具体实施方式

以下将结合实施例对本申请作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，本申请可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本申请的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。

在本申请中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等，pET28a载体(购自重庆优宝生物技术股份有限公司，产品编号：VT1207)，pCAMBIA-2300(购自重庆优宝生物技术股份有限公司，产品编号：VT1383)，大肠杆菌DE3(购自重庆优宝生物技术股份有限公司，产品编号：ST1007)，大肠杆菌DH5α(购自北京擎科生物科技有限公司上海分公司，产品编号：TSV-A07)。

月季品种“安吉拉(Angela)”为诞生于法国1984年的丰花藤本月季，花朵粉红色，浅粉色的亮点，中心色淡。无香或温和果香。花瓣35个，花朵平均直径4厘米，小到中等，全双(26-40花瓣)，簇花，小集群，杯状开花形式，花期长，多季节连续盛开；枝条中等，浓密；叶子中等，有光泽，中绿色。高度80-150厘米，最长可达300厘米；广泛种植于高架；耐旱耐热抗污染性能好。本申请的月季品种“安吉拉(Angela)”购买自上海佰麟园林绿化工程有限公司。

实施例1月季‘安吉拉’RcHSP18.1基因的克隆

提取野生型月季‘安吉拉’(图1)叶片总RNA，提取试剂盒为SteadyPure Plant RNAExtraction Kit(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。以反转录的cDNA为模板，利用如SEQ ID NO.4(正向引物：5'ATGTCGCTCATCCCAAATTTCC 3')和SEQ ID NO.5(反向引物：5'TTACCCGGAAATTTCAATGGC 3')所示引物序列，PCR获得长465bp的编码区条带。其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，由154个氨基酸残基组成，分子量为19.7千道尔顿。RcHSP18.1基因全长序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2月季‘安吉拉’RcHSP18.1蛋白生物信息学分析

(1)选取不同物种氨基酸序列，运用MEGA7，分析RcHSP18.1系统发育关系，RcHSP18.1与兰科植物铁皮石斛，深圳拟兰聚在同一分支，归属单子叶分支。

(2)运用https://swissmodel.expasy.org/interactive预测RcHSP18.1蛋白三级结构，如图2所示，RcHSP18.1蛋白三级结构预测其形成同源二聚体发挥作用。

实施例3月季‘安吉拉’RcHSP18.1基因不同温度处理后表达模式分析

分别提取不同温度(常温(28℃)与高温(50℃))处理后月季‘安吉拉’叶片中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，进行q PCR检测，具体如下：

(1)自然环境培养的生长状态良好的月季‘安吉拉’，取其带叶茎段，在常温(28℃)与高温(50℃)处理2h。

(2)提取不同温度处理后‘安吉拉’叶片的总RNA；

(3)利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，根据SEQ ID NO.1设计引物SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7，进行qPCR检测。

正向引物：5'GTCGCTCATCCCAAATTTCC 3'(SEQ ID NO.6)

反向引物：5'TTCTCGCCAGGAAATTCAGG 3'(SEQ ID NO.7)

结果如图3所示，该基因常温下几乎不表达，但是高温胁迫下的表达量显著高于常温时的表达。

实施例4‘安吉拉’RcHSP18.1基因高温处理不同时期的表达量分析

将月季‘安吉拉’生长发育良好的带叶茎段，在高温50℃下处理4h。每隔30min提取各个时期的总RNA，反转录为cDNA，利用引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，进行Real-timePCR检测，结果如图4所示，RcHSP18.1的表达量随着高温胁迫的时间延长先急剧增加，随后再不断下降。

实施例5‘安吉拉’RcHSP18.1基因对原核生物耐热活性的影响分析

利用表达载体pET28a转入大肠杆菌DE3，诱导蛋白表达后验证其耐热性，其步骤如下：

(1)设计引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，利用‘安吉拉’cDNA克隆RcHSP18.1基因，构建pET28a-HSP18.1表达载体；

正向引物：5'CAAATGGGTCGCGGATCCATGTCGCTCATCCCAAATTTCC 3'(SEQ ID NO.8)

反向引物：5'TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCCCGGAAATTTCAATGGCTTTG3'(SEQ ID NO.9)

