一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法
阅读说明：本技术 一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法 (Method for screening antioxidant by using phascolosoma esculenta ) 是由 周逢芳 蔡彬新 阮少江 黄伟卿 李筝筝 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法,包括可口革囊星虫养殖、可口革囊星虫ROS模型建立和模型验证三个步骤,其中可口革囊星虫ROS模型建立包括试验可口革囊星虫挑选、产ROS的淋巴血细胞确定、透明细胞分离方法确定、阳性对照化合物H-(2)O-(2)浓度及作用时间的确定、ROS体外稳定性和重现性实验六个步骤。通过利用可口革囊星虫模型进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景,可口革囊星虫属于闭管式循环的体腔动物,能较真实的反应机体代谢；可口革囊星虫透明细胞细胞膜薄,荧光标记物及抗氧化剂容易渗透入透明细胞内,可以更好的对抗氧化性结果进行显示；可口革囊星虫容易养殖,成本低,且实验操作简单。(The invention discloses a method for screening an antioxidant by using phascolosoma esculenta, which comprises the three steps of phascolosoma esculenta culture, phascolosoma esculenta ROS model establishment and model verification, wherein the phascolosoma esculenta ROS model establishment comprises test phascolosoma esculenta selection, determination of ROS-producing lymphocyte, determination of a transparent cell separation method, and positive control compound H 2 O 2 Determination of concentration and action time, and ROS in-vitro stability and reproducibility experiment. The method has good application prospect by utilizing the Phascolosoma esculenta model to screen the antioxidant, and the Phascolosoma esculenta belongs to a closed-tube type circulating coelomic animal and can truly reflect the metabolism of an organism; the membrane of the phascolosoma esculenta transparent cell is thin, and a fluorescent marker and an antioxidant are easy to permeate into the transparent cell, so that an anti-oxidation result can be better displayed; the Phascolosoma esculenta is easy to breed, has low cost and simple experimental operationAnd (3) singly.)
技术领域
本发明属于筛选抗氧化剂技术领域，具体涉及一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们更加关注身体健康的。活性氧是影响生物信号传导的重要物质，其堆积与衰老、心血管疾病等多种慢性疾病的发生相关联。目前许多纯化合物、食品和膳食补充剂的抗氧化活性得到了广泛的研究，新的抗氧化剂(即自由基清除剂)筛选也不断深入。
目前抗氧化剂筛选评价模型主要有体外评价和体内评价法，其中体外评价主要包括化学评价法、细胞模型评价法，体内评价方法主要有动物评价法。化学评价法无法真实模拟生理环境，未考虑药物跨膜进入细胞等作用，细胞模型评价法未考虑体内新陈代谢作用等因素，因此体外评价方法最大的缺陷是无法真实模拟体内环境，不能真实反映抗氧化物的实际抗氧化效果。体内抗氧化法动物模型大小鼠模型、斑马鱼模型，主要以小鼠为主，此法昂贵且耗时，并不适合食品和膳食补充剂初期筛选。斑马鱼模型因个体小，注射难度大及血液少不能抽取等不足。因此很有必要筛选一种不仅具备体外细胞模型，又具备体内动物模型优点的抗氧化剂筛选评价模型。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法，解决了化学评价法无法真实模拟生理环境，未考虑药物跨膜进入细胞等，细胞模型评价法未考虑体内新陈代谢作用等，大小鼠动物模型法昂贵且耗时、操作难等因素。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法，包括以下步骤：
