘌呤(A)嵌入分子信标poly-A MB，像常见的MB一样，是环状的并且标记有荧光团(FAM)和猝灭团(BHQ1)，但当修改为3'-PO4末端和将多聚腺苷酸嵌入到环状结构中时，它既可以充当ALP的催化底物，树突DNA纳米结构的基本构成要素，又可以作为有效荧光信号的发生器。
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是一种不依赖模板的修复聚合酶，它可以催化单核核苷酸随机合并到单链DNA(ssDNA)片段的3'-羟基(OH)末端，促进了多功能传感策略的制造。
在一种或多种实施方式中，所述传感器还包括CoCl2和缓冲液，优选的，所述缓冲液包括CutSmart缓冲液和TdT反应缓冲液。
在本发明的第二方面，提供一种碱性磷酸酶的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
将DNA探针poly-A MB加入到含有不同浓度的ALP、TdT、dTTPs、CoCl2和缓冲液的反应体系中，在一定温度下孵育，进行ALP催化的去磷酸化和随后的无模板TdT辅助的poly-AMBs树枝状自组装。
在一种或多种实施方式中，所述孵育为在36-38℃下孵育60～65分钟，优选为37℃下孵育60分钟；本发明中的检测方法只需要在等温条件下一步快速实现，对碱性磷酸酶的检测更加方便快捷。
在一种或多种实施方式中，所述DNA探针的核苷酸序列为：5′-CGA TGC AGA AAAAAA AAA AAA AAA AAAACT GCA TCG-P-3′(“P”表示修饰的磷酸基团,斜体的“C”和“T”表示修饰了淬灭分子BHQ1和荧光分子FAM)；
在一种或多种实施方式中，所述DNA探针的制备方法为：合成的寡核苷酸用1×Tris-EDTA缓冲液稀释，制备原液；用杂交缓冲液(10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，pH 8.0)将poly-A MBs稀释至10μM，95℃孵育5min，缓慢冷却至室温，以获得完美的折叠发夹结构。
在一种或多种实施方式中，poly-A MB的浓度为：400-500nM；
在一种或多种实施方式中，TdT的浓度为：35-45U；
在一种或多种实施方式中，dTTPs的浓度为：164-168μM；
在一种或多种实施方式中，CoCl2的浓度为：0.2-0.3mM；
在一种或多种实施方式中，所述缓冲液包括CutSmart缓冲液和TdT反应缓冲液，进一步的，所述CutSmart缓冲液的浓度为：1×CutSmart缓冲液(10mM Mg(AC)2,50mM KAC,20mM Tris-Ac,0.1mg/mL BSA,pH 7.9)；所述TdT反应缓冲液的浓度为：1×TdT反应缓冲液(10mM Mg(Ac)2,50mM potassium acetate,20mM Tris-Ac,pH 7.9)。
在本发明的第三方面，提供一种第一方面所述生物传感器或第二方面所述检测方法在碱性磷酸酶检测中的应用。
本发明的
具体实施方式
具有以下有益效果：
本发明的生物传感器及检测方法具有良好的特异性和高灵敏度，由于ALP催化去磷酸化和TdT介导的无模板聚合的高特异性，3'端修复驱动的poly-A MBs树突状自组装具有很高的扩增效率，以及无模板TdT辅助poly-A MBs延伸、组装和激活的方式非常容易，使得该方法具有良好的特异性和高灵敏度，检测限为3.2×10-7U/μL，甚至可以在单细胞水平定量ALP；
DNA探针设计巧妙，可实现对ALP进行简单方便的检测，为各种磷酸酶的监测提供了一个简单、方便和稳定的平台，在生物化学研究、临床诊断、药物发现和癌症治疗等方面具有巨大的应用潜力；ALP催化去磷酸化和TdT介导的无模板聚合的高特异性，3'端修复驱动的poly-A MBs树突状自组装的高扩增效率，以及无模板TdT辅助的poly-A MBs延伸、组装和激活方式非常容易；
可以在等温条件下一步快速实现，只需一个DNA探针(即poly-A MB)，且poly-A MB的延伸、组装和活化只需一个工具酶(即不依赖模板的TdT)即可完成；
可以评价动力学参数，筛选潜在抑制剂，估算细胞抑制效应，甚至可以测定人类血清样本中的碱性磷酸酶，用于临床试验。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1.用于一步定量人血清中ALP的3'端修复驱动的poly-A分子信标的树突状纳米组装示意图。
图2为本发明可行性实验的凝胶电泳和荧光实验的可行性验证图；
其中，图2A为琼脂糖凝胶电泳分析图，Lane M，DNA标记；lane 1，合成poly-A MB；lane 2，poly-A MB+TdT；lane 3，poly-A MB+TdT+ALP。ALP的浓度为5×10-3U/μL；
图2B为通过测量FAM发射光谱对ALP的响应进行的荧光实验效果图；
图2B中的三条曲线从上至下分别为：poly-A MB+TdT+ALP、poly-A MB+ALP和poly-A MB+TdT存在下的荧光效果，ALP浓度为2.5×10-3U/μL；
