一种氧化还原敏感型靶向载药聚合物的制备方法
阅读说明：本技术 一种氧化还原敏感型靶向载药聚合物的制备方法 (Preparation method of redox-sensitive targeted drug-loaded polymer ) 是由 侯雪艳 史永利 郭超 阎玺庆 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氧化还原敏感型靶向载药聚合物的制备方法,将聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯与甲基丙烯酸羟丙酯在(NH-(4))-(2)S-(2)O-(8)-NaHSO-(3)复合体系中引发下于35-40℃反应制得产物poly(mPEG-co-HM),再与3,3’-二硫代二丙酸酐在室温条件下经过酯化反应得到poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH,与盐酸阿霉素在室温条件下经过酰胺化反应制得最终产物氧化还原敏感型靶向载药聚合物poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX。本发明制得的氧化还原敏感型靶向载药聚合物粒径在160.5±4.7nm,且稳定性良好。空白poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液的稳定性实验表明：在4℃、25℃、37℃和在37℃条件下加入FBS的NPs溶液均表现出良好的稳定性。(The invention discloses a preparation method of a redox-sensitive targeted drug-loaded polymer, which comprises the step of adding (NH) poly (ethylene glycol) methacrylate and hydroxypropyl methacrylate 4 ) 2 S 2 O 8 ‑NaHSO 3 The compound system is initiated to react at 35-40 ℃ to prepare a product poly (mPEG-co-HM), then the product poly (mPEG-co-HM) -S-S-COOH is obtained by esterification reaction with 3, 3' -dithiodipropionic anhydride at room temperature, and the product poly (mPEG-co-HM) -S-S-DOX is obtained by amidation reaction with doxorubicin hydrochloride at room temperature. The redox-sensitive targeted drug-loaded polymer prepared by the invention has the particle size of 160.5 +/-4.7 nm and good stability. Stability experiments for a blank poly (mPEG-co-HM) -S-S-DOX NPs solution showed that: the NPs solutions with FBS added at 4 deg.C, 25 deg.C, 37 deg.C and at 37 deg.C all showed good stability.)
技术领域
本发明属于氧化还原敏感型靶向纳米给药系统技术领域，具体涉及一种氧化还原敏感型靶向载药聚合物的制备方法。
背景技术
聚合物药物共轭概念是由Helmut Ringsdorf在1975年提出的。Ringsdorf模型由三个部分组成：(1)增溶剂或亲水性片段，以确保水溶性；(2)药物通常通过连接体键合到聚合主链上；(3)提供转运到特定生物靶点的靶向部分。聚合物前药偶联物是近年来在癌症诊断和治疗的纳米医学领域中不断发展的产物，使用聚合物药物偶联物的主要优点是可以调整聚合物的化学和物理性质，以提高药物的疗效和减少药物的毒性。刺激反应性提供了前体药物的可控释放，避免了与周期性给药相关的波动所引起的不良副作用、器官损伤和毒性。聚合物自组装形成胶束，其中抗癌药物共轭侧链形成疏水胶束核心，亲水段形成胶束壳。许多研究已经开始将抗癌药物附着在疏水聚合物主干上。
聚乙二醇(PEG)是FDA批准的最常用的亲水聚合物之一。聚乙二醇的使用场合与其摩尔质量有关。摩尔质量为20kDa到50kDa的聚乙二醇用于低摩尔质量药物的偶联，以减慢肾脏清除。摩尔质量为1kDa到5kDa的聚乙二醇常用于大剂量药物的偶联。在第二种情况下，聚乙二醇减少了与血液的非特异性相互作用。水合的聚乙二醇外壳减少聚集，药物被聚乙二醇屏蔽或绑定，从而增加稳定性并延长药物的血液循环时间。
氧化还原敏感化学键在氧化还原敏感型靶向纳米给药系统中有着非常重要的作用，类似于给药系统的开关，能够影响药物的释放。二硫键(-S-S-)、单硫键(-S-)、二硒键(-Se-Se-)、单硒键(-Se-)是常见的氧化还原敏感键。引入氧化还原敏感键的方法有两种：一种是使用含有氧化还原敏感键的材料制备纳米载体，另一种是使用含有氧化还原敏感键的前体药物。使用氧化还原敏感材料来制备纳米载体，能够得到含有氧化还原敏感键结构的纳米载体，当敏感键在合适条件下发生断裂，药物从给药系统中释放。
由两个巯基(-SH)氧化而成的二硫键(-S-S-)是多种化学和生物制剂中极有价值的官能团，具有很强的反应活性或生物活性。二硫键适合作为可裂解的连接剂，因为它可以容纳各种类型的化学物质，如细胞毒性物质和肿瘤靶向分子，并且可以被细胞内丰富的硫醇所裂解。因为二硫醚在硫醇存在或还原环境中可生物降解，所以基于二硫醚的生物功能化技术已广泛应用于化学传感器、前药物、聚合物水凝胶、纳米材料载体和其它药剂的开发。二硫键的药物递送方法在生物相容性、血流稳定性、二硫还原酶或代谢硫醇裂解等方面有很大优势，显示出了更高的治疗效果。药物分子与载体的二硫键偶联使得药物分子能够高效地传递到作用部位；因此，药物可以在靶组织中积累到更高的浓度。但是，大量药物和药物载体不含二硫官能团，需要进行修饰，需要在药物和载体之间增加二硫键。近年来，二硫键作为靶向药物偶联物的组成部分被广泛研究，它可以蓄积在需要药物活性的靶标区域，并在细胞选择性内化时释放药物。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种氧化还原敏感型靶向载药聚合物的制备方法，该方法利用DTDPA酯化poly(mPEG-co-HM)末端羟基得到含有二硫键的羧基化poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH，再与DOX/HCl通过酰胺化反应制备得到poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX前药。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种氧化还原敏感型靶向载药聚合物的制备方法，其特征在于具体过程为：首先将聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(mPEGMA360)与甲基丙烯酸羟丙酯(HM)在(NH4)2S2O8-NaHSO3复合体系中引发下于35-40℃反应制得产物poly(mPEG-co-HM)，再将poly(mPEG-co-HM)与3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)在室温条件下经过酯化反应得到poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH，最后将poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH与盐酸阿霉素(DOX/HCl)在室温条件下经过酰胺化反应制得最终产物氧化还原敏感型靶向载药聚合物poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX。
