背景技术

泌尿系统肿瘤中，肾癌病人可分为低中高风险三种类型，肾癌早期病人的5年生存率可达到97％、81％和62％；晚期病人的肿瘤特异性5年生存率分别为41％、18％和8％。80％的肾癌患者早期无任何症状，30％的患者确诊时已发生了癌细胞转移，目前还没有针对低风险人群的肾癌筛查项目，导致肾癌的早期检测比较困难。

对肾癌的早期诊断和预后监测是非常必要的。肿瘤的发生是一个不易察觉的过程，而目前的诊断手段往往基于影像学且需要有明显的临床症状。肾癌的临床诊断以影像学检查为主，肾脏内超过1cm的肿块可被超声扫描发现，而肿瘤标志物的变化通常可早于影像学的变化，既可用于肿瘤早期诊断又可进行肿瘤预后的判断。近年来，一系列技术手段被用于血液尿液等体液的研究，以期从中发现相关的肿瘤标志物，如蛋白、自身抗体、microRNA、循环肿瘤细胞、循环肿瘤cDNA、外泌体等。

目前没有特异性的标志物用于肾癌早期筛查、临床诊断或预后监视，但研究人员在肾癌患者的血清和尿液中发现了一系列的蛋白标志物，其中TRAF-1、SAA、Hsp27等蛋白分子浓度在血清中的显著升高，TRAIL浓度显著下降；NMP-22、NGAL、KIM-1、MMP、AQP-1、PLIN2、Hsp27等蛋白分子浓度在尿液中显著升高。肾癌组织中存在高表达的蛋白，如livin和arrestin-1，进一步的研究发现这两种靶蛋白的自身抗体明显高于健康对照。

组织中蛋白质的高表达、低表达、降解或突变可以产生肿瘤自身的特异性(TSAs)或相关性抗原(TAAs)。自身抗原在多种肿瘤(肝癌，肺癌，食管癌，结直肠癌等)被发现并报道。代表性的肿瘤自身抗原包括p53、c-myc等抑癌基因蛋白或驱动基因蛋白、MAGEA蛋白家族、NY-ESO-1等CT抗原(Cancer-testis antigen)以及其他多种类型的蛋白。但是，多数肿瘤相关抗原在血液中含量很低且不稳定，易被清除或降解。自身抗原经过B细胞的免疫反应后，产生的自身抗体能够在肿瘤患者血清中稳定存在，在一周内可被放大11个数量级，并可以在出现症状数月甚至数年之前就可以被检测到。因此，肿瘤相关抗原自身抗体，是发展无创血清学检测、诊断和早期检测癌症的理想标志物。与传统的抗原类标志物相比，自身抗体肿瘤标志物有天然的高特异性与免疫生物放大信号等独特优势，已经成为肿瘤早期诊断临床应用技术的发展趋势。

为了筛选肾癌患者血清中的自身抗体，有研究利用SEREX方法，发现了65种肾癌相关抗原，并对与之反应的自身抗体进行检测。首先从病人的肿瘤组织中获得总RNA，通过逆转录得到cDNA文库，并建立噬菌体克隆库再转染到大肠杆菌中，通过固体培养和诱导表达重组蛋白并转移到膜上，对该病人的血清进行免疫检测，阳性克隆通过测序获得抗原信息。蛋白丰度的不同导致该方法在建库的过程中蛋白表达的不均衡，使低丰度蛋白难以检测。另外，整个实验过程步骤繁多，无法进行大量样本的筛选，存在个体差异。除此之外，很少有关于肾癌全局性自身抗体筛查的报道。

随着芯片技术的发展，高含量的人蛋白组芯片几乎包含了所有的人重组蛋白，对自身抗体的检测，具有灵敏度高、特异性高、样本量小、操作简单、耗时短等优点。蛋白质芯片技术是将多种蛋白质以阵列的形式排布和固定在固相表面，然后进行血清学筛选，这是最直接的一种方式，同时满足高通量和大量样本筛选的需求。蛋白质芯片具有高通量、微型化、样本消耗少等优点。商业化的蛋白质芯片以纯化的、重组表达的蛋白质进行制备，已达到20,240个人重组蛋白，涵盖约16,000个基因，89％的蛋白为全长蛋白，部分蛋白包含多个不同的剪切体形式，已应用于自身免疫性肝炎、系统性红斑狼疮、白塞病等自身免疫性疾病，以及肝癌、胃癌、黑色素瘤等恶性肿瘤的生物标志物的发现。

因此，为了能够提高肾癌早期诊断率和提高肾癌患者的生存率，需要研发高灵敏度和特异性的自身抗体标志物，用于肾癌的早期诊断。现在临床上没有用于肾癌诊断的肿瘤标志物，更达不到肾癌的早期诊断。到目前为止，还未有理想的可供临床使用的肾癌早期筛查和诊断标志物。研发一种灵敏度和特异度较高的自身抗体标志物，需要利用一种高效的筛选工具，还需要对标志物进行大样本量的试验和验证，以及运用正确的统计学分析方法和流行病学指标对标志物的诊断价值进行评价，以上都需要严谨的实验设计，配套的仪器设备和深厚的专业知识背景。发现一种可用于肾癌诊断的自身抗体，提前发现肿瘤不但可以减少后期癌症病人的痛苦，还可以降低病人后期治疗的经济负担，并达到临床对肿瘤“早发现，早治疗，早康复”的要求。肾癌诊断以临床表现和影像学检查为主，目前尚无公认的可用于临床诊断肾癌的肿瘤标志物。本发明旨在从血液中找到一种自身抗体标志物，并开发相应的ELISA检测试剂盒，用于肾癌的诊断甚至预后评估。