在2A和2B中，TdT的浓度为40U，poly-A MB的浓度为600nM。
图3为本发明灵敏度检测实验数据图；
其中，图3A为荧光发射光谱对不同浓度ALP的响应变化；
图3A中曲线从上至下分别为：5×10-3U/μL；2.5×10-3U/μL；1.5×10-3U/μL；1×10- 3U/μL；5×10-4U/μL；2.5×10-4U/μL；1×10-4U/μL；5×10-5U/μL；2.5×10-5U/μL；1×10-5U/μL；5×10-6U/μL；2.5×10-6U/μL；1×10-6U/μL；5×10-7U/μL；control；
图3B为荧光强度随ALP浓度的变化图；在5×10-7-1×10-3U/μL范围内，荧光强度与ALP浓度对数值呈线性关系；图3B中的小图为：荧光强度与ALP浓度的对数之间的线性关系图。
图4为特异性检测实验数据图，图4中各柱状图对应不同的酶测出的荧光强度，分别为对照组(只有反应缓冲溶液)，0.1g/L BSA，0.1g/L PP，2.5×10-3U/μL胰蛋白酶，2.5×10-3U/μL，2.5×103U/μL hOGG1，2.5×10-3U/μL M.SssI和2.5×10-3U/μLALP。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1
ALP催化的去磷酸化和随后的不依赖模板的TdT辅助的Poly-A MBs树枝状自组装。
所有寡核苷酸用1×Tris-EDTA缓冲液稀释，制备原液。用杂交缓冲液(10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，pH 8.0)将poly-A MBs稀释至10μM，95℃孵育5min，缓慢冷却至室温，以获得完美的折叠发夹结构。然后将0.9μL的450nM poly-A MBs加入到含有不同浓度的ALP、3μL 10×CutSmart缓冲液、40U TdT、3μL 10×TdT reaction buffer、3μL 10×CoCl2和166μM dTTPs的30μL反应体系中，在37℃孵育60分钟，进行脱磷酸化控制的无模板TdT辅助的poly-A MBs树枝状自组装。
凝胶电泳分析和荧光测量：为了研究脱磷酸化和无模板TdT辅助的poly-A MBs树枝状自组装的反应产物。我们采用3％琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲液(40mM Tris-Ac,1mMEDTA,pH 8.0)中对30μL反应产物进行分析。在110V电泳40分钟后，凝胶由ChemiDoc MP成像系统(Hercules,California,USA)直接显示。荧光测定时，将30μL反应产物用超纯水稀释至最终体积60μL。FAM荧光由HitachiF-7000荧光分光光度计(东京，日本)测量，激发波长为488nm，在500-650nm波长范围内测量了发射光谱，狭缝宽度为5nm，并记录了520nm发射波长处的荧光强度，用于数据分析。
碱性磷酸酶测定原理：3'端修复驱动的poly-A分子信标的树突状纳米组装原理如图1所示。在本发明中，只巧妙地设计了一种功能性的寡核苷酸探针，即DNA探针，称为聚腺嘌呤(A)嵌入分子信标(即poly-A MB)。像常见的MB，poly-A MB是环状的并且标记的荧光团(FAM)和猝灭团(BHQ1)相互封闭，但当修改为3'-PO4末端和将多聚腺苷酸嵌入到环状结构中时，它即可以充当ALP的催化底物，树突DNA纳米结构的基本构成要素，又可以作为有效荧光信号的发生器。由于FAM和BHQ1之间的荧光共振能量转移(FRET)，poly-A MB是不活跃和自猝灭的。本发明的生物传感器及检测方法检测ALP包括两个连续步骤：(1)ALP催化的poly-A MB的3'-末端去磷酸化，将3'-PO4基团转化为3'-OH基团；(2)无模板TdT辅助的树枝状poly-A MB的自组装伴随着高效的荧光恢复。在ALP存在下，poly-A MB在3'-末端发生脱磷酸化，从3'-PO4基团水解成3'-OH基团；所得到的3'-羟基化的poly-A MB将作为TdT的有效引物，通过在3'-OH末端重复添加2'-脱氧胸苷-5'-三磷酸(dTTPs)来诱导无模板聚合延伸，从而产生一个长链的多胸苷(T)序列。重要的是，由于poly-A MB与多聚腺苷酸由循环设计，长poly-T链可以作为一个锚定模板和许多游离的poly-A MBs杂交，导致环状结构打开和FAM-BHQ1对的解离，恢复荧光信号(第一次信号放大阶段)；此外，这条链上的所有3'-羟基化poly-A MBs都可以通过无模板TdT的连续聚合延伸，产生大量的支链长poly-T链，导致更多游离的poly-A MBs杂交和更多的FAM-BHQ1 FRET对的解离，从而诱导恢复高荧光信号(第二次放大阶段)；通过多轮的延伸、组装和活化poly-A MBs，树突状DNA纳米结构自动形成，导致大量荧光团分子(即FAM)从FAM-BHQ1 FRET对中解离，从而产生指数放大的荧光信号(第n个放大阶段)。相比之下，在没有ALP的情况下，没有poly-A MBs在3'端被脱磷酸化，不能诱导无模板TdT辅助的poly-AMBs的树枝状自组装，因此没有荧光团分子从FAM-BHQ1FRET对中解离，也没有观察到荧光信号。
