具体实施方式

下面结合附图1-6和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

本发明的发明人在可支持HBV复制和感染的细胞系筛选过程中，发现BEL-7404细胞系在过表达hNTCP和HNF4α基因后可以较好的支持HBV的复制和感染，具有较高的转染效率，可以应用于对HBV复制和感染机制的研究以及筛选对HBV有抑制作用的药物。

本发明的一个具体实施方案中提供了BEL-7404在HBV研究中的新用途。

在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种基于BEL-7404构建的可支持HBV复制和感染的7404NT-HNF4α细胞模型，可以应用于对HBV复制和感染机制的研究以及筛选对HBV有抑制作用的药物。

另外，在本发明揭示了在7404NT-HNF4α细胞模型在HBV研究中的新用途，本领域技术人员在获知该启示的基础上，可以开发出以7404NT-HNF4α细胞模型为前体的其他细胞模型，以及7404NT-HNF4α细胞模型在生物学研究中可接受的其他应用等。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例

hNTCP的信息(Gene ID:6554；RefSeq NM_003049)

HNF4α的信息(Gene ID:3172；RefSeq NM_001287182)

实施例1

通过荧光显微镜和细胞流式实验观察在BEL-7404转染pCMV-EGFP质粒后的转染效率：

1.在6孔板中接种BEL-7404细胞(该BEL-7404细胞由中国科学院细胞库/干细胞库提供，目录号为TCHu64)悬液(8×10⁵个/孔)，将培养板放在培养箱中预培养12小时，细胞贴壁生长。

2.每孔使用Turbofect transfection reagent(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)转染试剂4μl与2μg pCMV-EGFP质粒进行转染实验，37℃培养48小时，在荧光显微镜下观察荧光表达效果，实验结果如图1A所示。本步骤中的pCMV-EGFP质粒由申请人自己构建，具体方法为：使用PCR结合限制性酶切与连接的方法将EGFP cDNA序列克隆到pCDN3.1(V79520,Invitrogen)载体中。

3.将细胞在孔板中用胰酶消化下来，用移液枪吹打混匀制成单细胞悬液，吸取到1.5ml的EP管中，在EP管管底肉眼可见细胞沉淀，弃去上清。

4.在细胞沉淀中加入1ml的Cell Staining Buffer，重悬细胞后，350g离心5min，弃去上清，重复两次。

5.用Cell Staining Buffer重悬细胞，计数活细胞数，按照细胞个数为5×10⁶cells/ml将这些细胞悬液以100μl/管分装至新的1.5ml EP管中，将样品转移到上机检测的玻璃管中，做好标记，接下来用流式细胞仪进行分选测定，之后用FlowJo软件进行数据分析。实验结果如图1B所示。

实验结果显示，BEL-7404细胞转染pCMV-EGFP质粒后比Huh7细胞系有更高的转染效率且荧光表达强度较高。

实施例2

Southern blot实验检测在BEL-7404中过表达HNF4α基因后可支持完整HBV的复制，具体实验包括：

1.在60mm培养皿中接种BEL-7404细胞悬液(1×10⁶个/皿)，将培养皿放在培养箱中预培养12小时，细胞贴壁生长。

使用16μl Turbofect转染试剂将4μg pHNF4α与4μg p1.3×HBV复制子质粒共同转染进BEL-7404细胞中，对照组转染4μg空载质粒和4μg p1.3×HBV复制子质粒。96h后提取细胞内HBV DNA进行Southern blot实验。其中，pHNF4α的构建方法为使用PCR结合限制性酶切与连接的方法将HNF4αcDNA序列克隆到pCDN3.1(V79520,Invitrogen)载体中。

p1.3×HBV复制子质粒的构建方法为以HBV毒株序列为模板，用PCR结合限制性酶切的方法分步将1.3拷贝HBV基因组克隆到pUC18(Cat.3218,Takara)载体。序列已上传至NCBI官网，序列编号为KR232337(参考文献：Shen,Z.；Yang,H.；Yang,S.；Wang,W.；Cui,X.；Zhou,X.；Liu,W.；Pan,S.；Liu,Y.；Zhang,J.；Zhang,J.；Xie,Y.；Liu,J.,Hepatitis Bvirus persistence in mice reveals IL-21and IL-33as regulators of viralclearance.Nat Commun 2017,8,(1),2119.)

