一种简易的清水虫冬卵诱导保存萌发及其清水的方法
阅读说明：本技术 一种简易的清水虫冬卵诱导保存萌发及其清水的方法 (Simple method for induction preservation and germination of Fangchi egg and clear water thereof ) 是由 周呈祥 邱屹 周浩然 王振 郑洪星 张建兵 俞觊觎 魏星 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种简易的清水虫冬卵诱导保存萌发及其清水的方法,包括步骤一,对清水虫成体缺食喂养：从平时投喂量的100％,逐渐递减至25％,以诱导出冬卵；步骤二,用原培养水加至容量的75％～100％,封盖后置于4℃冰箱中保存；步骤三,从冰箱取出,直接用自来水加入培养容器内作为孵化液,温度保持在23～28℃之间,在有光照的室内静置培养,静置孵化2～3天。将孵出的幼溞经分级扩大培养后,投放到待清水水体的的网箱中,实现清水。本发明的简易的清水虫冬卵诱导保存萌发及其清水的方法,可快速诱导冬卵的产生、低成本长期保存、快速萌发,实现清水虫的商品化生产及在清水方面的广泛应用；服务于水生态修复产业与水产育苗业。(The invention discloses a simple method for induction preservation and germination of Fang eggs of Fang river insects and clear water of the Fang river insects, which comprises the following steps of: gradually decreasing from 100 percent of the feeding amount at ordinary times to 25 percent to induce out winter eggs; step two, adding original culture water to 75% -100% of the volume, sealing the cover and then storing in a refrigerator at 4 ℃; taking out the culture medium from the refrigerator, directly adding tap water into the culture container to serve as hatching fluid, keeping the temperature between 23 and 28 ℃, performing static culture in a lighted room, and performing static incubation for 2 to 3 days. And (4) after the incubated young daphnia is subjected to grading amplification culture, putting the young daphnia into a net cage of a water body to be cleaned, and cleaning the water body. The simple method for inducing, preserving and germinating the freshwater insect winter eggs and the clear water thereof can quickly induce the winter eggs to generate, preserve for a long time at low cost and germinate quickly, and realize the commercial production of the freshwater insect and the wide application in the clear water aspect; it serves the water ecological restoration industry and the aquatic seedling raising industry.)
