具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例

1材料

1.1实验动物

SPF级雄性昆明小鼠，体重20±2g，由广西医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证SCXK(桂)2014-0002，使用许可证号SYXK(桂)2014-0003。

1.2药物与试剂

蛞蝓产自广西壮族自治区百色市灵山县。蛞蝓提取物的制备：将-20℃冻存的鲜蛞蝓于25±2℃室温下解冻1.5h。按1:2的比例将解冻后鲜蛞蝓和蒸馏水混合匀浆打碎。匀浆后，高速冷冻离心机低温离心，2000r/min，10min，收集上清液，残渣加蒸馏水反复如上操作，合并上清液，分别用鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司)和Triton X-114(索莱宝生物科技有限公司)相分离法检测和去除内毒素，置-20℃冰箱冷冻过夜。将冷冻过夜的蛞蝓匀浆置冷冻干燥机上干燥3天，-45℃，20pa。得到蛞蝓冻干粉，将其研磨，过20筛，得到蛞蝓提取物(以下简称SE)并室温密封保存。注射用环磷酰胺(以下简称CTX)(规格：0.2g，江苏盛迪医药有限公司，批号：17011325)；总蛋白定量、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所)；ELISA测定(VEGF、TNF-α)试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)

1.3小鼠移植瘤瘤株

小鼠肝癌H22瘤株由广西医科大学药理教研室提供。

2方法

2.1对腹水瘤小鼠的抗肿瘤作用

2.1.1腹水瘤模型建立、动物分组、给药

小鼠随机分为6个组，每组10只，无菌吸取第三代接种了肝癌H22小鼠d7腹水，用生理盐水稀释成2×10⁷个/ml浓度的癌细胞悬液，腹腔接种0.2ml于模型组、CTX组(0.02g/kg)、CTX+SEL组(0.02g/kg+0.6g/kg)、CTX+SEM组(0.02g/kg+1.2g/kg)、CTX+SEH组(0.02g/kg+2.4g/kg)。24小时后灌胃SE，腹腔注射CTX，每日1次，连续7天。

2.1.2观察指标

7天后观察动物直到死亡，检测小鼠平均生存时间以及7天内体重影响。

2.2对实体瘤小鼠的抗肿瘤作用

2.2.1实体瘤模型建立、动物分组及给药

小鼠随机分为9个组，每组10只，无菌抽取第四代接种了肝癌H22小鼠d7腹水，用生理盐水稀释成2×10⁷个/ml浓度的癌细胞悬液，左腋下接种0.2ml于模型组、CTX组、SEL组、SEM组、SEH组、CTX+SEL组、CTX+SEM组和CTX+SEH组。24小时后灌胃SE，腹腔注射CTX，每日1次，连续给药10天。

2.2.2对实体瘤H22小鼠的抑制作用

末次给药后第二天，称体重并处死小鼠，剥脱瘤评估块，并根据下式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(C-T)/C×100％。模型组的平均瘤重为公式中的C，T为各个给药组的平均瘤重。算出q值来衡量联合用药的效果：q＝EAB/[EA+(1-EA)EB]。公式里EA是A药的抑瘤率，EB是B药的抑瘤率，EAB是A、B药联合使用时的抑瘤率，q＝0.85～1.25为A、B药效果相加，q>1.25为A、B药效果增强(或协同)，q<0.85为两药拮抗。剖取胸腺和脾脏，称其重量，按下式计算胸腺指数(TI)、脾脏指数(SI)：TI(SI)＝胸腺(脾脏)重量(mg)/体重(10g)。

2.2.3对肝、肾功能和骨髓抑制的影响

小鼠眼球取血，用血细胞计数仪测其白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)；血清分离后，全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清肌酐(CR)和血尿素氮(BUN)并生成结果报告。

2.2.4对MDA、SOD和GSH的影响

将肿瘤组织置于冰盘上，用4℃生理盐水清洗洁净，用滤纸吸干组织后再称重，加4℃NS，在冰浴上制成10％(W/V)的组织匀浆，将匀浆在4℃条件下3500～4000rpm离心10min。考马斯亮兰法测组织匀浆上清液的蛋白含量。比色法测肿瘤组织匀浆MDA含量、SOD和GSH活性。

2.2.5采用ELISA法检测VEGF及TNF-α

所有步骤都将根据试剂盒的产品说明书开展。

2.2.6统计学处理

应用SPSS 22.0软件进行处理，计量资料均采用表示，多组数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间计量资料比较采用t检验。以P<0.05或为P<0.01差异有显著性意义。

3结果

3.1对腹水瘤H22小鼠生存时间及7天内体重的影响

与模型组相比，其它组的7天内体重无明显变化。与模型组相比，给药组的平均生存时间明显提高(P<0.01)。与CTX组相比，CTX+SE各剂量组的平均生存时间明显提高(P<0.05)。具体详见表1。

表1 SE对腹水瘤H22小鼠生存时间及体重的影响(n＝10)

