具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由 此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发 明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使 用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域 技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市 场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

现有技术公开，SARS-CoV-2是一种基因组大小从29.8kb到29.9kb不等，有包膜的单 股正链RNA病毒，属于冠状病毒家族β属。SARS-CoV-2基因组基因1中编码两个大的重 叠开放阅读框(ORF1a和ORF1b)及多种结构和非结构辅助蛋白。在感染后，SARS-CoV-2 劫持宿主细胞的翻译机制，合成ORF1a和ORF1b多聚蛋白，这些多聚蛋白随后被蛋白酶水 解切割成16种成熟的非结构蛋白，即NSP1到NSP16。其中NSP1是冠状病毒的重要毒力 因子，通过直接与40S小核糖体亚单位结合，有效地抑制了宿主mRNA的翻译，在抑制宿 主基因表达、促进病毒复制和免疫逃避等方面发挥着重要作用。另一方面，NSP1可以通过 与SARS-CoV-2的5’UTR结合而促进其翻译。因此NSP1是限制SARS-CoV-2复制的一个 潜在治疗靶点。

本发明以NSP1为靶点，发现了几种核酸，该核酸序列可以形成茎环结构(Stem-loop, SL)，在转入细胞后，SL可以靶向NSP1，抑制病毒蛋白质的合成，进而抑制病毒的复制， 可为治疗SARS-CoV-2患者提供新的思路和方案。具体地：

本申请人首先发现核酸分子1：具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；能够形成茎 环结构SL，抑制病毒蛋白质的合成，进而抑制病毒的复制，所述茎环结构SL包括SL1、SL2、SL3、SL4、SL4.5和SL5共6个茎环分段；

随后本申请人经过试验发现，单独的SL1、SL2、SL3、SL4、SL4.5和SL5核酸分子以及将其进行不同长度的串联，分别为SL1+SL2，SL1+SL2+SL3，SL1+SL2+SL3+SL4， SL1+SL2+SL3+SL4+SL4.5，SL1+SL2+SL3+SL4+SL4.5+SL5，SL2+SL3+SL4+SL4.5 +SL5，SL3+SL4+SL4.5+SL5，SL4+SL4.5+SL5，SL4.5+SL5也能够形成茎环结构，抑制 病毒蛋白质的合成，进而抑制病毒的复制。

因此，以上核酸分子的一种或者一种以上的任意组合均能够作为抗新型冠状病毒的核 酸类药物。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种抗新型冠状病毒的核酸及其药物组合物 与应用进行详细说明。

实施例1、茎环结构串联设计与体外合成

1、茎环SL核苷酸串联设计

如图1所示，本发明构建了六种RNA序列，命名为SL1，SL2，SL3，SL4，SL4.5， SL5，并将其进行不同长度的串联，分别为SL1+SL2，SL1+SL2+SL3，SL1+SL2+SL3+SL4， SL1+SL2+SL3+SL4+SL4.5，SL1+SL2+SL3+SL4+SL4.5+SL5，SL2+SL3+SL4+SL4.5 +SL5，SL3+SL4+SL4.5+SL5，SL4+SL4.5+SL5，SL4.5+SL5，命名为SL1-2，SL1-3，SL1-4， SL1-4.5，SL1-5，SL2-5，SL3-5，SL4-5，SL4.5-5。

2、茎环SL核苷酸串联的体外合成

(1)获得各茎环SL核苷酸的cDNA

如下表所示，将上述不同串联长度的SL核苷酸的5’端加上T7启动子的基序TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO:11)，委托擎科生物技术有限公司合成。在其他 实施方式中也可采用sp6的基序ATTTAGGTGACACTATAGAAGNG(SEQ ID NO:12)；以所 述合成的SL序列为模板分别通过PCR扩增获得SL1，SL2，SL3，SL4，SL4.5，SL5，SL1-SL2， SL1-SL3，SL1-SL4，SL1-SL4.5，SL1-SL5，SL2-SL5，SL3-SL5，SL4-SL5，SL4.5-SL5 cDNA。