技术领域
本发明涉及水生态修复领域，尤其是一种简易的清水虫冬卵之诱导、保存、萌发、及用该清水虫清除水体中绿藻(清水)的方法。
背景技术
随着人类对自然环境的影响，目前水体富营养化程度越来越高，导致水体中微型浮游藻类大量繁殖，特别是夏、秋季节水体中型绿藻、微囊蓝藻等暴发 (俗称“水华”)，藻体死后会释放毒素、水体缺氧恶臭、使水生动物大量死亡，水体环境极度恶化，导致水体的观赏性与利用价值大大降低。
现有技术中治理水体富营养化的方法有很多，如清淤，调配水，物理、化学除藻和投放细菌(如溶藻菌)以及生物调控等，均取得了一定的效果。应用生物的食物链(有经典/非经典生物操纵技术)在水体富营养化方面已取得了阶段性进展(如ZL201210308099.2，《老年低额溞摄食蓝藻的方法》)。
枝角类属节肢动物门、甲壳纲、鳃足亚纲、双甲目、枝角亚目，通称水蚤，俗称“红虫”或“鱼虫”。在水体中浮游生活，以微藻(如小球藻、栅藻等)、细菌(如酵母、芽孢杆菌等)、有机腐屑(如浸泡发酵后的麦麸、米糠等)为食，其是鱼类苗种阶段重要的饵料。
枝角类的生殖方式包括孤雌生殖与两性生殖，在正常的环境条件下以孤雌生殖为主，是其进行大量繁殖的主要方式。休眠卵(冬卵)是枝角类在不良环境条件下进行有性生殖延续后代的产物。
多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)是习见淡水枝角类，夏季经常大量出现，多周期生殖，在5-30℃范围内，均适于进行孤雌生殖，夏卵每胎10-15个，最多可达60个。分布在我国广东、福建、浙江、江苏、湖南、湖北、山东、河北、河南、辽宁、吉林、内蒙、山西、陕西、甘肃、青海、西藏(蒋燮治，堵南山.中国动物志节肢动物门甲壳纲淡水枝角类北京：科学出版社.1979.P 155)。
小球藻属属于绿球藻目，在淡水中分布最广，最常见，特别是有机质丰富的水体中(周云龙孢子植物实验及实习(第3版)北京师范大学出版社2012.7 P4)。
浮游单细胞藻类对枝角类有颇大的饵料意义，这是大家公认的。我们常见池塘中枝角类数量大时，消耗藻类太多，以至池水变得完全透明(蒋燮治，堵南山.中国动物志节肢动物门甲壳纲淡水枝角类北京：科学出版社.19 79.P24～54)。
蒙古祼腹溞冬卵-4℃下冷冻保存0～62d内，蒙古祼腹溞的萌发率随着保存时间的增加而增加，最高达22％；62～180d其萌发率呈下降趋势(孟琼,邓道贵. 枝角类休眠卵形成和萌发的研究进展.动物学杂志2008(3)：154～160)。
将带水保存的蚤状溞休眠卵在过滤池水与曝气自来水作为萌发液萌发；曝气自来水萌发率较高，保存42d萌发率最高38.33％，保存7d萌发率最低8.33％，休眠卵最佳萌发率为14-49d，萌发率范围为25.00％-38.33％。因此进行萌发时休眠卵保存1个月为宜。休眠卵以何种方式贮存最好？贮存多长时间的萌率最高？何种生态条件下，能使枝角类在短时间萌发率最高？上述问题决定着枝角类商品化生产是否可行，能否被推广应用。在生产上，人们非常关心休眠卵的累积萌发率，因为绝大部分休眠卵在短时间卵化处理进入孤雌生殖阶段，迅速使种群密度增加，保证育苗的需要(陆正和,杨家新.生态因子对蚤状溞休眠卵萌发率的影响南京师范大学报(自然科学版)2004(3))。
多刺祼腹溞是最易培养的淡水枝角类，采用干燥低温保存休眠卵效果较好， 1年后孵化率可达60％；但其带水低温保存的冬卵1年后萌发率仅10％.(程汉良, 刘汉.枝角类适种探索各休眠卵利用.水产科学1999.18(5))
目前在控制“水华”方面的专利申请的枝角类是大型溞、蚤状溞、尖额溞、裸腹溞与老年低额溞。“水华”的季节性较强，如在非“水华”季节只延用孤雌生殖保种的方式，势必会导致花费大量的人力、物力与时间，而且当培养条件发生突变时(如温度骤变，缺饵，水质恶化)，往往会培养失败，导致“绝种”。而采用“冬卵”保种，冬卵的质量、保存方法、保存时长、萌发机制与如何选择适时萌发，这些都是决定枝角类商业化生产是否可行、能否被推广应用的关键(孟琼、邓道贵.枝角类休眠卵形成和萌发的研究进展.动物学杂志2008.43 (3)；154～160)。这属技术难点——“瓶颈”。
