阅读说明：本技术 一种利用生物膜层干涉技术测定氧化石墨烯对小球藻胞外聚合物亲和力的方法 (Method for determining affinity of graphene oxide to chlorella extracellular polymeric substances by utilizing biofilm interference technology ) 是由 周启星 吴康迎 欧阳少虎 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用生物膜层干涉技术测定氧化石墨烯对小球藻胞外聚合物亲和力的方法。首先通过选取APS传感器,将GO可以固化到APS传感器上,构建APS-GO传感器。其次,APS-GO传感器借助BLI分子相互作用仪可与不同浓度梯度的EPS进行亲和实验测试,目标EPS被固化在APS表面的GO特异性捕获结合。接着,将APS-GO传感器捕获EPS。最后,基于结合和解离实验的数据,分析出GO对EPS的吸附常数K-(on)、解离常数K-(dis)和亲和力常数K-(D)。本发明利用生物膜层干涉技术可在30分钟内实现GO对小球藻EPS亲和力常数的测定,具有无需借助人工标签,可直接检测,且耗量少,结果准确等优点。(The invention discloses a method for determining the affinity of graphene oxide to chlorella extracellular polymeric substances by utilizing a biofilm interference technology. The APS-GO sensor is constructed by first selecting an APS sensor and solidifying GO onto the APS sensor. Secondly, the APS-GO sensor can be subjected to affinity experimental tests with EPS with different concentration gradients by means of a BLI molecular interaction instrument, and the target EPS is specifically captured and bound by GO solidified on the surface of APS. Next, the APS-GO sensor is captured of the EPS. Finally, analyzing the adsorption constant K of GO to EPS based on the data of combination and dissociation experiments on Dissociation constant K dis And affinity constant K D . The method can realize the determination of the GO on the EPS affinity constant of the chlorella in 30 minutes by utilizing the biomembrane interference technology, and has the advantages of no need of manual labeling, direct detection, low consumption, accurate result and the like.)

一种利用生物膜层干涉技术测定氧化石墨烯对小球藻胞外聚 合物亲和力的方法

技术领域

本发明涉及测定氧化石墨烯对小球藻胞外聚合物之间亲和力的方法，特别是一种利用生物膜层干涉技术测定氧化石墨烯对小球藻胞外聚合物亲和力的方法。

背景技术

氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是一种从氧化石墨上剥离下来的具有单原子层厚度的二维纳米材料。GO以其优异的性能广泛应用与化学、物理、生物、制造及环保等领域。随着GO在各领域的广泛应用和产量的快速增长，它暴露于环境中的风险越来越大，同时GO在水溶液中具有优越的分散性，所以了解GO在水体中的环境行为和生物效应是非常有必要的，小球藻作为水生毒理研究的模式生物，研究GO与小球藻胞外聚合物(extracellularpolymeric substances，EPS)的相互作用对于探索GO在水体中的环境行为和生物效应具有重要意义。

生物膜层干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术是基于光干涉原理的非标记技术，它借助光纤生物传感器可以实时检测由于表面厚度变化而导致的干涉信号变化，这种实时检测到的变化可以用来计算结合及解离的速度等。该技术除具备非标记生物分析方法的优势外，还具有操作简单、无损检测、样品耗量少、实时提供分析物的直接信息和相互作用情况等优点。正是由于具备这些优点，BLI技术已被广泛应用于生物分子的动力学分析和快速检测。同时，BLI技术逐渐应用于纳米材料的动力学分析。因此，BLI技术作为一种测定GO的亲和力方法具有广阔的发展前景。在本专利中，BLI技术将用于探索GO与小球藻EPS之间的结合亲和力。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在的问题和现有技术，提供一种利用BLI技术测定GO对小球藻EPS亲和力的方法，本方法通过装有BLI的分子相互作用仪实现。可快速，准确，定量分析出GO对EPS的亲和力。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种利用生物膜层干涉技术测定氧化石墨烯对小球藻胞外聚合物亲和力的方法，包括如下步骤：

(1)、样品板的准备：包括缓冲溶液选择和GO、EPS水溶液的配制，缓冲溶液选用超纯水，GO和小球藻EPS以超纯水为溶剂，并冰浴超声、调节pH值等于所选缓冲溶液的pH值，配制水溶液；将缓冲溶液、GO溶液和小球藻EPS溶液按一定排列顺序加入全黑96孔板中待测。

(2)、构建APS-GO传感器：利用非共价结合和疏水作用，使GO很与Aminorpropylsilane(APS)传感器结合，将GO固化到APS传感器。

(3)、亲和力测试：亲和力测试包括五个步骤：a.基线平衡(Baseline)；b.GO固化(Loading)到APS传感器表面，即构建APS-GO传感器；c.再次基线平衡(Baseline)；d.APS-GO传感器与EPS结合实验(association)测定结合常数K_on(association rate)；e.APS-GO传感器与EPS解离(dissociation)实验测定解离常数K_dis(dissociationrate)。