与先前报道的ALP检测方法相比，该方法具有明显的优势：(1)3'端修复驱动的poly-A MBs树突状纳米组装可以诱导指数信号放大，具有较高的灵敏度；(2)ALP催化的特异性核酸去磷酸化和TdT介导的无模板聚合可抑制非特异性扩增，具有较高的特异性；(3)该方法只需一个poly-A MB探针，即可快速、等温地完成，且poly-A MB易于延伸、组装和激活，仅需一个不依赖模板的TdT酶，简化了实验操作。
(1)可行性实验：
为了研究这一策略的可行性，我们进行了凝胶电泳和荧光实验。如图2A所示，使用3％琼脂糖凝胶分析不同条件下的反应产物。在没有ALP的情况下，只观察到一个36-nt条带(图2A，第2道)，这与合成的poly-A MB的大小一致(图2A，第1道)，表明poly-AMB的去磷酸化和随后的TdT介导的无模板聚合没有发生。而在ALP存在的情况下，可以清晰地观察到多个条带(>36nt)呈阶梯状(图2A,lane 3)，这表明ALP的存在使poly-A MBs去磷酸化，并成功启动TdT介导的无模板聚合，诱导树枝状自组装poly-A MBs生成不同大小的DNA纳米结构(即>36nt带)。此外，我们通过测量FAM发射光谱对ALP的响应进行了荧光实验。如图2B所示，poly-A MB+TdT和poly-A MB+ALP存在时，只检测到非常低的背景荧光信号(图2B)。当poly-A MB+TdT+ALP存在时，检测到一个显著的荧光信号(图2B)，比没有ALP或TdT的对照组高出15.2倍和12.5倍。这表明，只有ALP的存在才能启动去磷酸化控制的无模板TdT辅助的poly-A MBs的树突状自组装，从而使大量荧光团分子从FAM-BHQ1 FRET对中解离，产生显著的荧光信号。这些结果清楚地表明，所提出的策略可以用于ALP的高灵敏检测。
(2)灵敏度检测
碱性磷酸酶测定的灵敏度和选择性。为了用所提出方法的检测灵敏度，我们优化了反应条件，包括反应时间，poly-A MB，TdT和dTTPs的量，在最佳的实验条件下，我们通过测量不同浓度ALP响应的荧光强度来考察该策略的灵敏度(图3)。如图3A所示，随着ALP浓度从5×10-7增加到5×10-3U/μL，荧光强度逐渐增强，浓度在2.5×10-3U/μL以上时达到平台。值得注意的是，在5×10-7到1×10-3U/μL 4个数量级的动态范围内，荧光强度与ALP浓度的对数之间具有良好的线性关系(图3B)。相关方程为F＝1688.5+248.2 log10 C，相关系数为0.9996，其中F为荧光强度，C为ALP浓度。以平均对照值加三倍标准差计算出检出限为3.2×10-7U/μL。该方法的灵敏度比通过激基分子/单体转化基于甜菜碱改性聚乙烯亚胺的荧光方法高312.5倍(1×10-4U/μL)，比基于酶水解凝胶诱导的溶胶-凝胶转变的荧光法高187.5倍(6×10-5U/μL)，与基于碳点去磷酸化定向聚集和解聚的荧光方法相差不大(1.4×10-6U/μL)。灵敏度的提高可归因于三个因素：(1)ALP催化去磷酸化和TdT介导的无模板聚合的高特异性，使poly-A MBs高效羟基化，并随后聚合长poly-T链；(2)3'端修复驱动的poly-A MBs树突状自组装的高放大效率使得少量ALP可转化为指数放大的FAM荧光信号；(3)无模板聚合方式促进了poly-AMBs的延伸、组装和活化。
(3)特异性检测
ALP与许多酶同源，具有一定的重叠催化特性和底物特异性。以牛血清白蛋白(BSA)、蛋白磷酸酶(PP)、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶(GO)、人8-氧鸟嘌呤-DNA糖基化酶(hOGG1)和CpG甲基转移酶(M.SssI)为阴性对照，评价该策略的选择性。如图4所示，在相同的条件下，在BSA、PP、胰蛋白酶trypsin、GO、hOGG1和M.SssI存在时，只能观察到非常低的荧光信号。与仅使用反应缓冲溶液做对照获得的荧光信号相比，没有明显的差别。相比之下，ALP存在时的荧光信号，分别是BSA、胰蛋白酶、GO、hOGG1、M.SssI、PP和对照反应时的11.2、10.7、12.4、12.2、12.2和17.0倍。这表明只有ALP能特异性地在3'端脱磷，从而启动无模板TdT辅助的poly-AMBs的树枝状自组装，同时高效地恢复荧光信号。结果表明，该策略具有良好的选择性，能够区分ALP与干扰酶，包括其他水解酶(如胰蛋白酶和PP)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种检测碱性磷酸酶的生物传感器及其检测方法和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgatgcagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaact gcatcg 36
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