具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验过程中用到的抗体和试剂如下，兔和小鼠单克隆抗KL抗体，兔抗Shank1和兔抗MDM2抗体来自英国Abcam公司；用小鼠抗泛素(P4D1)抗体检测泛素化；兔和鼠抗FLAG抗体，和大鼠单克隆高亲和力抗HA抗体来自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)；MG132来自密歇根州安娜堡市的MCE公司；组织培养基和试剂来自Invitrogen，购自ThermoFisher，Waltham，MA；限制性内切酶购自新英格兰生物实验室(NEB)(Danvers，MA)，所有其他化学品购自Sigma Aldrich。

试验数据采用spss19软件对定量数据进行统计分析。数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析，然后进行Bonferroni/Dunn事后均值比较和多重比较校正。p<0.05被认为差异显著。

一种Shank1通过与MDM2相互作用调节Klotho泛素化的机制研究，包括Shank1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用以及对Klotho的影响研究和Shank1/mdm2/Klotho三者之间相互作用研究。

实施例一"Shank1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用以及对Klotho的影响研究

1.1 NSCLC中的Shank1上调

为了鉴定NSCLC组织中Shank1的表达，我们用免疫组织化学方法检测了NSCLC组织(组织芯片)及其邻近正常肺组织中Shank1的蛋白水平，结果如图1所示，100例NSCLC肿瘤组织中，50例显示Shank1表达异常，明显高于相应的邻近正常肺组织；

进一步，我们用Western blot分析法检测了10对NSCLC组织及相应的邻近正常肺组织中的蛋白表达，结果如图2所示，与相应的正常肺组织样品相比，Shank1在肿瘤组织中的表达升高；

应用Kaplan-Meie网站(http://kmplot.com)的Kaplan-Meier分析，我们根据mRNA表达将高危组与低风险组进行了分化(log-rank检验，p<0.01)，结果如图3所示，高Shank1表达的NSCLC患者的总生存率低于低Shank1表达者，主要发生在腺癌，而非鳞癌，因此我们更加关注Shank1在LUAD细胞中的作用。此外，我们发现，这种相关性仅在非吸烟组或男性组中发现(如图4所示)。此外，我们还检测了与BEAS-2细胞相比，多种非小细胞肺癌细胞系中的Shank1蛋白表达，结果发现其在大多数NSCLC细胞系中表达升高(如图5所示)；"

为研究Shank1在非小细胞肺癌中是否发挥了重要作用，我们使用特定的Shank1-shRNAs(shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#)来阻止Shank1表达，利用Shank1-shRNAs转染A549和H1299细胞，然后用qRT PCR检测siRNAs的敲除效率，结果如图6和图7所示，Shank1-shRNAs转染A549细胞，Shank1-shRNA2和Shank1-shRNA3组Shank1 mRNA表达量显著降低(p<0.01#，Shank1-shRNAs转染H1299细胞，Shank1-shRNA1和Shank1-shRNA2组Shank1 mRNA表达量显著降低(p<0.01#，综合图6和图7结果可知，利用Shank1-shRNA2转染A549和H1299细胞，Shank1 mRNA表达量显著降低(p<0.01#；

通过CCK8测定，我们观察到Shank1-shRNA(sh-SHANK1)导致的SHANK1mRNA表达下调显著降低了A549和H1299细胞48和72小时的OD值(p<0.05)，如图8和图9所示，即CCK8实验结果显示SHANK1基因敲除抑制A549和H1299细胞增殖；

我们进一步利用克隆形成试验研究了A549、H1299和SK-MES-1细胞的增殖情况，为了获得较长的敲除效果，我们构建了具有sh-SHANK1序列的稳定的敲除细胞系，结果如图10和图11所示，Shank1-shRNA(sh-SHANK1)组克隆数在3个细胞系中下降到Shank1-shRNA(NC)组的60％左右，克隆形成实验显示SHANK1基因敲除抑制A549、H1299和SK-MES-1细胞生长。