本发明所述氧化还原敏感型靶向载药聚合物的制备方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：在干燥的反应管中将mPEGMA360 0.3g、HM 0.9g溶解于6mL无水乙醇中得到溶液A，在干燥的反应管中将(NH4)2S2O8 0.045g、NaHSO3 0.045g溶解于6mL纯净水中得到溶液B，将溶液B加入到溶液A中进行混合，抽真空，充氮气重复3次，混合体系在37℃反应10h，反应结束后在纯净水水中透析48h，之后将产品冷冻干燥24h得到产物poly(mPEG-co-HM)；
步骤S2：在干燥的反应管中依次加入poly(mPEG-co-HM)0.5g、3,3’-二硫代二丙酸酐0.045g和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)0.021g，然后加入3mL无水DMF，最后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.013g，抽真空，充氮气重复3次，在室温下搅拌反应48h，反应结束后反应液在纯净水中透析48h，之后将产品冷冻干燥24h得白色目标产物poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH；
步骤S3：在干燥的反应管中依次加入poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH 0.3g、DCC0.06g和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)0.045g，再加入9mL无水DMSO溶解，氮气保护下，室温反应1h得到溶液C，在避光条件下在干燥的反应管中加入盐酸阿霉素0.075g和90μL三乙胺，再加入6mL无水DMSO溶解，室温反应1h得到溶液D，将溶液D加入到溶液C中，抽真空，充氮气重复3次，在避光条件下，室温搅拌反应48h，反应结束后，在避光条件下，反应液在DMF中透析24h，然后在蒸馏水透析48h，之后将产品冷冻干燥24h，最终得到暗红色目标产物poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX。
进一步限定，在避光条件下，先将10mg poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX溶解在2mL三氟乙醇中，再在磁力搅拌条件下滴加至10mL去离子水中，然后将混合体系在室温条件下搅拌以挥发除去有机溶剂最终得到poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX纳米粒。
本发明与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本发明通过反应得到最终产物暗红色固体poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX，并且在1H NMR、FTIR、TGA、DSC和纳米粒图中结果表明poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX成功制备。Malvern Zatasizer Nano ZS90粒度仪分析数据表明，poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX粒径在160.5±4.7nm，且稳定性良好。poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液的稳定性实验表明：在4℃、25℃、37℃和在37℃条件下加入FBS的NPs溶液均表现出良好的稳定性。
附图说明
图1是poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH、poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX聚合物1HNMR光谱图。
图2是DOX、HM、mPEGMA360、poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH、poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的红外光谱。
图3是poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH、poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX和poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH+DOX的DSC图谱。
图4是poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH和poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的样品照片，其中左侧为poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH，右侧为poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX。
图5是poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX TGA图谱。
图6是poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液的丁达尔效应，其中左侧为poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液；右侧为去离子水。
图7是poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液粒径测定。
图8是不同条件下poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液稳定性，对应条件：25℃(图8A)、4℃(图8B)、37℃(图8C)和37℃+FBS(图8D)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX聚合物的合成：
通过聚合、酯化、酰胺化反应合成poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX聚合物，具体步骤为：
步骤S1：在干燥的反应管中将mPEGMA360 0.3g(0.83mmol)、HM 0.9g(6.25mmol)溶解于6mL无水乙醇中得到溶液A，在干燥的反应管中将(NH4)2S2O8 0.045g、NaHSO3 0.045g溶解于6mL纯净水中得到溶液B，将溶液B加入到溶液A中进行混合，抽真空，充氮气重复3次，混合体系在37℃反应10h，反应结束后在纯净水水中透析48h，之后将产品冷冻干燥24h得到产物poly(mPEG-co-HM)；
步骤S2：在干燥的反应管中依次加入poly(mPEG-co-HM)0.5g(0.1mmol)、3,3’-二硫代二丙酸酐0.045g(0.23mmol)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)0.021g(0.10mmol)，然后加入3mL无水DMF，最后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.013g(0.11mmol)，抽真空，充氮气重复3次，在室温下搅拌反应48h，反应结束后反应液在纯净水中透析48h，之后将产品冷冻干燥24h得白色目标产物poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH；
