普罗威登斯属细菌菌株在制备二价铁氧化剂中的应用
阅读说明：本技术 普罗威登斯属细菌菌株在制备二价铁氧化剂中的应用 (Application of providencia bacterial strain in preparation of ferrous oxidant ) 是由 李丁 陈金媛 胡远艺 丁哲旭 罗军 易慧娟 陈莎 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了普罗威登斯属细菌菌株在制备二价铁氧化剂中的应用,普罗威登斯属细菌菌株在制备水稻根系表面铁膜形成剂中的应用,以及普罗威登斯属细菌菌株在制备水稻根系重金属镉吸收阻隔剂中的应用。本发明通过传统硫化亚铁梯度管法,利用改良矿质培养基,简称MWMM,培养菌株LLDRA6后,出现明显的铁氧化层,再通过邻菲罗啉分光光度法,发现菌株LLDRA6具有Fe(II)氧化能力。同时发现菌株LLDRA6在水稻根系表面形成的铁膜对水稻的镉吸收具有显著的阻隔效果。(The invention discloses an application of providencia bacterial strains in preparing ferrous oxidants, an application of providencia bacterial strains in preparing rice root system surface iron film forming agents and an application of providencia bacterial strains in preparing rice root system heavy metal cadmium absorption blocking agents. According to the invention, by a traditional ferrous sulfide gradient tube method and by using an improved mineral medium, called MWMM for short, after the strain LLDRA6 is cultured, an obvious iron oxide layer appears, and then the strain LLDRA6 is found to have Fe (II) oxidation capability by a phenanthroline spectrophotometry. Meanwhile, the iron film formed by the strain LLDRA6 on the surface of the rice root system has obvious barrier effect on the cadmium absorption of the rice.)
技术领域
本发明属于微生物环境修复领域，具体而言，涉及普罗威登斯属细菌菌株在制备二价铁氧化剂中的应用，以及该菌株在制备水稻根系表面铁膜形成剂的应用，从而达到阻隔水稻根系吸收重金属镉的效果。
背景技术
镉是水稻重金属污染的主要元素之一，与其它重金属相比，镉具有较强的活性，更容易被植物吸收。土壤中的镉大致可分为水溶性镉和非水溶性镉两种形态，水溶性镉迁移性强，易被植物所吸收。镉进入植物体内后会阻碍植物营养和水分的吸收、抑制酶活性、扰乱植物代谢等，进而影响植物光合作用、蒸腾作用的速率，对植物产生毒害作用。对水稻而言，稻田中镉浓度超标会直接导致水稻产量的下降并影响大米的质量。除此之外，由农作物通过食物链流向人体的镉也有严重的危害性，它能与人体内的一些必需氨基酸或蛋白质结合形成镉硫蛋白，经过血液循环抵达身体的各个部位，在一定程度上会损伤人体的组织器官。最重要的是重金属镉不可降解，在生物体中积累后难以清除，积累到一定量后就会造成各种疾病，威胁人们的生命安全。
传统的镉污染的治理方法包括物理修复和化学修复。然而，这些技术通常存在操作繁琐、能耗较大、成本较高和容易造成二次污染等问题。而生物修复则可有效避免这些问题，生物修复是指利用生物为主体的修复重金属污染的方法，包括植物修复、动物修复和微生物修复，因其易操作、效果好、费用低，在土壤镉污染治理方面日益受到广泛重视。