上述实施例中免疫组织化学方法具体为将θ切片置于EDTA柠檬酸缓冲液(pH8.0)中，微波修复抗原，然后将载玻片与一抗(抗SHANK1、ab154224、Abcam)在4℃孵育过夜，以正常兔IgG作为阴性对照，以确保特异性，将载玻片用HRP-聚合物偶联二级抗体处理30min，用二氨基联苯胺溶液(DAB)显影，细胞核用苏木精复染，使用尼康相机和软件进行图像采集。

上述免疫组织化学方法所用的非小细胞肺癌组织芯片(TMA)购自Outdo Biotech(中国上海芯超生物技术有限公司)。

上述实施例中Western blot即蛋白质印迹分析，其中一抗，包括抗SHANK1(ab154224，Abcam)、抗SHANK3(ab93607，Abcam)、Bcl-2(ab32124，1:1000)、caspase3(ab13847，1:1000)、Bax(ab32503，1:1000)、AKT(ab8805，1:1000)、p-AKT(ab38449，1:1000)、cyclin D1(ab134175，1:1000)、P70(ab109393，1:1000)和GAPDH(ab181602,1:5000)，上述试剂均从Abcam购买。利用Quantity One软件，通过蛋白质/内参照计算靶蛋白的相对表达。

上述实施例中Kaplan-Meier分析具体为，利用TCGA数据库进行数据分析，计算对数秩P值和95％置信区间(CI)的危险比(HR)，并进行绘图。GEPIA网站应用于绘制基于TCGA数千个样本的存活图。

所述Kaplan-Meier分析是一个基于癌症基因组图谱数据库、欧洲基因组表型档案(EGA)和基因表达综合数据库(GEO)(仅限于affymetrix微阵列)的网站工具。

上述实施例中克隆形成试验与细胞增殖试验具体为，将A549、H1299和SK-MES-1细胞以每孔1000个细胞的密度接种于6孔培养板中，培养14天，直至出现明显的集落。菌落在10％甲醛中室温固定15min，1％结晶紫染色。CCK8用于细胞增殖试验。对正常培养的NSCLC细胞(即A549、H1299和SK-MES-1细胞)进行胰蛋白酶消化和计数，形成悬浮液，将1000个A549、H1299和SK-MES-1细胞分别接种到96孔板的每个孔中，用0.1％DMSO处理的细胞作为对照，每24小时加入1份CCK8试剂检测细胞活力，37℃孵育90min后，用酶标仪在450nm波长处测定激发光的OD值，根据OD值绘制增殖曲线，其中培养基为DMEM培养基，10％胎牛血清。

上述实施例中BEAS-2细胞为从非癌个体尸检中分离出正常人支气管上皮细胞。

上述实施例中A549、H1299和SK-MES-1购自南京凯基生物技术有限公司。

上述实施例中CCK8检测方法在发明专利“一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法”(授权公告号：CN109030835B)中已公开，在此不做赘述。

1.2 Shank1的敲除抑制NSCLC细胞的迁移、侵袭和诱导凋亡

为探讨Shank1在细胞迁移和侵袭中的表达，对转染Shank1-shRNA(sh-SHANK1)/Shank1-shRNA(NC)的A549和H1299细胞进行了transwell检测。结果显示，Shank1的下调显著减少了移植和侵袭性A549和H1299细胞的数量(P<0.01)，如图12和图13所示，结果表明Shank1是NSCLC运动的一个正向调节因子。

为了确定shRNA对细胞死亡的抑制作用，我们用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果如图14-图16所示，对照Shank1-shRNA(NC)和sh-Shank1转染A549细胞凋亡细胞比例分别为4.17％和9.42％，表明sh-Shank1增殖细胞数量的减少，确实是细胞死亡所致(P<0.01)，H1299细胞的结果相同。

