具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，提供了一种β淀粉样蛋白低聚物的检测方法，包括如下步骤：

(a)制备β淀粉样蛋白低聚物的标准溶液；

(b)利用步骤(a)得到的标准溶液与其相应的吸光度比值绘制标准曲线；

(c)通过步骤(b)得到的标准曲线及处理后的待测样品的吸光度比值计算β淀粉样蛋白低聚物的含量；

其中，所述待测样品为肠道排泄物，所述β淀粉样蛋白低聚物包括Aβ40和Aβ42。

本发明提供的β淀粉样蛋白低聚物的检测方法，采用分光光度法检测人体肠道排泄物中β淀粉样蛋白低聚物的含量，该方法操作简单，能够达到定性半定量的有益效果。并且，对于与阿尔兹海默症密切相关的β淀粉样蛋白低聚物，应用本发明提供的检测方法，通过测定人体肠道排泄物样品对鉴别阿尔兹海默症的鉴别具有实际意义，对人体无任何损害。

在一些优选的实施方案中，Aβ40的标准溶液的制备方法包括：

用1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇将蛋白肽溶解并干燥，然后用二甲基亚砜将干燥后的固体复溶，并用PBS缓冲液稀释成浓度分别为35nM、50nM、100nM、150nM、250nM、300nM和400nM的Aβ40标准溶液。

使用1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶解蛋白肽，利用了六氟异丙醇(HFIP)高极性、与水和许多有机溶剂很容易混合以及热稳定性好等特点，使HFIP能够成为许多聚合体系中的一种理想溶剂。可使β淀粉样蛋白呈均匀的分散状态。

其中，蛋白肽的浓度例如可以为，但不限于1mg/ml。

优选地，蛋白肽溶解后还包括超声25～35min，然后再进行干燥处理。

超声能够使蛋白肽的溶解更加充分，超声的时间例如可以为，但不限于25min、28min、30min、32min或35min，优选超声30min，并使用氮吹法干燥，以避免发生氧化等其他不必要的反应；

优选地，复溶后还包括超声25～35s，然后再进行稀释处理。

同样地，使用超声能够进一步使固体在二甲基亚砜中充分溶解，超声的时间例如可以为，但不限于25s、28s、30s、32s或35s，优选超声30s。

优选地，还包括在37℃条件下孵育24h的步骤。

Aβ是人体代谢的正常产物之一，正常状态下Aβ的生成和降解处于动态平衡，但当处于病理状态下时，造成Aβ的生成增多和降解减少，从而产生大量的Aβ沉积，Aβ由单体自动聚集成可溶性的寡聚体。37℃孵育24h为模拟体内Aβ聚集的条件。

在一些优选的实施方案中，Aβ42的标准溶液的制备方法包括：

用1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇将蛋白肽溶解并干燥，然后用NaOH溶液将干燥后的固体复溶，并用PBS缓冲液稀释成浓度分别为0μM、0.75μM、1μM、1.5μM、2.5μM、3μM和5μM的Aβ42标准溶液；

其中，蛋白肽的浓度例如可以为，但不限于1mg/ml。

以特定的碱性溶液NaOH溶液进行复溶，可以使Aβ42更好的聚合，在不使用NaOH溶液的情况下，聚合效果不理想。

优选地，蛋白肽溶解后还包括超声25～35min，然后再进行干燥处理。

超声能够使蛋白肽的溶解更加充分，超声的时间例如可以为，但不限于25min、28min、30min、32min或35min，优选超声30min，并使用氮吹法干燥，以避免氧化等其他不必要的反应；

优选地，复溶后还包括超声25～35s，然后再进行稀释处理。

同样地，使用超声能够进一步使固体在二甲基亚砜中充分溶解，超声的时间例如可以为，但不限于25s、28s、30s、32s或35s，优选超声30s。

优选地，还包括在37℃条件下孵育24h的步骤。

在一些优选的实施方案中，绘制Aβ40标准曲线的方法包括：

分别向不同浓度的Aβ40标准溶液中加入阿尔茨海默症标志物适体，反应后加入纳米金，再次反应后加入NaCl溶液，然后用紫外分光光度计分别于520nm和725nm波长处测定吸光度值，以Aβ40标准溶液的浓度为横坐标，725nm处与520nm处吸光度的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