生物调控较典型的是用于小而浅的、相对封闭的湖泊系统，在浅水湖泊由于生物分布垂直空间差异较小，因而生物调控在一定时间内对某些浮游植物控制效果较好。对应于传统的营养盐控制技术，生物调控是管理生物相组成，通过管理湖泊内较高层次的消费者生物，而控制藻类，实现水质管理目标。一般采用捕获、毒杀鱼类以增加浮游动物以及直接放牧湖泊浮游动物提高浮游动物现存量。两种方法增加浮游动物种群以控制藻类爆发(王国祥、陈小英、濮培民、湖泊藻型富营养化控制——技术、理论及应用.湖泊科学2002.14(3))。
本申请所采用的是上述裸腹溞中的多刺裸腹溞，为通俗起见，本申请称其为“清水虫”，公司编号为“清水虫1号”。
发明内容
本发明的目的是提供一种简易的清水虫冬卵诱导保存萌发及其清水的方法，可快速诱导冬卵的产生、低成本长期保存、2-3天内冬卵集中快速萌发以及在不扰乱原水体生态的情况下，利用网箱创建清水虫的“庇护所”，达到清水的功能；能够实现多刺祼腹溞(清水虫)的商品化生产与推广应用；从而服务于我国的水生态修复产业与水生经济动物育苗业；还能为科研单位及院校的生物实验提供生物样品。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种简易的清水虫冬卵诱导保存及萌发的方法，包括如下步骤：
步骤一，诱导冬卵大量产生的步骤
对清水虫成体进行缺食喂养：在3天内将饵料供应量从平时投喂量的100％，逐渐递减至25％，以诱导出冬卵；
步骤二，冬卵的带水密封保存步骤
冬卵4℃带水密封保存：用原培养水淘洗冬卵，以去除冬卵中夹杂的较大的杂物及清水虫残体，用吸管吸取冬卵与细小沉积物至具塞的塑料或玻璃试管或瓶中，用原培养水加至容量的75％～100％，封盖后置于4℃冰箱中保存；
步骤三，促使冬卵快速萌发的步骤 23～28℃冬卵自来水快速萌发：所述冬卵需要孵化时，从冰箱取出，用自来水(本发明所说的自来水均为未曝气的自来水)淘洗数次，以去除过多的杂质；直接用自来水加入培养容器内作为孵化液，温度保持在23～28℃之间，在有光照的室内静置培养，期间用吸管吹打至少2次，以使冬卵均匀分散于培养容器底部，静置孵化2～3天。
步骤一中，当清水虫成体密度达到1500个/升-3000个/升时(因溞体计数操作困难，清水虫生物量可用重量(湿重)的方法进行估算，清水虫以湿重0.02mg/ 个计(黄祥飞.淡水浮游动物定时计数方法.水库渔业.1982.4(3))，第一天投料为平时投喂量的75％，分两次投放，6:00～9:00投料量为4/10，15:00～18:00 投料量为6/10；第二天投料为平时投喂量的50％，分两次投放，6:00～9:00投料量为4/10，15:00～18:00投料量为6/10；第三天投料为平时投喂量的25％，分两次投放，6:00～9:00投料量为4/10，15:00～18:00投料量为6/10。
步骤三中，所述培养容器置于靠近向阳窗台的实验台上，以使光线能够漫射到培养容器内，光照强度为2000-6000Lx，温度控制在26-28℃，静置孵化2 天。
将孵出的幼溞，通过灯光诱使其聚集，使用吸管或虹吸管将聚集的幼溞移至盛装有小球藻培养液的容器中进行扩大培养，之后随着清水虫数量的增加，容器逐级放大以适应进一步的扩大培养。
一种使用上述方法所萌发的清水虫进行清水的方法，包括如下步骤：
步骤一，将长方形的网箱置入富营养化的单细胞绿藻水体中，所述网箱之敞开的上端口高出水面，网箱的四周面及底面均由80～100目的网片制成；
步骤二，将所述清水虫放入网箱内，投放密度为：50000～70000个/立方水体。
所述网箱的上端口包括环绕该上端口的上纲绳，多根长度与网箱宽度相同的支撑杆支撑于上端口，上纲绳上设有多个浮子，以使所述上端口高出水面；网箱的底面四周设有沉子，以使网箱的底面下沉在水中，网箱一端的支撑杆通过固定绳联系于固定杆或石砣上。
所述网箱的上端口包括环绕该上端口的上纲绳，上纲绳通过连接细绳联系于多根固定杆上，多根固定杆将网箱的上端口撑为长方形，网箱的底面四周设有沉子，以使网箱的底面下沉在水中。
与现有技术相比本发明的有益效果是：采用上述技术方案，可快速诱导冬卵的产生、低成本长期保存、2-3天内冬卵集中快速萌发以及在不扰乱原水体生态的情况下，利用网箱创建清水虫的“庇护所”，达到清水的功能；能够实现多刺祼腹溞(清水虫1号)的商品化生产与推广应用；从而服务于我国的水生态修复产业与水生经济动物育苗业；还能为科研单位及院校的生物实验提供生物样品。
进一步的有益效果是：漂浮网箱只是一端固定，可随风浪自适应水位的涨落，固定网箱因完全固定，自适应差(如风浪、水位涨落等)；浮子最好用网片包起来，这样的结构，网箱放入水中后，网箱的上端口会高于水面，可有效防止清水虫逃逸。
附图说明