所用引物对分别如表1所示：

表1-扩增cDNA对应引物

表2-引物

所述PCR反应体系如表3所示：

表3

PCR反应程序：94℃，2min后进入循环：98℃，10s；55℃，30s；68℃，30s。共35 个循环，然后4℃保存。随后通过DNA琼脂糖电泳回收获得各SL核苷酸的cDNA。然后 通过OMEGAE.Z.N.A.Gel Extraction Kit，纯化上述得到的cDNA，操作程序如下：

①在EP管中加入100μL binding buffer和100μL PCR产物，混合均匀，将混合物加入 吸附柱，最大转数离心1min，弃去废液。

②向吸附柱中加入300μL binding buffer，最大转数离心1min，弃去废液。

③向吸附柱中加入700μL SPW buffer，最大转数离心1min，弃去废液。

④重复③

⑤将吸附柱重新放回收集管，最大转数离心1min。

⑥将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管，在离心柱上滴加20μL Elution buffer，室温静 置2min，最大转数离心1min。

(2)通过纯化后的cDNA，再利用全式金T7 High Efficiency Transcription Kit体外转录 上述cDNA，即可各cDNA对应的RNA序列，反应体系及步骤如下：

表4

充分混匀后37℃孵育2h，加入1μL DNase I，37℃反应15min后，加入1μL 500mMEDTA (pH 8.0)终止反应，获得RNA；

上述步骤得到的RNA需要进一步纯化，操作步骤如下:

①加入苯酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合溶液，摇匀，成乳浊液，12000rpm， 4℃离心1min，取上清加入新的1.5mL EP管

②加入1/10体积5M醋酸铵，2倍体积无水乙醇，-20℃静置15min。

③4℃，13000rpm离心15min，弃上清，晾干后加100μL DEPC水，-80℃保存。

实施例2、SL5通过竞争性结合NSP1导致病毒RNA的转录抑制

(1)荧光素酶报告系统检测NSP1蛋白对5’UTR对对蛋白翻译的抑制

文献报道SARS-CoV-2非结构蛋白NSP1与宿主细胞核糖体结合，阻止宿主细胞mRNA进入核糖体，抑制宿主细胞mRNA的翻译，如图2A所示。但是，病毒基因组的5’UTR形 成茎环结构结合NSP1使其从核糖体上脱离，因此，病毒RNA基因组可以进入核糖体并翻 译成病毒蛋白质，如图2B所示。为了验证上述功能，我们设计了病毒5’UTR为启动子的 荧光素酶报告基因质粒模拟病毒RNA转录(5’UTR-luciferase)，同时采用CMV启动子的报 告基因质粒模拟细胞mRNA的转录(CMV-renilla)，共转NSP1蛋白检测其对病毒RNA翻译 的促进作用和宿主RNA翻译的抑制作用。具体操作如下：

将293A细胞铺于24孔板，待细胞长至30％-50％时，组1共转500ng CMV-renilla和100ng pCAG空载或者pCAG-NSP1，组2共转500ng 5’UTR-luciferase和100ng pCAG空载 或者pCAG-NSP1。37℃培养24h后检测荧光值。实验结果如图3所示，NSP1可以显著抑 制CMV-renilla的表达(图3A)，说明NSP1对细胞的mRNA翻译具有显著抑制作用；而 NSP1不抑制5’UTR-luciferase报告质粒的转录(图3B)，说明病毒RNA的5’UTR可以逃 逸NSP1的翻译抑制作用。

(2)检测SL核苷酸对NSP1翻译抑制作用的干扰功能

将293A细胞铺于24孔板，待细胞长至30％-50％时，组1和组2分别转染20pmolncRNA， 实验组组3-组18分别转染20pmol茎环RNA SL1，SL2，SL3，SL4，SL4.5，SL5，SL1-2，SL1-3，SL1-4，SL1-4.5，SL1-5，SL2-5，SL3-5，SL4-5，SL4.5-5，37℃培养8h。