S1：可口革囊星虫养殖：挑取健康、体重在4.0±0.5g的可口革囊星虫，放入塑料方盘中饲养，盘中铺5厘米厚的沙质土。
S2：可口革囊星虫ROS模型建立：
A1：试验可口革囊星虫挑选：挑选体重在4.0±0.5g的可口革囊星虫，用1mL针筒抽取星虫淋巴液，在显微镜下观察淋巴液血细胞的种类，辨别雌性和雄性可口革囊星虫，并选择雄性可口革囊星虫作为试验动物。
A2：产ROS的淋巴血细胞确定：挑选发育成熟的星虫个体，用1mL针筒抽取星虫淋巴液，离心后，用PBS稀释成106cell/mL血细胞悬液，取200uL加入50μLDCFH-DA工作液后，轻轻混匀后避光孵育，避光孵育后，用PBS洗涤两遍后，再紧接着用200uL的PBS轻轻重悬血细胞，在荧光显微镜下观察呈现绿色光的血细胞，以便确定用于测定ROS含量的血细胞。
A3：透明细胞分离方法确定：用15％和45％的Pereoll液(v/v)各lmL于离心管内，制成梯度，再加5mL血细胞悬液于梯度上，离心一段时间后，观察各层细胞情况，确定透明细胞所在的层。
A4：阳性对照化合物H2O2浓度及作用时间的确定：配置不同梯度浓度的H2O2液，往星虫体腔内注射50uL不同浓度H2O2液，分别在倍数间隔时间后，从每只星虫体内抽取淋巴液，离心收集星虫透明血细胞，稀释到107，按A2步骤方法测定透明血细胞ROS含量，以不同时间点星虫存活率大于95％，透明细胞ROS含量变化范围小于5％为标准，确定H2O2浓度及作用时间。
A5：ROS体外稳定性：用200μmol/L的H2O2胁迫星虫，分别在梯度间隔时间后，取星虫体腔液离心收集透明血细胞，稀释到107，放置于一定温度的环境下，分别在不同间隔时间测定透明细胞ROS含量，以ROS含量变化范围小于5％为标准，确定放置时间，即测定ROS含量试验的操作时间。
A6：重现性实验：为了验证产ROS星虫模型的重现性，用A4步骤确定的方法，往星虫体腔内注射50ul 200μmol/L的H2O2液，并在一定间隔的时间后，抽取淋巴液，离心收集星虫透明血细胞，稀释到107，测定透明血细胞ROS含量，分别重复多次，计算RSD值，考察方法的重现性。
S3：模型验证：
A1：抗氧化剂验证效果：ROS模型可口革囊星虫分成2组试验组和对照组，每组10只，往试验组星虫体内注射200uL 2mg/mL的维生素C，对照组星虫体内注射同量的生理盐水，并在一定间隔的时间后，观察星虫体腔透明血细胞ROS含量。
A2：ROS清除率计算：ROS清除率(％)＝(对照组ROS含量—试验组ROS含量)/对照组ROS含量×100％。
优选的，所述S1步骤可口革囊星虫养殖中盘中铺设的沙质土中土与沙的比例为3:1，且养殖条件为每天干露12h，淹水12h，养殖海水盐度为25±1ppt，温度为25±1℃，养殖时投喂硅藻。
优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A2步骤产ROS的淋巴血细胞确定中透明细胞为产ROS细胞。
优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A3步骤透明细胞分离方法确定中，用15％和45％的Pereoll液制成梯度，4000rpm/min离心10min。
优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A4步骤阳性对照化合物H2O2浓度及作用时间的确定中H2O2液的浓度以50μmol/L向上层梯度增加，其浓度依次为：0、50、100、150、200、250、300、350、400和450μmol/L，并且从每只星虫体内抽取淋巴液时间分别注射H2O2后为3、6、12、24和48h，且以星虫存活率大于95％，透明细胞ROS含量变化范围小于5％为标准，确定H2O2浓度及作用时间。
优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A5步骤ROS体外稳定性中，注射200μmol/L的H2O2后，分别于3、6、9、12、15和18h后取星虫体腔液离心收集透明血细胞，且在温度为25℃条件下，于0、0.5、1、2、3、4、5和6h后，分别测定透明细胞ROS含量。以ROS含量变化范围小于5％为标准，确定时间。
优选的，所述S2步骤可口革囊星虫ROS模型建立中A6步骤重现性实验中抽取淋巴液测定ROS含量的时间分别为3、6、9、12、15和18h后，并且重现性实验重复的次数至少为5次。
优选的，所述S3步骤模型试验中A1步骤抗氧化剂验证效果中，以ROS清除率为指标，分别于1h、3h、6h和12h后，测定星虫体腔透明血细胞ROS含量，计算清除率。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过利用可口革囊星虫进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景，可口革囊星虫属于星虫动物门，为海生、闭管式循环的体腔动物，属于活体动物细胞，能较真实的反应机体代谢。
2、通过利用可口革囊星虫进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景，可口革囊星虫形态结果较简单，属于较低等动物，减少了复杂生命现象的干扰，有利于研究生命体的基础代谢机制。
3、通过利用可口革囊星虫进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景，可口革囊星虫体腔里充满大量淋巴血细胞，且血细胞种类单一，只含透明细胞和颗粒细胞，且透明细胞和颗粒细胞易通过离心的方法分开，容易得到研究对象透明细胞。