其中，阿尔茨海默症标志物适体能够与Aβ40发生特异性反应，吸附在纳米金表面，从而阻止纳米金在高盐条件下发生聚集，通过吸光度的检测可以准确反映样品中Aβ40的含量。基于此，优选使用浓度为2μM的Apt作为阿尔茨海默症标志物适体与Aβ40发生特异性反应。

为了反应充分进行，反应所需的时间优选为3～7min，例如可以为，但不限于3min、4min、5min、6min或7min。当反应时间为5min时，在反应充分的基础上，可以节约时间成本。

作为优选，纳米金、阿尔茨海默症标志物适体、Aβ40标准溶液和NaCl溶液的体积比为60:18:9:40。

基于上述方法绘制得到的标准曲线的方程为y＝-0.004x+1.5829，线性系数R＝0.9888。

在一些优选的实施方案中，绘制Aβ42标准曲线的方法包括：

分别向不同浓度的Aβ42标准溶液中加入阿尔茨海默症标志物特异性结合肽，反应后加入纳米金，再次反应后用紫外分光光度计分别于520nm和615nm波长处测定吸光度值，以Aβ42标准溶液的浓度为横坐标，615nm处与520nm处吸光度的比值为纵坐标，绘制标准曲线；

其中，阿尔茨海默症标志物特异性结合肽PrP能够与Aβ42发生特异性反应，当加入纳米金后，Aβ42与纳米金竞争性结合PrP，从而阻止纳米金的聚集，通过吸光度的检测可以准确反映样品中Aβ42的含量。基于此，优选使用浓度为250ng/mL的PrP作为阿尔茨海默症标志物特异性结合肽与Aβ42发生特异性反应。

其反应时间可选的为3～7min，例如可以为，但不限于3min、4min、5min、6min或7min。当反应时间为5min时，在反应充分的基础上，可以节约时间成本。

作为优选，纳米金、Aβ42标准溶液和阿尔茨海默症标志物特异性结合肽溶液的体积比为2:1:2。

基于上述方法绘制得到的标准曲线的方程为y＝-0.1023x+0.6693，线性系数R＝0.9880。

在一些优选的实施方案中，所述待测样品的处理方法包括：

每0.25g肠道排泄物加入10mL PBS缓冲液中溶解，固液分离后将上清液过滤，得到处理后的待测样品。

具体地，所用PBS缓冲液的浓度为10mM，pH为7.2或7.4。

为了进一步减少检测样品的杂质，避免对检测结果造成干扰，优选使用0.22μm水系滤膜对上清液进行过滤。

当应用本发明提供的检测方法对待测样本中的Aβ40和/或Aβ42进行检测时，按照制作标准曲线的方法带入待测样品即可。

本发明通过1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(HFIP)将β40和β42进行超声、氮吹、复溶、培养得到阿尔兹海默症标志物Aβ低聚物。将Aβ低聚物分别与修饰在纳米金表面的阿尔兹海默症标志物适体结合后再分别与NaCl溶液反应，建立Aβ低聚物浓度值对应纳米金聚集态及分散态的紫外吸收峰值比率的标准曲线，紫外吸收法绘制标准曲线，对肠道排泄物中β淀粉样蛋白低聚物进行定性半定量分析。本发明的方法适合于成人肠道排泄物中Aβ40、Aβ42的检测，方法定性准确度高、过程简单易操作，具有实际检测意义。