组1共转500ng 5’UTR-luc和100ng pCAG，组2-18共转500ng 5’UTR-luciferase和100ng pCAG-NSP1。37℃培养24h后检测荧光值。

实验结果显示，在表达NSP1的情况下，带有SARS-CoV-2病毒5’UTR的荧光素酶基因可以逃逸NSP1的蛋白翻译抑制作用，进行正常的蛋白表达。此时，转染不同的茎环核苷酸SL后，5’UTR-luciferase的荧光值均有不同程度下降，其中，SL5以及含有SL5的不同 截短SL对5’UTR-luciferase的表达抑制最明显(结果如图4所示)，说明茎环核苷酸，尤 其是SL5，可以抵消5’UTR逃逸NSP1的翻译抑制功能，即SL5通过竞争性结合NSP1导 致病毒RNA的翻译同样受到抑制，因此SL5具有抑制SARS-CoV-2蛋白表达的潜在功能。

实施例3、检测SL对SARS-CoV-2蛋白表达的抑制作用

(1)检测不同串联的SL核苷酸对5’UTR-N蛋白翻译抑制的功能

为了验证本发明设计的SL核苷酸是否抑制SARS-CoV-2蛋白表达，本实施例使用5’UTR启动子的SARS-CoV-2结构蛋白N进行实验。

将293A细胞铺于24孔板，待细胞长至30％-50％时，组1和组2分别转染20pmolncRNA， 实验组组3-组13分别转染20pmol茎环RNA SL1，SL1-2，SL1-3，SL1-4，SL1-4.5，SL1-5， SL2-5，SL3-5，SL4-5，SL4.5-5，SL5，37℃培养8h。

组1共转500ng 5’UTR-luciferase和100ng pCAG，组2-13共转500ng 5’UTR-N和100ng pCAG-NSP1。37℃培养24h后检测N蛋白表达量。

结果如图5所示，NSP1表达的情况下，5’UTR启动子的N蛋白表达量均未受影响，而在共转染不同串联形式的SL核苷酸后，N蛋白表达量不同程度的下降，尤其是SL5或与 SL5串联的核苷酸SL对5’UTR-N表达的抑制最明显。说明SL5可以显著抑制5’UTR启动 子的N蛋白表达；与SL5串联的核苷酸SL(SL1-5，SL2-5，SL3-5，SL4-5，SL4.5-5)同 样具有抑制5’UTR启动子的N蛋白表达功能。

(2)检测SL5截短茎环RNA对5’UTR-N蛋白翻译抑制的功能

为了验证本发明设计的SL5核苷酸截短茎环RNA(即SL5a、SL5b、SL5c)是否抑制SARS-CoV-2蛋白表达，本实施例使用5’UTR启动子的SARS-CoV-2结构蛋白N进行实验。

将293A细胞铺于24孔板，待细胞长至30％-50％时，各组转染100ng pCAG-NSP1，同时，组1转染20pmol ncRNA，实验组组2-组5分别转染20pmol SL5，SL5a，SL5b，SL5c，37℃培养24h后检测N蛋白表达量。

结果如图6所示，NSP1表达的情况下，转染ncRNA组的5’UTR N蛋白表达量未受影响，而在共转染SL5后，N蛋白表达量明显下降；类似的，共转染SL5的截短核苷酸SL5a、SL5b、SL5c后5’UTR-N表达量也明显下降。说明SL5以及SL5的截短核苷酸具有抑制5’UTR 启动子的N蛋白表达功能。

(3)检测SL5对SARS-CoV-2活病毒的蛋白表达的抑制作用

为了进一步验证本发明设计的SL5是否抑制SARS-CoV-2活病毒的蛋白表达，本实施 例使用不同剂量的SL5转染Vero-E6-ACE2细胞后，感染SARS-CoV-2活病毒，检测细胞裂解液中病毒N蛋白与S蛋白的表达情况，具体操作如下：