步骤S3：在干燥的反应管中依次加入poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH 0.3g(0.06mmol)、DCC 0.06g和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)0.045g，再加入9mL无水DMSO溶解，氮气保护下，室温反应1h得到溶液C，在避光条件下在干燥的反应管中加入盐酸阿霉素0.075g(0.13mmol)和90μL三乙胺，再加入6mL无水DMSO溶解，室温反应1h得到溶液D，将溶液D加入到溶液C中，抽真空，充氮气重复3次，在避光条件下，室温搅拌反应48h，反应结束后，在避光条件下，反应液在DMF中透析24h，然后在蒸馏水透析48h，之后将产品冷冻干燥24h，最终得到暗红色目标产物poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX。
聚合物poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的表征：
使用Presitge红外光谱仪(日本岛津)调节扫描测定mPEG、HM、poly(mPEG-co-HM)、DTDPA、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH、DOX和poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的红外光谱图。
使用Bruker 400MHZ核磁共振光谱仪(德国)以氘代氯仿(CDCL3)为溶剂poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX和以氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)为溶剂测量poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH图谱。
使用TGA-DSCII热重分析仪(瑞士)调节反应气50mL/min，保护气20mL/min，反应温度为25℃～800℃，测量poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH和poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX图谱。
使用DSC-60Plus差示热扫描仪(日本)反应温度设置为25℃～300℃，测量poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX以及poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH和DOX物理混合图谱。
空白poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX纳米粒(NPs)的制备：
使用溶剂挥发法来制备poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs，在避光条件下，先将poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX(10mg)溶解在三氟乙醇(2mL)中，然后在磁力搅拌(380rpm/min)条件下缓慢滴加至去离子水(10mL)中，再将该溶液在室温条件下搅拌12h以挥发除去有机溶剂，最终获得poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX纳米粒(1mg/mL)，并使用激光笔验证丁达尔效应。
空白poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs粒径测定：
将制备成的poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液，使用ZS-90马尔文激光衍射粒度仪(Malvern Instruments Ltd，Malvern，UK)测定NPs的粒径和粒度分布。测定温度恒定25℃，测定前仪器平衡2min。各样品均平行测定3次。
空白poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs稳定性：
制备poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液(1mg/mL)，然后将其分别置于4℃、25℃和37℃条件下，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h和72h取溶液2mL，测量粒径及粒度分布。
为考察牛血清白蛋白对poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs稳定性的影响，按上述方法制备poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液(1mg/mL)和含有10wt％胎牛血清白蛋白(FBS)的poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液(1mg/mL)，然后将其置于37℃条件下，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h和72h取溶液2mL，测量粒径及粒度分布。
poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的合成与表征：
在本试验中，DTDPA是根据之前的研究合成的。而poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX共聚物通过聚合、酯化、酰胺化反应合成。可以在1H NMR光谱中观察到poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的所有特征峰(图1)，其中poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH、图中都有a、b峰，证明第一步产物poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH聚合物成功合成，而poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX图中有DOX特征峰，证明最终产物poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX聚合物成功制备。图2显示了mPEGMA360、HM、poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH、DOX和poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的红外光谱，在图谱中的3424cm-1观察到-OH的特征吸收峰；在HM和mPEGMA360的1627cm-1处观察到-C＝C-的特征吸收峰，但在poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH、poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX 1627cm-1处无碳碳双键，证明HM与mPEGMA360成功发生聚合反应。
差示热扫描分析(DSC)结果分析：