2.提取细胞内HBV核心颗粒内的DNA

1)细胞裂解：将转染后细胞弃上清，用预冷的PBS洗2遍，每100mm培养皿用400μl裂解缓冲液(0.5％V/V NP40，1mM EDTA，50mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.9)裂解细胞15min。

2)去除残余质粒和细胞基因组DNA：收集细胞裂解液，14000g离心5min，收集上清，弃细胞残骸。加入4μl 1M氯化镁，8μl 10mg/ml DNase I，37℃水浴中消化30min。

3)PEG沉淀病毒颗粒：消化产物经14000g离心，保留上清。加入12μl 0.5M EDTA和100μl 35％PEG8000/1.75M氯化钠，混匀后，4℃沉淀过夜。14000g离心10min弃上清留沉淀。

4)第二次去除残余质粒和细胞基因组DNA：将沉淀用100μl DNase I溶液重悬(1μl1M Tris-HCl，pH7.9，1μl 10mg/ml DNase I，1M氯化镁，剩余用水补平)。37℃消化30min。

5)蛋白酶K消化，去除病毒衣壳：在上述溶液中，加入300μl SDS/蛋白酶K溶液，37℃消化过夜。

6)苯酚/氯仿抽提，沉淀病毒DNA：用等体积的苯酚/氯仿抽提两次，再加入2μl20mg/ml糖原、1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)溶液和等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀过夜。15000g离心15min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗两遍并弃尽乙醇，静置待残留乙醇挥发后，用20μl灭菌蒸馏水溶解。

3.Southern blot检测HBV复制

琼脂糖电泳：将提取的细胞内HBV DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳(100V，1.5h)。

2)变性：将电泳后的凝胶置于新鲜配置的变性液(0.5M NaOH和1.5M NaCl)中，室温震荡变性1h。

3)中和：弃变性液，倒入中和液(1.5M NaCl和1M Tris-HCl，pH 7.4)中和，室温震荡中和两次，每次30min。

4)转膜：使用向下毛细管转移法，转移系统由下至上分别是：吸水纸、Parafilm膜、2层3mm滤纸、尼龙膜、含DNA的琼脂糖凝胶、2层3mm滤纸、两端浸在20×SSC缓冲液(3M NaCl和0.3M柠檬酸钠)里的盐桥。常温转膜8h以上。

5)DNA交联：转膜后，取出尼龙膜，尼龙膜用2×SSC浸泡5min，沥干多余液体，将尼龙膜置于两张滤纸之间，紫外交联90s。

预杂交：将膜放入杂交管中，加入杂交液5ml，42℃预杂交30min。

7)探针变性和杂交：取适量探针，于100℃金属浴变性5min，然后迅速将变性的探针放置于冰上5min。回收预杂交液，换入新鲜的杂交液5ml，加入变性好的探针，42℃杂交6～8h。

8)洗去除未结合的探针：先用2×SSC室温洗2遍，每遍5min。再用0.5×SSC，68℃洗2遍，每遍15min；

9)封闭：用Maleic acid buffer稀释10×Blocking solution至1×封闭工作液，加入适量封闭液，37℃封闭30min。

10)孵育抗体：用上述1×封闭液稀释anti-DIG AP抗体(抗体按1:10000稀释)，弃封闭液并换入适量抗体孵育液，37℃孵育30min。

11)洗去未结合抗体：用washing buffer在37℃洗膜2次，每次15min。

12)显色：先用detection buffer平衡膜5min，同时用detection buffer稀释、配制1×CSPD显色液。将平衡好的尼龙膜置于Parafilm膜上，正面朝上，均匀滴加显色液，再盖一层Parafilm膜，去除尼龙膜正面的气泡和多余的显色液，避光室温放置5min，用化学发光检测仪器检测累积信号，保存结果。

实验结果如图2所示，BEL-7404经pHNF4α和HBV复制子质粒共同转染后可检测到有较强的HBV复制，单独转染p1.3×HBV复制子未检测到复制产生。

实施例3

构建7404NT-HNF4α细胞系，通过实时定量PCR(qPCR)和Western blot检测在细胞中hNTCP和HNF4α的表达水平

1.构建7404NT-HNF4α细胞系：用慢病毒感染的方式分步进行稳转细胞系的构建。

hNTCP和HNF4α重组慢病毒质粒构建示意图分别如图5和图6所示。其中，图5是基于Tet-on表达调控系统构建的HNF4α质粒图谱。此系统表达需要Tet-on和TRE-HNF4α两种基因表达。原理如下：TRE为Tet-on的应答启动子，在四环素(DOX)存在时，可以活化Tet-on表达，从而激活TRE启动子启动HNF4α的转录，因此，在细胞系构建过程中进行了两步慢病毒感染过程，图6中左图为第一步使用的Tet-on质粒表达图谱，右图为TRE-HNF4α质粒表达图谱(FLAG为方便检测的标签基因)。二者是使用的是相同的慢病毒表达载体，但插入的表达基因不同。