将293A细胞铺于24孔板，待细胞长至30％-50％时，组1不做处理，组2转染200pmolncRNA，实验组组3-组5分别转染50pmol、100pmol、200pmol茎环RNA SL5，37℃培养 8h。

随后将细胞培养板移入ABSL-3实验室中，感染MOI＝0.01的SARS-CoV-2，继续培养24小时后，收集细胞，加入2x SDS loading buffer制样，100度金属浴15min，然后通过western blot分析SARS-CoV-2N蛋白与S蛋白的表达情况。

实验结果如图6所示，转染对照ncRNA的细胞在感染SARS-CoV-2后，病毒的N蛋 白与S蛋白的表达不受影响，而转染不同剂量SL5的细胞在感染SARS-CoV-2后，病毒的 N蛋白与S蛋白的表达量均被SL5剂量依赖地抑制，这说明SL5具有抑制SARS-CoV-2活 病毒蛋白表达的功能，是具有抑制SARS-CoV-2复制的潜在核酸药物。

结合图5、图6的实验结果，可以毫无疑义的推断其他茎环结构比如SL1-5，SL2-5，SL3-5，SL4-5，SL4.5-5具有抑制SARS-CoV-2蛋白表达的作用。这说明与SL5串联的其他 SL核苷酸均具有抑制SARS-CoV-2蛋白表达的作用，是具有抑制SARS-CoV-2复制的潜在 核酸药物。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还 包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的 要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概 念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选 实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和 范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内， 则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 抗新型冠状病毒的核酸及其药物组合物与应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

auuaaagguu uauaccuucc cagguaacaa accaaccaac uuucgaucuc uuguagaucu 60

guucucuaaa cgaacuuuaa aaucugugug gcugucacuc ggcugcaugc uuagugcacu 120

cacgcaguau aauuaauaac uaauuacugu cguugacagg acacgaguaa cucgucuauc 180

uucugcaggc ugcuuacggu uucguccgug uugcagccga ucaucagcac aucuagguuu 240

cguccgggug ugaccgaaag guaagaugga gagccuuguc ccugguuuca acgagaaaac 300

<210> 2

<211> 39

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

auuaaagguu uauaccuucc cagguaacaa accaaccaa 39

<210> 3

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaucucuugu agauc 15

<210> 4

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

guucucuaaa cgaac 15

<210> 5

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cuguguggcu gucacucggc ugcaugcuua gugcacucac gcag 44

<210> 6

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uaauuaauaa cuaauua 17

<210> 7

<211> 145

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ucguugacag gacacgagua acucgucuau cuucugcagg cugcuuacgg uuucguccgu 60

guugcagccg aucaucagca caucuagguu ucguccgggu gugaccgaaa gguaagaugg 120

agagccuugu cccugguuuc aacga 145

<210> 8

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcugcuuac gguuucgucc guguugcagc c 31

<210> 9

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacaucuagg uuucguccgg gugug 25

<210> 10

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accgaaaggu 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taatacgact cactataggg 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atttaggtga cactatagaa gng 23

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatacgact cactataggg attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaa 59

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttggttggtt tgttacctgg gaaggtataa acctttaatc cctatagtga gtcgtatta 59

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taatacgact cactataggg gatctcttgt agatctgttc tctaaacgaa c 51

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gatctacaag agatccccta tagtgagtcg tatta 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taatacgact cactataggg gttctctaaa cgaac 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gttcgtttag agaaccccta tagtgagtcg tatta 35

<210> 19

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taatacgact cactataggg ctgtgtggct gtcactcggc tgcatgctta gtgcactcac 60

gcag 64

<210> 20

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctgcgtgagt gcactaagca tgcagccgag tgacagccac acagccctat agtgagtcgt 60

atta 64

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

taatacgact cactataggg taattaataa ctaatta 37

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

taattagtta ttaattaccc tatagtgagt cgtatta 37

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taatacgact cactataggg tcgttgacag gacacgagta actcgtctat cttc 54

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcgttgaaac cagggacaag gctctccatc ttacctttcg gtcacacccg 50