为了进一步探讨Shank1调节细胞凋亡的分子机制，我们用western blot实验检测凋亡相关蛋白的表达。如图17所示，Shank1沉默可显著增加Bax和活性Caspase-3的表达，并降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结果表明下调Shank1可通过调节凋亡相关蛋白，促进细胞凋亡。为了探讨Shank1下调对NSCLC细胞抑制作用的机制，我们研究了用western blot实验检测PI3K-AKT/mTOR信号通路关键蛋白。PI3K-AKT/mTOR信号通路在肿瘤细胞增殖、细胞周期、凋亡和运动等方面起着重要作用，结果如图18所示，A549和H1299细胞AKT和mTOR磷酸化水平在沉默Shank1时显著下调(P<0.05)，提示Shank1失活的AKT/mTOR信号通路在NSCLC细胞中下调。

上述实施例中细胞transwell和侵袭试验具体为，在开始试验之前，配制涂层缓冲液，所述涂层缓冲液包括0.01M、pH为8.0的Tris和0.7％NaCl组成，并在无菌环境下过滤，将Matrigel基质(购自ThermoFisher，Waltham，MA)，分装，在4℃环境中解冻，然后用无血清1640培养基以1:6的比例稀释，向24孔板的每个渗透性支撑孔加入100μl，在37℃孵育4小时，在不影响基质凝胶层的情况下，小心地去除渗透性支撑膜，并分别向基质凝胶层内部和外部添加100ul和600ul无血清1640培养基，再放入在37℃下孵育30分钟。Transwell迁移实验的程序与侵袭实验相似，但无需Matrigel处理，每空细胞数为5000。

上述实施例中流式细胞术具体为将NSCLC细胞用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡，染色处理后，通过离心收集细胞，将2500g/min离心15min得到的细胞颗粒悬浮在500μg/ml的结合缓冲液中，其中结合缓冲液为5μL V-FITC和5μL PI溶液，室温孵育15min，用流式细胞仪(FACSCalibur)测定膜联蛋白V和PI染色，用FlowJo软件进行数据分析。

1.3 Shank1过表达以剂量依赖性方式降低KL的蛋白表达

为进一步研究Shank1和KL蛋白表达之间的关系，我们采用Western blot方法对6例NSCLC患者Shank1和KL蛋白表达进行了相关性研究。结果如图19所示，4例肿瘤组织Shank1高表达，KL低表达；2例肿瘤组织Shank1低表达，KL高表达。结果表明，Shank1在肺癌组织中的表达与KL的表达呈显著负相关。

KL蛋白水平的降低可能是由于KL合成减少或降解增加所致。为了确定Shank1调节的KL蛋白水平下降的过程，在检测KL表达的时间之前，将A549细胞与蛋白质生物合成抑制剂(放线菌酮，CHX)/蛋白酶体抑制剂(MG132)预孵育2小时，结果如图20所示，当蛋白酶体降解受到抑制时，KL蛋白水平的降低被阻断，结果表明Shank1可能通过降解途径，而不是生物合成途径调节KL蛋白水平。

实施例二"Shank1/mdm2/Klotho三者之间相互作用研究

2.1 Shank1与KL相互作用，增加KL的泛素化

根据B.Chen等(2019)报道可知，Shank1是一种潜在的KL相互作用蛋白。为了进一步研究Shank1与KL的相互作用，我们用Shank1-myc和KL-Flag载体转染A549细胞，用TNE缓冲液裂解，然后用抗Flag抗体免疫沉淀，进行Western印迹分析，再利用免疫共沉淀法检测成年大鼠肺组织中KL和Shank1的内源性联系，结果如图21所示，我们通过转染和免疫共沉淀实验，发现Shank1与A549细胞中的KL具有明确的相互作用。

我们用Shank1和KL抗体检测内源性Shank1和KL的定位，即用载体或Shank1-myc转染A549细胞，用TNE缓冲液裂解，用抗KL抗体免疫沉淀，IP法和Ub抗体western印迹法检测KL的泛素化，结果表明Shank1与KL部分共定位(如图22所示)。此外，如图23所示，Shank1显著增加KL的泛素化，说明Shank1在调节KL的泛素化和降解中发挥作用。