图1是本发明清水虫摄食小球藻效果测试图；
图2是本发明第一种结构的网箱与石砣联系的结构示意图；
图3是本发明第一种结构的网箱与固定杆联系的结构示意图；
图4是本发明第一种结构的网箱的前端部放大示意图；
图5是本发明第二种结构的网箱的结构示意图；
图6是本发明第二种结构的网箱的前端部放大示意图。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案更加清晰，以下结合附图1至6，对本发明进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明的保护范围。
本发明是一种简易的清水虫冬卵诱导保存及萌发的方法，包括如下步骤：
步骤一，诱导冬卵大量产生的步骤 2018年7月底，将从浙江大学紫金港校区河道内采集到的多刺裸腹溞，进行单克隆培养，当清水虫成体密度达到1500个/升-3000个/升这一范围时(因溞体计数操作困难，清水虫生物量可用重量(湿重)的方法进行估算，清水虫以湿重0.02mg/个计(黄祥飞.淡水浮游动物定时计数方法.水库渔业.1982.4(3))，对清水虫成体进行缺食喂养，第一天投料为平时投喂量的75％，分两次投放， 6:00～9:00投料量为4/10，15:00～18:00投料量为6/10；第二天投料为平时投喂量的50％，分两次投放，6:00～9:00投料量为4/10，15:00～18:00投料量为6/10；第三天投料为平时投喂量的25％，分两次投放，6:00～9:00投料量为 4/10，15:00～18:00投料量为6/10，以诱导出冬卵；
步骤二，冬卵的带水密封保存步骤
冬卵4℃带水密封保存：2018年8月6日用原培养水淘洗冬卵，以去除冬卵中夹杂的较大的杂物及清水虫残体，用吸管吸取冬卵与细小沉积物至具塞的塑料或玻璃试管或瓶中，用原培养水加至容量的75％～100％，封盖后，贴上标签编号20180806清水虫1号后，置于4℃冰箱中保存；
步骤三，促使冬卵快速萌发的步骤 23～28℃冬卵自来水快速萌发：
2021年7月21日15时，从4℃冰箱中取出20180806带水保存的卵鞍样品，摇匀后立即用吸管吸取一部分冬卵保存液，后置于100ml烧杯中，直接用自来水(本发明所说的自来水均为未曝气的自来水)淘洗数次，以去除保存液中杂质。用吸管吸取经淘洗过后100ml烧杯中的冬卵，在显微镜下镜检，选取卵鞍中有冬卵的卵鞍(一个卵鞍中有2个冬卵)并进行计数30个(共计60个冬卵)，放置到另一只100ml烧杯中，用自来水定容到60ml。放置在窗台边实验台上，用吸管吹打至2～3次，以使冬卵均匀分散于培养板底部，利用自然光26-28℃，静置萌发。累积萌发率％＝(累积萌出幼溞总数/试验冬卵总数)*100。2021年7月 23日15时(孵化48小时)，用吸管吸出幼溞并统计，累计产幼溞共计38个，故48小时累计萌发率％＝(38/60)*100＝63.33％。
2021年8月3日10时从4℃冰箱中取出20180806保存带水保存的卵鞍样品，摇匀后立即用吸管吸取一部分冬卵保存液，后置于100ml烧杯中，直接用自来水淘洗数次，以去除保存液中杂质。用吸管吸取经淘洗过后100ml烧杯中的冬卵，在显微镜下镜检，选取卵鞍中有冬卵的卵鞍(正常情况下一个卵鞍中有2个冬卵；也有因营养等原因，一个卵鞍中会出现1个冬卵或空卵)与散落的冬卵(脱离卵鞍的冬卵)并进行计数，放置到六孔培养板中。每孔中加入4ml 未曝气自来水，放置在窗台边实验台上，利用自然光26-28℃静置萌发；用吸管吹打至2～3次，以使冬卵均匀分散于培养板底部，24-48h内不定时用手电配合检查(黑色背景下观察)萌发出小溞的数量，计算累积萌发率。
表1
GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定：末梢水游离氯余量≧0.05mg/l
自来水中“余氯”，其有氧化性为大家公知，故研究人员做实验时一般均采用曝气自来水。
本发明团队近3年来曾尝试过用河水、过滤河水、曝气自来水与未曝气自来水作萌发液，均能使清水虫1号冬卵萌发，但以未曝气自来水作萌发液时萌发速度最快。本发明团队认为未曝气自来水萌发液萌发迅度快的原理如下：
利用自来水中微量的“余氯”，一则可以氧化4℃带水长期保存的冬卵保存时产生的有害物质(如氨、硫化氢)，二则可以消毒卵鞍表面的微生物，提高卵鞍的通透性，三则氧化冬卵中“休眠激素”(肽类物质)，从而打破休眠，启动萌发。