(4)、利用BLI分子相互作用仪平台自带的Data Analysis Software 9.0软件来分析数据，计算得到GO对小球藻EPS亲和力常数(K_D)。

所述步骤(1)中，经过预实验，确定缓冲溶液类型为超纯水以及EPS的检测范围为10000～90000nM，GO和二种EPS以超纯水为溶剂，具体参数为：GO冰浴超声30min,浓度为100mg/L；可溶性胞外聚合物(Soluble extracellular polymeric substances，S-EPS)、结合型胞外聚合物(bound extracellular polymeric substances，B-EPS)冰浴超声30min,并在检测范围内设置数个浓度梯度。并依次将GO、EPS水溶液的pH值调节至与缓冲溶液的pH值相近。96孔板型号为Grenier 655209。

所述步骤(2)中，APS传感器使用前需要在缓冲溶液中预湿平衡时间为10min左右。

所述步骤(3)中，亲和力测试实验参数为：a.基线平衡时间为60s左右；b.GO固化时间为5～10min；c.再次基线平衡时间为60s左右；d.结合实验时间为5～10min；e.解离实验时间为5～30min。温度设定为25～30℃。

本发明的技术进步表现如下：该方法能够利用生物膜层干涉技术快速、高通量测定出氧化石墨烯和二种胞外聚合物的亲和力常数，无需借助人工标签，可直接检测、分析生物分子样品，避免了化学标签对研究结果的影响，且耗量少，结果准确。为测定纳米材料与生物大分子之间的亲和力提供了一种新思路。

附图说明

图1是本发明GO通过非共价键和疏水作用附着在APS传感器上并在全黑微孔板中测试与EPS亲和力的原理图；

图2是本发明实施例中亲和力测试实验样品板的排列顺序示意图；

图3是本发明实施例氧化石墨烯对二种胞外聚合物的BLI原始数据图,图3a是GO对S-EPS的BLI原始数据图，图3b是GO对B-EPS的BLI原始数据图；

图4是本发明实施例中二种胞外聚合物在氧化石墨烯表面的结合-解离动力学曲线，图4a是S-EPS在GO表面的BLI结合-解离动力学曲线，图4b是B-EPS在GO表面的BLI结合-解离动力学曲线；

表1是本发明实施例中BLI亲和力测试实验步骤与测试时间表；

表2是本发明实施例中不同级分EPS在GO表面的结合-解离动力学参数。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

图1是本发明GO通过非共价键和疏水作用附着在APS传感器上并在全黑微孔板中测试与EPS亲和力的原理图；本发明的实施例选取小球藻通过不同离心力与温度提取两级胞外聚合物：可溶性胞外聚合物(Soluble extracellular polymeric substances，S-EPS)、结合型胞外聚合物(bound extracellular polymeric substances，B-EPS)。

实施例

(1)、二种EPS的重均分子量(M_W)的测定：采用凝胶色谱渗透(GPC)法测定，测得S-EPS和B-EPS的重均分子量(M_W)分别为9.904kDa和8.733kDa。

(2)、样品板的准备：根据预实验的结果，缓冲溶液选用超纯水，GO和二种EPS以超纯水为溶剂，并冰浴超声30min、调节pH值近似等于超纯水的pH值,配制水溶液；按图2顺序将缓冲溶液、GO溶液和EPS溶液按一定排列顺序加入96孔板中待测，即：步骤一：在第1列加入缓冲溶液；步骤二：在第2列加入GO溶液；步骤三：在第3列加入缓冲溶液；步骤四：在第4列加入EPS缓冲溶液；步骤五：在第5列加入缓冲溶液。对于GO溶液，浓度固定为100mg/L；对于S-EPS溶液，摩尔浓度梯度设为10100nM、20190nM、60580nM、80780nM；对于B-EPS溶液，浓度梯度设为11400nM、34200nM、45600nM、68400nM。

(3)、亲和力实验测试：亲和力测试实验包括五个步骤:a.基线平衡(Baseline)60s；b.GO固化(Loading)到APS传感器表面300s；c.再次基线平衡(Baseline)60s；d.结合实验(association)测定结合常数K_on(association rate)420s；e.解离(dissociation)实验测定解离常数K_dis(dissociation rate)420s。

表1

依次在OCTET软件操作界面上进行设置：首先在样品板“plate definition”中根据实际加样的位置设置样品板；其次在“assay definition”进行步骤设定，“Shake speed”设置为1000rpm。根据亲和力测试实验实际设置参数进行调整；再在“sensor assignment”进行传感器位置设定；最后设置实验数据文件保存目录即实验温度，实验温度设为25℃。设置完后，点击平台上的图标按钮“GO”实验开始。

(4)、操作完上述步骤(3)后，操作界面显示实时的结合曲线，实验结束后，利用BLI分子相互作用仪平台自带的Data Analysis Software 9.0软件来分析数据，计算得到氧化石墨烯对小球藻二种胞外聚合物亲和力常数(K_D)。结果见图3，图4及表2，图中纵坐标均为结合信号。利用BLI技术测得GO对S-EPS的亲和力为K_D＝5.88E-07M，GO对B-EPS的亲和力为K_D＝9.05E-07M。

表2

注：K_on(M^-1s^-1)，结合速率，K_dis(1/s)，解离速率。亲和力常数K_D值(M)等于K_dis与K_on的比值。