上述实施例中，细胞的转染包括细胞培养和转染，具体为将HEK-293、A549、H1299、H650细胞在添加10％FBS和1％青霉素链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中于37℃湿化培养箱中培养，根据制造商的说明，使用Opti MEM中的Lipofectamin 2000(ThermoFisher)(DNA:脂质为1:2.5)转染细胞。所有实验均在转染后48小时完成。

上述实施例中，免疫共沉淀试验根据B.Chen等(2019)报道进行操作。具体为将细胞(HEK293或A549)从细胞培养皿上刮下，在磷酸盐缓冲液(PBS)中2500转/分钟离心15min后收集沉淀，然后再悬浮在含有50％的免疫沉淀缓冲液(IPB)中，细胞在4℃裂解，缓慢转动1h并2500转/分钟离心15min除去碎片，上清液用25～30ulprotein G琼脂糖凝珠在4℃环境中孵育过夜，第二天，用IPB洗涤3次，在SDS缓冲液中煮沸洗脱5分钟。

所述免疫沉淀缓冲液(IPB)包含50mM Tris-Cl,2mM EDTA,250mM NaCl，10％(v/v)glycerol，0.5％NP-40,20mM NaF,1mM sodium orthovanadate,$10mM N-ethylmaleimide％

2.2 MDM2与KL相互作用，增加KL的泛素化

根据D.Wu等(2018)以及M.Wade等(2013)报道可知，MDM2是p53最有效的负调控因子之一。作为一种E3泛素连接酶，它能够通过调节p53的多泛素化和靶向p53的蛋白酶体介导的降解来下调p53的活性；从细胞核中输出p53；或者直接与p53结合以阻断关键靶点的反式激活。根据H.Hou等(2019)报道可知，MDM2在许多恶性肿瘤中过表达，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、胃癌、结直肠癌等。MDM2也能促进p21的降解。此外，MDM2与多种蛋白质分子有关，如E2F、p19(Arf)和Ras丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。

为了研究MDM2是否可以通过调节其泛素化来促进KL的降解。首先，我们检测MDM2是否能与KL形成复合物。我们用MDM2-HA和Flag-KL质粒转染A549细胞。在用FLAG抗体免疫沉淀KL后，通过使用HA抗体的免疫印迹分析观察到KL与MDM2的结合(如图24所示)。在HA的免疫沉淀和抗Flag抗体的免疫印迹后，也检测到Flag-KL和MDM2-HA之间的复合物(如图25所示)。我们用用兔抗KL(绿色)和小鼠抗MDM2(红色)抗体进行染色，用MDM2和KL抗体检测内源性MDM2和KL的定位，结果表明MDM2与KL部分共定位(如图26所示)。为了检测这种相互作用是否可以在生理条件下发生，我们对A549细胞进行内源性KL/MDM2免疫共沉淀测定，用小鼠抗MDM2或兔抗KL抗体对大鼠脑裂解液进行免疫沉淀，裂解物用抗MDM2抗体免疫沉淀，我们发现KL在内源性水平下与MDM2免疫共沉淀(如图27所示)。上述结果表明MDM2/KL在体内外均能形成复合物。

我们还进行了western blot检测KL的表达，用载体或MDM2转染A549细胞，用MG132处理，用TNE缓冲液溶解，用抗KL抗体免疫沉淀，采用免疫印迹法检测KL蛋白水平，结果如图28所示，进一步证实MDM2可以降低KL的表达，并且这种作用可以被MG132(蛋白酶体抑制剂)阻断。

此外，我们还检测了MDM2过表达是否能增强KL的泛素化。将表达MDM2基因MDM2-wt(HA标记)和DN突变体(MDM2-C462A)的构建体分别转染A549细胞，用TNE缓冲液溶解，然后用抗KL抗体免疫沉淀。我们发现MDM2-wt可以显著增加KL的泛素化，而MDM2的DN突变体(MDM2-C462A)不能起到同样的作用(如图29所示)。以上结果表明MDM2还可以作为KL的E3泛素连接酶，Shank1可以调节它们之间的相互作用。