(2)构建分别含有载体pET28a-EV和pET28a-HSP18.1的大肠杆菌DE3菌株。

(4)新摇菌液OD至1.0，稀释50倍测常温28℃下生长曲线；

(5)OD为1的新鲜菌液加入IPTG至终浓度为1mM/L，高温50℃下培养，测生长曲线。

结果如图5和图6所示，将月季‘安吉拉’RcHSP18.1基因转入原核生物大肠杆菌DE3中后，与转入空载体pET28a-EV的对照组相比，常温下RcHSP18.1基因不影响大肠杆菌的生长活性(图5)，但是在高温情况下，能够增强大肠杆菌的耐热活性(图6)。

实施例6‘安吉拉’RcHSP18.1基因对月季耐热活性的影响分析

(1)设计引物SEQ ID NO.10(5'GGATCCTCTAGAACTAGTCATGTCGCTCATCCCAAATTTCC3')和SEQ ID NO.11(5'GTCAGAAGGCCTCCCGGGCCCCGGAAATTTCAATGGCTTTG 3')，利用‘安吉拉’cDNA克隆RcHSP18.1基因编码序列，将获得RcHSP18.1基因编码序列构建到载体pCAMBIA-2300中，得到pCAMBIA-2300-HSP18.1过表达载体。

(2)取安吉拉新鲜幼嫩叶片，加入纯水和少量洗洁精，摇床100rpm左右摇30-45min，随后冲洗干净，在超净台中经过75％酒精处理45s，12.5％次氯酸钠处理6-10min，无菌水清洗3-5次，切割成0.2cm宽的叶片，接种到外植体诱导愈伤培养基(B)中，经过2-3周生长出新鲜幼嫩的愈伤组织；B培养基配方：MS+30g/L葡萄糖+3mg/L 2,4-D+0.05mg/L KT+2.7g/L植物凝胶。

(3)提取表达载体质粒(浓度需达到1μg/μl)，利用基因枪将表达载体转入新鲜的月季‘安吉拉’的愈伤组织，随后接种到愈伤增殖培养基(C)中，C培养基配方：MS+30g/L葡萄糖+2mg/L NAA+0.01m.g/L 6-BA+2.7g/L植物凝胶。

(4)先增殖1-2代，随后转入筛选培养基(S)中进行筛选，获得转基因愈伤组织；S培养基配方：MS+30g/L葡萄糖+20mg/L潮霉素+2mg/L NAA+0.01m.g/L 6-BA+2.7g/L植物凝胶。

(5)在温度28℃组培室中，月季‘安吉拉’愈伤组织经筛选培养基筛选后，转入增殖培养基中培养20-30d。

(6)以野生型(不作转基因处理的愈伤组织)作为对照，分别取其野生型以及过表达基因型的新鲜愈伤组织进行实验；

(6)分别在常温(28℃)与高温(50℃)处理2h，取部分愈伤组织材料检测其相对电导率值以及基因RcHSP18.1表达量。

(7)检测其相对电导率值：

①每个处理样本取0.2g愈伤组织，3个重复；

②加入10ml ddH₂O，抽真空；

③静置30min；

④检测各样本电导率值A；

⑤沸水浴煮沸20min；

⑥检测各样本电导率值B；

⑦相对电导率＝A*B-1*100％

(8)基因RcHSP18.1表达量：

①提取两个处理样本的总RNA。

②利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，进行qPCR检测。

正常的植物细胞，其细胞膜对物质具有选择透过性，但当植物处于高温、干旱、盐胁迫等逆境条件下，细胞膜通透性会由于细胞膜被破坏而增大，从而导致细胞内的电解质外渗，使得测得的电导值增加。根据高温胁迫后植物的相对电导率和正常情况下植物的相对电导率的差值变化，可得出高温胁迫下不同月季品种的抗逆性强弱。结果显示，将含有RcHSP18.1基因的过表达载体转入月季‘安吉拉’的愈伤组织中，经过常温或高温处理后，高温情况下的RcHSP18.1基因的表达量增强(图8)；与野生型相比，高温处理后RcHSP18.1过表达基因型显相对电导率著降低(图7)，证明RcHSP18.1基因的过表达显著增强了月季‘安吉拉’的耐热活性。

以上详细描述了本申请的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本申请的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本申请的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海师范大学