近年来利用微生物来修复环境中重金属引起了人们的广泛关注。微生物修复是指微生物对土壤中的重金属进行吸收、沉淀、氧化和还原。一方面，微生物的细胞壁提供了许多可以结合重金属离子的官能团(羧酸、羟基、氨基和磷酸基团等)，并且微生物可以利用吸附、富集、溶解和沉淀等过程直接修复环境中重金属；另一方面，它们还可以通过与其他微生物、植物的互作，减少植物对环境中重金属的吸收与积累。利用微生物修复解决土壤重金属污染问题，不仅修复效率高、成本低，而且对环境无污染。因此，筛选对土壤重金属具有较强抗性，且能有效阻隔植物吸收重金属的菌株，具有重要意义。
发明内容
本发明旨在发现普罗威登斯属细菌菌株Providencia sp.LLDRA6具有二价铁Fe(II)氧化能力的基础上开发Fe(II)氧化剂，进而开发水稻根系表面铁膜形成剂和水稻根系重金属镉吸收阻隔剂，并提供一种阻隔重金属镉(Cd)被水稻根系吸收的方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述具有铁氧化能力的普罗威登斯属细菌菌株于2018年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC M 2018876，命名为Providenciasp.LLDRA6。所述阻隔重金属镉被水稻根系吸收的方法是向镉污染的水稻田中同时添加二价铁和普罗威登斯属细菌菌株Providencia sp.LLDRA6的菌悬液；所述菌悬液的OD600为1.5—2.5，优选为2，所述二价铁的添加量为200—300mmol/m2，优选为250mmol/m2，菌悬液的添加量为400—600mL/m2，优选为500mmol/m2。
本发明用硫化亚铁梯度管法，即用改良的MWMM培养基培养菌株LLDRA6。试管中加入两层培养基，底层为硫化亚铁、上层为半固态改良矿质培养基(简称MWMM)。在此培养基中，底层的亚铁离子向上扩散形成铁浓度梯度，而由于少量空气的存在，氧气向下扩散又会形成氧浓度梯度。在某一特定高度，氧气和亚铁离子浓度达到合适范围，此时铁氧化菌会开始生长并在某一高度形成圆形铁氧化条带。实验分为处理组和对照组，处理组：接种菌株LLDRA6；对照组：不做处理的空白培养基。实验发现，接种菌株LLDRA6的处理组试管形成了一圈红棕色铁氧化条带，初步发现了菌株LLDRA6是一株铁氧化菌。再用邻菲罗啉分光光度法进行进一步试验；邻菲罗啉是Fe(II)显色剂，和Fe(II)发生显色反应后的生成物在512nm处有吸收峰，吸光度大小可反应Fe(II)浓度。实验分为处理组和对照组，处理组：先将菌株接种于LB培养基(50mL)，35℃、180rpm恒温摇床培养4h后，添加Fe(II)，使体系内终浓度为8mmol/L。对照组：空白LB培养基(50mL)，35℃、180rpm恒温摇床培养4h后，添加Fe(II)，使体系内终浓度为8mmol/L。在不同时间点取样，和邻菲罗啉指示剂反应后，用紫外分光光度计测其在512nm处的吸光度，对照标准曲线可得Fe(II)终浓度，计算处理组和对照组的Fe(II)氧化率，即可证明菌株是否具有Fe(II)氧化能力。实验发现，处理组Fe(II)氧化率高于对照组，说明Providencia sp.LLDRA6具备氧化Fe(II)的能力。
发现上述菌株能够促进水稻根系形成铁膜，进而达到高效阻隔水稻根系吸收重金属镉效果的方法是基于华占和台北309两个水稻品种的土壤盆栽和大田实验。盆栽和大田各设计4个处理组，每组处理5次重复，将发芽的水稻幼苗移栽至不同处理后的盆栽和大田中，生长90-120d后，收集盆栽处理组的水稻根系进行观察，并利用SEM-EDS对根部样品进行表征；收集大田处理组地上部分的水稻样品，检测籽粒和茎叶的镉含量。盆栽实验发现，同时添加菌悬液和Fe(II)的处理组的水稻根系较其他处理组有更明显的颜色变化，呈铁锈红；再对各处理组水稻根系进行SEM-EDS分析，发现同时添加菌悬液和Fe(II)的处理组的水稻根系表面形成的层状沉淀物最为明显，且沉淀物区域的Fe和O含量较高，可认定沉淀物为铁氧化膜。大田实验发现，在同时添加菌悬液和Fe(II)的处理组中，两个水稻品种的籽粒和茎叶部分的镉含量均显著低于其它处理组。以上结果表明，本发明的菌株LLDRA6具备在水稻根系表面形成铁膜的能力，从而具有高效阻隔水稻根系吸收重金属镉的效果。