上述实施例中，所述编码HA-和myc-标记的人类Klotho的质粒来自B.Chen等(2012)、B.Chen等(2019)的报道，编码Shank1、MDM2和相关突变体的质粒来自Youbio，其他突变通过PCR引入并经双脱氧测序证实。

2.3Shank1/KL/MDM2可形成复合物

我们通过基因敲除试验分析Shank1对MDM2与KL之间相互作用的影响，用免疫沉淀法和免疫印迹法检测转染MDM2-HA、KL-Flag和sh-Shank1的A549细胞裂解液，同时用免疫印迹法检测转染Shank1-myc或sh-Shank1载体的A549细胞裂解液中KL蛋白的表达，结果表明，Shank1基因敲除可以显著降低KL和MDM2之间的相关性(如图30所示)，KL的表达不受Shank1的影响(如图31所示)。

我们用小鼠抗dm2或Rb抗KL抗体免疫沉淀A549细胞裂解物，洗脱蛋白复合物，免疫印迹法检测MDM2、KL和Shank1的免疫沉淀蛋白，结果如图32所示，

我们用抗HA抗体免疫沉淀共转染Myc-Shank1/或siShank1、MDM2-HA和Flag-KL构建体的A549细胞裂解物，免疫印迹法检测免疫沉淀蛋白，结果如图33A所示；用抗Myc抗体免疫沉淀共转染Myc-Shank1r、MDM2-HA/或si-MDM2和Flag-KL构建体的A549细胞裂解液，免疫印迹法检测免疫沉淀蛋白，结果如图33B所示，在用特异性抗体免疫沉淀MDM2后，通过免疫印迹法也观察到KL与Shank1的关联。在KL的免疫沉淀中，也可以发现这种联系。Shank1的外源过表达可以增加KL和MDM2之间的相互作用，Shank1的沉默可以减少这种相互作用(如图33A所示)，而MDM2的表达水平不能影响KL和Shank1之间的关联(如图33B所示)。

我们转染siShank1的A549细胞裂解液，用KL抗体进行免疫印迹分析，检测免疫沉淀蛋白，在进行内源性MDM2/KL共免疫沉淀试验后，我们发现Shank1在内源性水平下也与KL共免疫沉淀，沉默Shank1可以削弱A549细胞中MDM2和KL之间的相互作用(如图34所示)。

鉴于MDM2是p53的一个重要的E3泛素连接酶，我们想检测Shank1是否也能调节p53和MDM2之间的相互作用，对此我们进行了免疫共沉淀分析，用抗HA抗体免疫沉淀共转染Myc-Shank1/或siShank1、MDM2-HA和Flag-p53载体的A549细胞裂解物，结果如图35所示，Shank1不能影响p53和MDM2之间的关联。Shank1还与Mdm2/KL复合物有关，并影响复合物的形成。

我们用载体或Shank1-myc构建体转染A549细胞，用TNE缓冲液溶解，然后用抗p53和p21抗体进行免疫印迹，如图36所示，结果表明，Shank1/KL/MDM2可以形成一个复合物，Shank1影响复合物的形成。

上述实施例中，Shank1基因敲除具体为，预先测试的Shank1 siRNA寡核苷酸从Invitrogen(通过ThermoFisher)合成。靶序列为5′-aagcttggcacgccaaaaaa-3′。编码siRNA的阴性对照寡核苷酸与任何已知哺乳动物序列均不同源，购自Invitrogen。

综上所述，Shank1是一个癌基因，通过与KL和MDM2结合，通过泛素降解下调KL，促进肺癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力，参与非小细胞肺癌的细胞增殖、凋亡、转化、侵袭和肿瘤进展。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。"

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。