清水虫1号休眠卵萌发一般集中在24-72h，而其萌发时是在有漫射的自然光照(2000～6000Lx)条件下进行，利用“余氯”见光易分解的特性，故自来水中“余氯”会进一步降低，故近3年来近20余次的萌发试验证明，利用未曝气自来水萌发液萌发着实可行。直接采用自来水(未曝气除氯)来促进清水虫休眠卵萌发，打破了本领域的技术偏见，取得了意想不到的技术效果。
直接采用未曝气自来水为清水虫1号的萌发液时，将4℃带水保存近3年(3 年差2天)的冬卵(编号为20180806清水虫1号)在26～28℃，靠近窗台的实验台上萌发，在24h累积萌发率为10.53％；48h时累积萌发率最高萌率为68.42％。 2021年8月10日～8月13日，在中国科学院水生生物研究所曹文宣院士支持与安排下，向贤芬博士、虞功亮副研究员对此批生物样品进行种属鉴定，确定为多刺祼腹溞；在此向专家致谢！
将孵出的幼溞，通过灯光诱使其聚集，使用吸管或虹吸管将聚集的幼溞移至盛装有小球藻培养液的容器中进行扩大培养，之后随着清水虫数量的增加，容器逐级放大以适应进一步的扩大培养。
一种使用上述所萌发的清水虫进行清水的方法，包括如下步骤：
步骤一，将长方形的网箱1置入富营养化的单细胞绿藻水体中，所述网箱1 之敞开的上端口1-1高出水面，网箱1的四周面及底面均由80～100目的网片1-5制成；
所述网箱1可以有多种不同的结构：作为第一种结构，所述网箱1的上端口1-1包括环绕该上端口1-1的上纲绳1-2，多根长度与网箱宽度相同的支撑杆 1-6支撑于上端口1-1，上纲绳1-2上设有多个浮子1-3，以使所述上端口1-1 高出水面；网箱1的底面四周设有沉子1-4，以使网箱1的底面下沉在水中，网箱1一端的支撑杆1-6通过固定绳2联系于固定杆3或石砣4上；作为第二种结构，所述网箱1的上端口1-1包括环绕该上端口1-1的上纲绳1-2，上纲绳 1-2通过连接细绳5联系于多根固定杆3上，多根固定杆3将网箱1的上端口 1-1撑为长方形，网箱1的底面四周设有沉子1-4，以使网箱1的底面下沉在水中；作为优选，所述浮子1-3是用网片包起来的，这样，网箱1放入水中后，其上端口1-1会高于水面。
小型网箱1尺寸：长*宽*高＝(1000-10000)mm*1000mm*1000mm为宜；大型网箱的尺寸：高度与宽度仍保持1000mm，长度可根据需要适当延长；
步骤二，将所述清水虫放入网箱1内，投放密度为：50000～70000个/立方水体。
为了指导网箱中投放合适的清水虫密度，在实验室做了不同投放量(密度) 对小球藻摄食的跟踪实验。具体实验如下：
2021年7月26日～7月29日，利用4～5日龄的清水虫1号对小球藻(小球藻藻种为广东省实验动物监测所广东省实验动物重点实验室陈小曲老师惠赠；在此向陈老师致谢！)进行滤食“清水”试验：以3个100ml小烧杯为容器，将培养好的小球藻溶液定容到100ml；后分引入0ind(个)(CK对照组)；7ind(个)； 10ind(个)清水虫，试验时间70h。此期间不定时测定烧杯上层液OD680，利用 OD680测得值与小球藻密度的正相关性，可以判断清水虫对小球藻的摄食效果 (黄美玲；何庆；黄建荣；黎祖福；小球藻生物量的快速测定技术研究.河北渔业2010年04期P1～3,14)，经EXCEL2007软件进行数据统计处理并图形化 (见表2、图1)。
根据实验结果表明：清水虫1号在小球藻(单细胞绿藻)中投放密度70～ 100ind/L时具备很好的清水效果。
表2
2021年8月16日～8月23日，在单细胞绿藻丰富的断头河道(河水不流动) 内定置长*宽*高＝2000mm*1000mm*1000mm的网箱，试验前网箱内透明度(黑白盘测定法)为250mm。向投放清水虫1号成溞2.0克(投放密度约50000个/立方水体；0.02mg/个溞体计)，试验结束时，网箱内透明度清澈见底达到1000mm；证实了通过网箱作为清水虫的“庇护所”来进行清水的可行性。
在水中用网箱试验中，网片有生物污损现象，为了保证网片的通透性，可不定期用毛刷对网片外侧进行刷洗，或更换网箱(倒箱)。当水体中溞体密度达 1500个/升时，可每日采集20％左右的溞体转移到到新网箱或出售活体或“虫干” (收集的清水虫洗净后当天晒干或烘干品--有利于长期贮藏)给花鸟市场/水产苗种育苗/养殖场，作为水生经济动物的活饵料。
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