4、通过利用可口革囊星虫进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景，可口革囊星虫透明细胞细胞膜薄，荧光标记物及抗氧化剂容易渗透入透明细胞内，可以更好的对抗氧化性结果进行显示。
5、通过利用可口革囊星虫进行筛选抗氧化剂具有很好的应用前景，可口革囊星虫容易养殖，成本低，且实验操作简单。
附图说明
图1为本发明的流程框图示意图；
图2为本发明的透明细胞ROS荧光图示意图；
图3为本发明的无H2O2胁迫透明细胞在荧光显微镜下颜色示意图；
图4为本发明的H2O2胁迫透明细胞在荧光显微镜下颜色示意图；
图5为本发明的不同浓度H2O2及作用时间下透明细胞ROS含量变化示意图；
图6为本发明的不同浓度H2O2及作用时间下星虫存活率示意图；
图7为本发明的透明细胞ROS体外稳定性示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-7，本发明提供一种技术方案：一种利用可口革囊星虫筛选抗氧化剂的方法，包括以下步骤：
S1：可口革囊星虫养殖：挑取健康、体重在4.0±0.5g的可口革囊星虫，放入塑料方盘中饲养，盘中铺5厘米厚的沙质土，沙质土中土与沙的比例为3:1，且养殖条件为每天干露12h，淹水12h，养殖海水盐度为25±1ppt，温度为25±1℃，养殖时投喂硅藻。
S2：可口革囊星虫ROS模型建立：
A1：试验可口革囊星虫挑选：挑选体重在4.0±0.5g的可口革囊星虫，用1mL针筒抽取星虫淋巴液，在显微镜下观察淋巴液血细胞的种类，辨别雌性和雄性可口革囊星虫，并选择雄性可口革囊星虫作为试验动物。
A2：产ROS的淋巴血细胞确定：挑选发育成熟的星虫个体，用1毫升针筒抽取星虫淋巴液，离心后，用PBS稀释成106细胞/mL血细胞悬液，取200uL加入50μLDCFH-DA工作液后，轻轻混匀后避光孵育，避光孵育的时间为30min，避光孵育的温度为37℃，避光孵育后，用PBS洗涤两遍后，再紧接着用200uL的PBS轻轻重悬血细胞，在荧光显微镜下观察呈现绿色光的血细胞，以便确定用于测定ROS含量的血细胞。
A3：透明细胞分离方法确定：用15％和20％的Pereoll液(v/v)各lmL于离心管内，制成梯度，再加5ml血细胞悬液于梯度上，4000转/min离心10min，观察各层细胞情况，确定透明细胞所在的层。
A4：阳性对照化合物H2O2浓度及作用时间的确定：配置不同梯度浓度的H2O2液，H2O2液的浓度以50μmol/L向上层梯度增加，其浓度依次为：0、50、100、150、200、250、300、350、400和450μmol/L，往星虫体腔内注射50ul不同浓度H2O2液，分别在倍数间隔时间后，具体时间分别为3、6、12、24和48h，从每只星虫体内抽取淋巴液，离心收集星虫透明血细胞，稀释到107，按A2步骤方法测定透明血细胞ROS含量，以不同时间点星虫存活率大于95％，透明细胞ROS含量变化范围小于5％为标准，确定H2O2浓度及作用时间。
A5：ROS体外稳定性：用200μmol/L的H2O2胁迫星虫，分别在梯度间隔时间后，具体时间分别为3、6、9、12、15和18h后，取星虫体腔液离心收集透明血细胞，稀释到107，放置于一定温度的环境下，分别在不同间隔时间测定透明细胞ROS含量，具体时间分别是0、0.5、1、2、3、4、5和6h后，且温度为25℃，以ROS含量变化范围小于5％为标准，确定放置时间，即测定ROS含量的操作时间。
A6：重现性实验：为了验证产ROS星虫模型的重现性，用A4步骤确定的方法，往星虫体腔内注射50uL 200μmol/L的H2O2液，并在一定间隔的时间后，具体时间分别为3、6、9、12、15和18h后，抽取淋巴液，离心收集星虫透明血细胞，稀释到107，测定透明血细胞ROS含量，分别重复多次，至少为5次，计算RSD值，考察方法的重现性。
S3：模型验证：
A1：抗氧化剂验证效果：ROS模型可口革囊星虫分成2组试验组和对照组，每组10只，往试验组星虫体内注射200uL 2mg/mL的维生素C，对照组星虫体内注射同量的生理盐水，并在一定间隔的时间后，具体时间分别为1h、3h、6h和12h后观察星虫体腔透明血细胞ROS含量。
A2：ROS清除率计算：ROS清除率(％)＝(对照组ROS含量—试验组ROS含量)/对照组ROS含量×100％。
本发明的工作原理及使用流程：用15％和45％的Pereoll液(v/v)各lmL于离心管内，离心分离后，分三层，透明细胞在上层，如图2，其中a为ROS透明细胞，b为不含ROS透明细胞；星虫体腔内注射50ul不同浓度H2O2液(0、50、100、200、400和800μmol/L)，3、6、9、12、15、18、21和24h后，透明细胞在荧光显微镜下颜色的变化如图3和图4，透明血细胞ROS含量如图5，当H2O2浓度在200μmol/L时，ROS含量3h-18h内较稳定；星虫死亡率如图6，在浓度200μmol/L以内，存活率都大于95％；用200μmol/L的H2O2胁迫星虫，3、6、9、12、15和18h后，取星虫体腔液放置0、0.5、1、2、3、4、5和6h后测定透明细胞ROS含量如图7，在3h内，透明细胞ROS含量变化小于5％，因此实验需在3h内完成；另外经过重现性实验所得数据制作出下表1：
表1
由上表1可知，可口革囊星虫ROS模型稳定性在18h内都可以，但在12h内稳定性更好。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。