<120> 一种提高月季耐热性的基因RcHSP18.1及其应用

<130> CN015-21010PICN

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 724

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> RcHSP18.1全长序列

<400> 1

atcttcccgt ccaatcacca aaccagttaa gcaaatactc aaacattctg atcgtgcaat 60

ccattcacaa tgtcgctcat cccaaatttc cgacgaaaca gcatcttcga cctcgatctc 120

tgggacccat tcagggattt ccaattccct tcttcatctc tctccacatt ccctgaattt 180

cctggcgaga attcggcttt catcaacacc cggatcgact ggaaggagac cccagaagcc 240

catgtgttca aggccgacct tccggggctg aagaaagaag aggtcaaggt tgagattgaa 300

gatgacaggg tgctgcagat cagcggagag aggaagatag agaaggagga caagaacgac 360

aagtggcacc gggtcgagag aagcagcggc aagttctcca ggaggttcag gcttcctgag 420

aatgcgaagc ttgatgagat taaggctgcc atggagaatg gggttctcag tgtgactgtt 480

ccgaaggcag aggtgaagag gcctgatgtc aaagccattg aaatttccgg gtaatcctgc 540

aattaagatc tatctttctc ggtttcgatc tctctcatcc tatcaaatat gattgtcaat 600

gtgtaactgt acgtgtcaat gtgtcatgta atattttgga ttcggaactt gtaatttgat 660

agcatttgcc agtatgtttt gctctgtgct atatgaatgt gctctttttt ctcttacaca 720

ccaa 724

<210> 2

<211> 465

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> RcHSP18.1编码序列

<400> 2

atgtcgctca tcccaaattt ccgacgaaac agcatcttcg acctcgatct ctgggaccca 60

ttcagggatt tccaattccc ttcttcatct ctctccacat tccctgaatt tcctggcgag 120

aattcggctt tcatcaacac ccggatcgac tggaaggaga ccccagaagc ccatgtgttc 180

aaggccgacc ttccggggct gaagaaagaa gaggtcaagg ttgagattga agatgacagg 240

gtgctgcaga tcagcggaga gaggaagata gagaaggagg acaagaacga caagtggcac 300

cgggtcgaga gaagcagcgg caagttctcc aggaggttca ggcttcctga gaatgcgaag 360

cttgatgaga ttaaggctgc catggagaat ggggttctca gtgtgactgt tccgaaggca 420

gaggtgaaga ggcctgatgt caaagccatt gaaatttccg ggtaa 465

<210> 3

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> RcHSP18.1编码的氨基酸序列

<400> 3

Met Ser Leu Ile Pro Asn Phe Arg Arg Asn Ser Ile Phe Asp Leu Asp

1 5 10 15

Leu Trp Asp Pro Phe Arg Asp Phe Gln Phe Pro Ser Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Thr Phe Pro Glu Phe Pro Gly Glu Asn Ser Ala Phe Ile Asn Thr Arg

35 40 45

Ile Asp Trp Lys Glu Thr Pro Glu Ala His Val Phe Lys Ala Asp Leu

50 55 60

Pro Gly Leu Lys Lys Glu Glu Val Lys Val Glu Ile Glu Asp Asp Arg

65 70 75 80

Val Leu Gln Ile Ser Gly Glu Arg Lys Ile Glu Lys Glu Asp Lys Asn

85 90 95

Asp Lys Trp His Arg Val Glu Arg Ser Ser Gly Lys Phe Ser Arg Arg

100 105 110

Phe Arg Leu Pro Glu Asn Ala Lys Leu Asp Glu Ile Lys Ala Ala Met

115 120 125

Glu Asn Gly Val Leu Ser Val Thr Val Pro Lys Ala Glu Val Lys Arg

130 135 140

Pro Asp Val Lys Ala Ile Glu Ile Ser Gly

145 150

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 正向扩增引物1

<400> 4

atgtcgctca tcccaaattt cc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 反向扩增引物1

<400> 5

ttacccggaa atttcaatgg c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 正向检测引物

<400> 6

gtcgctcatc ccaaatttcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 反向检测引物

<400> 7

ttctcgccag gaaattcagg 20

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 正向扩增引物2

<400> 8

caaatgggtc gcggatccat gtcgctcatc ccaaatttcc 40

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 反向扩增引物2

<400> 9

tgcggccgca agcttgtcga ccccggaaat ttcaatggct ttg 43

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 正向扩增引物3

<400> 10

ggatcctcta gaactagtca tgtcgctcat cccaaatttc c 41

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 反向扩增引物3

<400> 11

gtcagaaggc ctcccgggcc ccggaaattt caatggcttt g 41