本发明利用普罗威登斯属细菌菌株Providencia sp.LLDRA6阻隔重金属镉(Cd)被水稻根系吸收的方法，操作简便，成本低，克服了现有物化修复技术操作繁琐、成本高、效率低等的不足，而且对环境无二次污染风险，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是硫化亚铁梯度管法中不接种菌株LLDRA6的对照组和接种菌株LLDRA6的处理组的试管对比图(A：对照组；B：处理组)；
图2是仅添加Fe(II)与同时添加菌株LLDRA6和Fe(II)的不同时间点的铁氧化率情况；
图3是盆栽实验华占品种根系实拍图(A：对照组；B：仅添加菌悬液；C：仅添加Fe(II)；D：同时添加Fe(II)和菌悬液)；
图4是盆栽实验华占品种根系SEM-EDS表征图(A：对照组；B：仅添加菌悬液；C：仅添加Fe(II)；D：同时添加Fe(II)和菌悬液)；
图5是大田实验水稻籽粒镉含量(处理组一：对照组；处理组二：仅添加菌悬液；处理组三：仅添加Fe(II)；处理组四：同时添加Fe(II)和菌悬液)；
图6是大田实验水稻茎叶镉含量(处理组一：对照组；处理组二：仅添加菌悬液；处理组三：仅添加Fe(II)；处理组四：同时添加Fe(II)和菌悬液)。
具体实施方式
本发明提供的普罗威登斯属细菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC M 2018876。
一、Providencia sp.LLDRA6铁氧化能力
1、硫化亚铁梯度管法
1)主要试剂：
①氯化铵；②七水合硫酸镁；③二水氯化钙；④磷酸氢二钾；⑤FeS；⑥微量元素溶液和维生素溶液。
2)双向梯度试管培养基的配置
①改良矿质培养基(MWMM液体培养基)：依次称量1g氯化铵(NH4Cl)、0.2g七水合硫酸镁(MgSO4.7H2O)、0.1g二水氯化钙(NH4Cl.2H2O)、0.5g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于100mL超纯水，再定容至1L。
②双向梯度试管底层培养基：由FeS和MWMM液体培养基按1:1的比例组成，并加入1％(w/v)琼脂糖。
③双向梯度试管上层培养基：在MWMM液体培养基中加入0.15％(w/v)琼脂糖。
④双向梯度试管培养基：底层培养基灭菌后趁热在每个试管底部趁热加入1mLFeS，作为亚铁离子的来源，静置待其冷却凝固。上层培养基灭菌后冷却至40℃左右，加入1％维生素溶液和1％微量元素溶液，摇匀后加入终浓度为0.3％的NaHCO3，混匀。NaHCO3的加入为铁氧化菌的生长提供碳源，并充当缓冲剂。将无菌移液管顶端塞入灭菌的脱脂棉球，连接至二氧化碳气瓶(CO2含量30％)，向上层培养基中注入CO2，调节培养基的pH至6.0，CO2和NaHCO3组成缓冲体系。待试管中的底层培养基完全凝固后，在每个试管中加入9mL的上层培养基，用一次性无菌移液管沿试管壁缓慢加入，随后将试管移入冰箱中冷藏，等待上层培养基凝固。
3)实验处理
实验设置对照组和处理组。对照组：双向梯度试管培养基不作处理；处理组：双向梯度试管培养基接种菌株LLDRA6。每处理3组平行，接种后置于35℃恒温培养箱培养。
2、邻菲罗啉分光光度法
1)主要试剂：
①氟化铵溶液(2mol/L)；称取14.816g氟化铵(NH4F)溶于超纯水中，再定容至200mL；②盐酸溶液(6mol/L)：取100mL浓盐酸(12mol/L)与超纯水按1:1比例混合；③乙酸铵缓冲溶液：称取250g乙酸铵(NH4C2H3O2)溶于150mL超纯水中，再用冰乙酸定容至1L，调节pH至4.2；④0.20％邻菲罗啉溶液：称取0.20g邻菲罗啉溶于100mL超纯水中，加2滴稀盐酸使其完全溶解(现配现用)；⑤Fe(II)贮存液：称取0.9941g FeCl2·4H2O(AR)，溶于超纯水中，最终定容至50mL，此时Fe(II)浓度为0.1mol/L。
2)Fe(II)标准曲线的绘制
在25mL容量瓶中加入2mL的6mol/L盐酸，分别加入0，0.25mL，0.5mL，1.25mL，2mL，2.5mL的Fe(II)贮存液，然后再依次加入2mL的NH4F，2mL邻菲罗啉，5mL乙酸铵，最后加超纯水定容至25mL，配置成浓度梯度为0、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L的标准溶液。反应15min后在512nm波长处测定吸光值。