与模型组比较：^*P<0.05,^**P<0.01；与CTX组比较：^#P<0.05,^##P<0.01

3.2对实体瘤H22小鼠的抑制作用

由表2可知，与CTX组比较，其他组的体重变化无明显差异；其他给给药组的SI和TI明显增加，差异具有统计学意义。相比模型组，我们发现给药组的肿瘤生长均出现不同程度的抑制，差异具有统计学意义。各组间抑瘤率范围为29.58％～72.08％，CTX+SE低、中和高剂量组的q值分别为1.00、0.97和0.86，提示两药联用时抑瘤作用相加。

表2 CTX联合SE治疗对实体瘤H22小鼠的抑制作用(n＝10)

与模型组比较：^*P<0.05,^**P<0.01；与CTX组比较：^#P<0.05,^##P<0.01

3.3对肝、肾功能和骨髓抑制的检测结果

由表3可知，与模型组相比，CTX组的WBC、AST和BUN计数显著下降(P<0.01、P<0.01和P<0.05)，CTX+SE各剂量组的各项检测指标无明显变化。与CXT组相比，CTX+SEM组的ALT和AST显著升高(P<0.05和P<0.01)，CTX+SEH组的AST显著升高(P<0.01)。

表3 CTX联合SE治疗对实体瘤H22小鼠肝、肾功能和骨髓抑制的影响(n＝10)

与模型组比较：^*P<0.05,^**P<0.01；与CTX组比较：^#P<0.05,^##P<0.01

3.4对肝脏组织MDA含量、SOD和GSH活性的检测结果

由表4可知，与模型组比较，联合用药组MDA含量明显下降(P＜0.05或P＜0.01)，而CTX组无明显变化；CTX组和联合用药组的SOD和GSH活性明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。与CTX组比较，CTX+SEM组的GSH活性升高(P＜0.05)，CTX+SEH组的MDA含量下降、SOD活性升高(P＜0.05)。

表4 CTX联合SE治疗对实体瘤H22小鼠MDA、SOD和GSH的影响(n＝10)

与模型组比较：^*P<0.05,^**P<0.01；与CTX组比较：^#P<0.05,^##P<0.01

3.5 ELISA法检测VEGF及TNF-α表达的结果

由表5可知，与模型组比较，CTX组与联合用药组的VEGF、TGF-α表达明显下降，差异具有统计学意义。与CTX组比较，CTX+SEM组和CTX+SEH组的VEGF和TNF-α表达明显下降，差异具有统计学意义。

表5 CTX联合SE治疗对实体瘤H22小鼠VEGF和TNF-α的影响(n＝10)

与模型组比较：^*P<0.05,^**P<0.01；与CTX组比较：^#P<0.05,^##P<0.01

4讨论

(1)在腹水瘤小鼠研究中，CTX作为经典的抗肿瘤药物，可明显延长腹水瘤小鼠生存时间，而本研究发现CTX+SE各剂量组的生存时间比CTX组更长，说明联合用药可以提高机体生存能力。同时在实体瘤小鼠研究中，各给药组均对肿瘤的生长有显著抑制作用，提示无论单药或者联和用药，它们的抗肿瘤活性均稳定有效。当CTX联合SE进行治疗时，它们的抗肿瘤作用相加，这也与腹水瘤小鼠研究结果相符。

(2)胸腺和脾脏作为机体重要的中枢免疫器官，与机体免疫表达密切相关。如果胸腺和脾脏功能受到不良影响，可能使免疫调节失衡，产生一系列免疫性疾病，机体免疫功能的变化可用SI和TI进行反映。SE自身不会对机体免疫造成影响，同时联合用药时可在一定程度中和CTX产生的免疫下降作用。

(3)此外，大多数的抗肿瘤药物在起到治疗作用的同时，又常伴有肝、肾功能和骨髓抑制的毒副作用，而CTX+SE各剂量组对此影响不大。

(4)氧化应激是关于生物系统中活性氧的产生和影响，大量研究都涉及它们引起的损伤以及它们参与细胞调节和信号传导途径。CTX+SE各剂量组表现出比CTX单药治疗更显著的抗氧化应激作用。炎症与癌症之间的功能关系已被广泛研究。炎症微环境被认为在肝癌发展的不同阶段发挥重要作用。肝癌被认为是血管依赖性恶性肿瘤，血管生成与肿瘤生长和转移有关。作为促血管生成因子，VEGF是肿瘤进展中血管生成的主要调节因子，VEGF的表达由生长因子，致癌基因和缺氧引发。此外，TNF-α被称为炎性细胞因子，也是众所周知的可促进血管生成和血管重塑的促血管生成因子。CTX+SE各剂量组同样表现出比CTX单药治疗更显著的抗炎作用。

综上，CTX联合SE比CTX单药治疗在抑制肿瘤生长、延长机体生存时间和毒性效应小等方面表现更好。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。