根据本发明的另一方面，还提供了一种检测β淀粉样蛋白低聚物的试剂盒，包括本发明中的β淀粉样蛋白低聚物的标准溶液。

下面结合具体的实施例对本发明的内容进行说明。

实施例1成人肠道排泄物中Aβ40含量的精密度和回收率测定

(1)标准溶液的配制：用1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇将1mg的蛋白肽溶解得到1mg/mL的溶液，超声30min后氮吹至近干。用二甲基亚砜将氮吹后的固体样品溶解，超声30s后用10mM，pH为7.4的PBS缓冲液溶解稀释，配制成35nM、50nM、100nM、150nM、250nM、300nM、400nM的Aβ40标准溶液，放至37℃培养箱中培养24h。

分别向不同浓度的Aβ40标准溶液中加入2μM的阿尔茨海默症标志物适体(Apt)，于避光条件下反应5min，加入纳米金，避光条件下反应5min，加入350mM的NaCl溶液，加入的纳米金、阿尔茨海默症标志物适体、Aβ40和NaCl溶液的体积比60:18:9:40。用紫外分光光度计分别于520nm和725nm波长处测定吸光度值。以Aβ40的浓度为横坐标，725nm处与520nm处吸光度的比值为纵坐标，绘制标准曲线(图1)，经测定，标准曲线的方程为y＝-0.005x+0.9886，线性系数R＝0.9907。

(2)样品的处理：准确称量0.25g的肠道排泄物样品，加入10mL、浓度为10mM，pH为7.4的PBS缓冲溶液溶解，于10000rpm条件下离心10min，取上清液经0.22μm水系滤膜过滤，样品液待测。

(3)样品的测定：向样品液中加入2μM适配体(Apt)，避光条件下反应5min，然后加入AuNPs，避光反应5min，加入370mM的NaCl溶液，避光反应5min，用分光光度计分别于520nm和725nm以试剂空白溶液作参比，测定其吸光度值，从标准曲线上查出Aβ40的含量，计算样品中的含量。

以同样的处理方式得到三个平行样品，进行分析并计算含量，具体结果如下：

实施例2成人肠道排泄物中Aβ42含量的精密度和回收率测定

(1)标准溶液的配制：用1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇将1mg的蛋白肽溶解得到1mg/mL的溶液，超声30min氮吹至近干。然后将固体溶解至2mM的NaOH溶液中，超声30s后用10mM，pH为7.2的PBS缓冲溶液溶解稀释，配制成0μM、0.75μM、1μM、1.5μM、2.5μM、3μM和5μM的Aβ42标准溶液，放至37℃培养箱中培养24h。

分别向不同浓度的Aβ42标准溶液中加入250ng/mL的多肽(PrP)，充分反应5min，加入纳米金，于避光条件下反应5min，加入的纳米金、Aβ42和多肽溶液的体积比2:1:2。用紫外分光光度计分别于520nm和615m波长处测定吸光度值。以Aβ42的浓度为横坐标，615nm处与520nm处吸光度的比值为纵坐标，绘制标准曲线(图2)，经测定，标准曲线的方程为y＝-0.1004x+0.7818，线性系数R＝0.9893。

(2)样品的处理：准确称量0.25g的肠道排泄物样品，分别加入10mL、浓度为10mM，pH为7.2的PBS缓冲溶液溶解，于10000rpm条件下离心10min，取上清液经0.22μm水系滤膜过滤，样品液待测。

(3)样品的测定：向样品液中加入5μM的多肽(PrP)，避光条件下反应5min，然后加入AuNPs，避光反应5min，用分光光度计分别于520nm和615nm以试剂空白溶液作参比，测定其吸光度值，从标准曲线上查出Aβ42的含量，计算样品中的含量。

以同样的处理方式得到三个平行样品，进行分析并计算含量，具体结果如下：

结果显示，本领域的普通技术人员可以用分光光度法对人体肠道排泄物样品中Aβ40和Aβ42的含量进行测定。本方法测定Aβ40的回收率在104％-112％之间，RSD在0.75％-3.9％之间，测定Aβ42的回收率在83.0％-95.9％之间，RSD在1.6％-5.0％之间，说明本方法具有较高的准确性和精密度。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。