1)制备hNTCP,HNF4α重组慢病毒浓缩液，利用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)基因转染技术，将慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene,Watertown,USA),pMD2.G(Addgene,Watertown,USA)和hNTCP过表达质粒pCDH-hNTCP-Blast或pLVX-Tet-on 3G或pLVX-TRE-Flag-HNF4α-Puro按质量比3:1:4同时转染到HEK293T细胞中，转染后72h收集含慢病毒的培养上清，用0.45μm滤膜过滤后浓缩，-80℃保存。

2)用制备的hNTCP慢病毒感染BEL-7404细胞，经抗生素筛选鉴定。

3)使用Tet-On系统(Clontech，Mountain View,USA)构建含HNF4α的慢病毒感染系统，使用该系统可以通过四环素(doxycline,DOX)诱导HNF4α的表达，以此来达到调控目的。在上一步筛选出的BEL-7404-hNTCP细胞上进行感染，经抗生素筛选后得到纯化的BEL-7404-NTCP-Tet-on-HNF4α(7404NT-HNF4α)细胞系。

2.使用实时定量PCR(qPCR)方法检测细胞中hNTCP和HNF4α的转录水平：

1)使用传统的Trizol提取法进行RNA抽提。

2)RNA逆转录采用天根FastKing一步法合成cDNA(Tiangen,KR118)。

3)实时定量PCR采用天根SYBR Green I嵌合荧光法进行(Tiangen,FP205)。扩增引物采用针对hNTCP和HNF4α基因的特异性引物：hNTCP上游引物：5’-AAGGACAAGGTGCCCTATAAAGG-3’(SEQ ID NO:1)；下游引物：5’-TTGAGGACGATCCCTATGGTG-3’(SEQ ID NO:2)；HNF4α上游引物：5’-CGAAGGTCAAGCTATGAGGACA-3’(SEQ ID NO:3)；下游引物：5’-ATCTGCGATGCTGGCAATCT-3’(SEQ ID NO:4)。结果如图3A所示。

3.使用Western blot方法检测细胞中hNTCP和HNF4α的蛋白表达水平

1)使用SDS裂解液将细胞裂解，收集细胞裂解液，离心后取上清，加入蛋白上样缓冲液，100℃变性5min。

2)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，抗体孵育[anti-β-actin(Sigma-Aldrich),anti-HNF4α(C11F12,Cell Signaling Technology,Beverly,USA)and anti-SLC10A1(Sigma-Aldrich)]，进行相应的二抗孵育后用ECL Blotting Substrate(Millpore)进行显色。结果如图3B-3C所示。

结果显示，构建的7404NT-HNF4α细胞具有较高的hNTCP和HNF4α表达水平，且HNF4α的表达可通过在培养基中加入DOX进行调控。

实施例4

通过酶联免疫吸附实验(ELISA)与Southern blot检测HBV在7404NT-HNF4α细胞中的HBsAg与HBeAg表达及复制水平，ELISA检测HBV在7404NT-HNF4α细胞中的感染水平：

1.在7404NT-HNF4α细胞中转染p1.3×HBV复制子后，使用上海科华的ELISA检测试剂盒检测上清中HBsAg与HBeAg表达水平，结果如图4A所示。使用实施例2中的方法检测HBV的复制，结果如图4B所示。

2.使用浓缩的HBV(MOI＝1000)感染7404NT-HNF4α细胞，感染体系中加入2.5％DMSO和4％PEG8000。12h后换液，PBS洗五次，加入含2.5％DMSO的完全培养基，之后48h进行换液并收集上清，ELISA检测上清中HBeAg表达水平。结果如图4C所示。

结果显示，构建的7404NT-HNF4α细胞在DOX的诱导下，HBsAg与HBeAg表达水平显著提升，可以支持HBV的复制，还可以被HBV感染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。