3)样品处理
设置对照组：50mL LB培养基180rpm、35℃先培养4h，再添加Fe(II)(Fe(II)终浓度为8mmol/L)，和处理组：菌株接种至50mL LB培养基中，180rpm、35℃先培养4h，再添加Fe(II)(Fe(II)终浓度为8mmol/L)。将对照组和处理组置于180rpm、35℃的摇床，在不同时间点吸取2mL样品，于10000rpm、10min离心后取上清液备用。25mL容量瓶中依次加入2mL的盐酸溶液、1mL的上清液、2mL的氟化铵溶液、2mL的0.2％邻菲罗啉溶液、5mL的乙酸铵溶液，最后加超纯水定容至25mL。上下颠倒混匀后，反应15min，于分光光度计512nm波长处测定吸光值A，根据以下公式计算不同时间点的Fe(II)氧化率。
C＝3.003A+0.09566
R％＝(C0-Ct)/C0×100％
其中C0为Fe(II)初始浓度，Ct为培养不同时间后Fe(II)浓度。
二、水稻根系形成铁膜，阻隔水稻植株吸收重金属镉的效果
1)水稻种子前期处理
选取台北309和华占两个水稻品种，用3％次氯酸钠溶液对种子表面消毒，15min后用超纯水冲洗，置于28℃、相对湿度70％的温室培养至发芽。选取长势良好的三周龄幼苗进行移栽。
2)菌悬液的制备
在LB固体平板上挑取菌株LLDRA6单菌落接种至LB液体培养基中(11L)，180rpm、35℃培养12-16h。
3)盆栽实验
①采集镉污染水稻土壤(镉含量为0.92mg/Kg)，风干，200目过筛后，每盆装填5kg干燥土壤(种植前，每盆施肥150mg铵态氮、100mg磷(作为单一超级磷酸盐)和120mg钾(作为钾肥)，放置两周。
②设置四个处理
处理组一：对照组(不添加)；
处理组二：仅添加菌悬液(OD600＝2.0，添加量为50mL/盆)；
处理组三：仅添加Fe(II)(Fe(II)的添加量为5mmol/kg)；
处理组四：同时添加Fe(II)和菌悬液(Fe(II)的添加量为5mmol/kg；菌悬液OD600＝2.0，添加量为50mL/盆)。
土壤处理完毕后，水稻幼苗(3周)移栽至盆栽中培养。
③后期处理
水稻成熟后，收集不同处理组水稻根系，进行实物拍照和SEM-EDS表征分析。
4)大田实验
①选取镉污染的水稻田(镉含量为0.92mg/Kg)，利用渠沟分离出多个面积在1m2的模块，每5个模块做不同处理。
②设置四个处理
处理组一：对照组(不添加)；
处理组二：仅添加菌悬液(OD600＝2.0，添加量为500mL/m2)；
处理组三：仅添加Fe(II)(Fe(II)的添加量为250mmol/m2)；
处理组四：同时添加Fe(II)和菌悬液(Fe(II)中的添加量为250mmol/m2；菌悬液OD600＝2.0，添加量为500mL/m2)。
③后期处理
水稻成熟后，收集茎叶及籽粒部位的样品，65℃下干燥72h后，研磨成粉末，检测样品中的镉含量。
结果与分析
Providencia sp.LLDRA6铁氧化能力的结果如图1和图2所示，硫化亚铁梯度管法中，处理组(接种菌株LLDRA6)试管中形成一圈明显的圆形铁氧化条带，对照组(不接种菌株LLDRA6)无明显变化；邻菲罗啉分光光度法中，处理组(同时添加菌悬液和Fe(II))Fe(II)氧化率高于对照组(仅添加Fe(II))，结果表明，Providencia sp.LLDRA6具备氧化Fe(II)的能力。
盆栽实验中，华占品种水稻根系实拍图如图3所示(A：处理组一；B：处理组二；C：处理组三；D：处理组四)，处理组四(同时添加菌悬液和Fe(II))的水稻根系较其它三个处理组有明显的颜色变化，呈铁锈红；SEM-EDS表征结果如图4所示(A：处理组一；B：处理组二；C：处理组三；D：处理组四)，处理组四(同时添加菌悬液和Fe(II))的水稻根系表面形成的层状沉淀物最为明显，且沉淀物区域的Fe和O含量较高，可认定沉淀为铁氧化膜。
大田实验中，检测各个处理组的水稻籽粒和茎叶样品中的镉含量，结果如图5和图6所示，处理组四(同时添加菌悬液和Fe(II))的两个水稻品种的籽粒和茎叶部分的镉含量显著低于其它三个处理组，在处理组四中，华占和台北309籽粒镉含量分别为0.115mg/kg和0.042mg/kg，符合国家标准GB2762-2012规定的谷物镉残留应小于0.2mg/kg的要求。