图3是poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH、poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX和poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH+DOX的DSC曲线。盐酸阿霉素(DOX/HCl)的晶体的熔点为205℃。该吸热峰在聚合物poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH与DOX/HCl的物理混合物的DSC虚线中同样被观察到。这说明：聚合物poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH与DOX/HCl的物理混合物不能有效地抑制DOX的药物结晶。DOX仍以晶体的形式存在于混合物中。相反地，阿霉素的熔点峰在poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX聚合物的DSC曲线中没有被发现，说明DOX以分子的形式被键合到聚合物上，从而有效地抑制了DOX的结晶。图4是poly(mPEG-co-HM)-S-S-COOH和poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX聚合物，颜色由白色变成了暗红色。证明了聚合物poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX被成功制备。
热重分析(TGA)结果分析：
图5是poly(mPEG-co-HM)、poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的TGA曲线。从图中可以看出：poly(mPEG-co-HM)从330℃开始热解，最终有大约26％质量损失。这是由分子内的酯键经过热解造成的。相比之下，poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX从330℃开始热解，最终有超过65％的质量损失。造成这一现象的原因是：分子内的酯键和酰胺键的热解共同造成的。所以poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX的质量损失要明显高于poly(mPEG-co-HM)。这些数据也从侧面证实了DOX被成功键合到poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX聚合物上。
poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs的合成及丁达尔效应：
本次使用溶剂挥发法制备poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液。将去离子水和poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液分别置于四面光滑比色皿中，使用激光笔照射，结果显示：去离子水作为对照组，没有丁达尔效应；而poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液有一条光亮的通路(图6)，丁达尔效应是胶体溶液所具备的性质，初步说明成功制备了poly(mPEG-co-HM-S-S-DOX)NPs溶液
poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs粒径分布结果分析：
制备poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液。使用ZS-90马尔文激光衍射粒度仪测定该poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液粒径，结果显示为160.5±4.7nm(图7)，PDI值结果为0.16±0.009。该结果表明poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液粒径适宜且分布均匀。
poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs稳定性测定结果分析：
为了考察poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液在4℃、25℃和37℃的稳定性。分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h和72h取样，进行粒径测定。图8A为poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs在25℃下的稳定性，结果显示：经过72h的测定，NPs的粒径大小维持在180nm左右。同时，PDI维持在0.18左右，说明poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs在25℃具有良好的稳定性。图8B为poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs在4℃下的稳定性，经过72h的测定，poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs的粒径大小维持在170nm左右。同时，PDI维持在0.20左右；说明poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs在4℃具有良好的稳定性。图8C为poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs在37℃下的稳定性，经过72h的测定，NPs的粒径大小维持在160nm左右。同时，PDI维持在0.16左右；说明poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs在37℃具有良好的稳定性。图8D为NPs在37℃下并加入10wt％牛血清白蛋白的稳定性，经过72h的测定，poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs的粒径大小维持在140nm左右。同时，PDI维持在0.34左右；说明加入10wt％牛血清白蛋白得poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs在37℃具有良好的稳定性。综上所述，poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs在4℃、25℃和37℃及在FBS存在的情况下，均表现出良好的稳定性。
本发明利用mPEGMA360与HM共聚，再与DTDPA在合适条件下反应，最后键合DOX，制备出poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX，并将其结构进行FTIR、1H NMR、TGA、DSC和NPs溶液方面表征，最终证明poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX成功制备。通过溶剂挥发法将该产物制备成poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液，并用丁达尔现象验证该纳米粒成功制备。通过分析纳米粒溶液粒径测定结果表明，了解poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液粒径大小合适，粒度分布均匀(平均粒径大小为160.5±4.7nm，平均粒度分布PDI为0.16±0.009)。空白poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液的稳定性实验表明：在4℃、25℃、37℃和在37℃条件下加入FBS的poly(mPEG-co-HM)-S-S-DOX NPs溶液均表现出良好的稳定性，这一结果为我们后续研究做了一个参考。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。