一种具有高稳定性的水溶性方酸菁型近红外有机大分子光热剂的合成方法
阅读说明：本技术 一种具有高稳定性的水溶性方酸菁型近红外有机大分子光热剂的合成方法 (Synthetic method of water-soluble squarylium cyanine near-infrared organic macromolecular photo-thermal agent with high stability ) 是由 王红明 王怡刚 夏国民 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有高稳定性的水溶性方酸菁型近红外有机大分子光热剂的合成方法,属于生物医学技术领域。首先设计合成了一种传统的1,3-型方酸菁光热剂(SQ1),SQ1具有高的摩尔消光系数,因其水溶性较差以及化学不稳定性,本发明在SQ1的中心四元环的2’位通过共价键连接氨基修饰的PEG-(5000)长链,得到一个1,2,3-型方酸菁大分子光热剂(PSQ)。该光热剂在单分子的状态拥有高的光稳定性、化学稳定性,以及很好的水溶性；同时PSQ大分子是一个两亲性分子,它可以在水中自组装形成粒径、形貌均一的纳米粒子(NPs),纳米粒子在体外的光热性能研究中展示出了优异的光热性质。(The invention discloses a synthesis method of a water-soluble squarylium cyanine near-infrared organic macromolecular photo-thermal agent with high stability, belonging to the technical field of biomedicine. Firstly, a traditional 1, 3-type squaraine photo-thermal agent (SQ1) is designed and synthesized, SQ1 has high molar extinction coefficient, and due to poor water solubility and chemical instability, the invention connects amino modified PEG at the 2' position of a central four-membered ring of SQ1 through a covalent bond 5000 And (3) growing a long chain to obtain the 1,2, 3-type squaraine macromolecular photo-thermal agent (PSQ). The photo-thermal agent has high light stability, chemical stability and good water solubility in a monomolecular state; meanwhile, the PSQ macromolecule is an amphiphilic molecule, and can be self-assembled in water to form Nano Particles (NPs) with uniform particle size and morphology, and the nano particles show excellent photo-thermal properties in-vitro photo-thermal performance research.)
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种具有高稳定性的水溶性方酸菁型近红外有机大分子光热剂的合成方法。
背景技术
光热疗法(PTT)是一种典型的光子触发疗法，通过光热剂(PTAs)在可见光或近红外(NIR)激光下产生的局部高热来杀灭肿瘤细胞。它利用细胞对热的敏感性来诱导细胞凋亡或增加对放射性或化疗的敏感性。与传统的癌症治疗方式，如手术、放疗和化疗相比，PTT具有很大的吸引力，因为它可能具有高度的内在特异性和较低的侵入性负担。原则上，PTT还是一种对周围健康组织损害相对较小的癌症治疗手段。这是因为只有在应用NIR激光时，同时只有在PTAs存在时才会产生热效应。通过适当的设计，PTAs可以专门针对癌症部位，进一步提高选择性。鉴于分子设计在PTT的成功中起着如此关键的作用，毫不奇怪，相当多的努力已经被投入到开发新的的增敏剂。到目前为止，这种努力大多集中在近红外光触发的无机材料上，包括过渡金属纳米粒子、硫化物纳米粒子、金纳米粒子和铂纳米粒子。虽然这些系统通常显示出良好的吸收特性、出色的光热转换效率和良好的光稳定性，但它们缺乏生物降解性和潜在的长期毒性，给有效的临床转化工作带来了障碍。近年来，有机小分子作为纳米材料在PTT领域的潜在替代品受到越来越多的关注。这些分子增敏剂通常通过吸收近红外照射产生的光子而发挥作用。有机PTT感光剂的一个潜在优势在于，与无机材料不同，以有机小分子为基础的光热材料的设计考虑到安全和构成基底问题。它们的特点可以通过专门的合成来进一步微调。例如，有机小分子为基础的光热剂可以被进一步改性，以便发挥治疗学的功能。
方酸菁(SQs)通常由一个缺电子的中心四元环和两个电子给体组成，呈共振稳定的齐式给体-受体-给体(D-A-D)形式，已经被广泛应用于生物成像、离子检测、光动力疗法、光伏器件和非线性光学领域。这些染料在近红外区域表现出低的隙间穿越速率(ISC)和高摩尔吸光系数(ε＞105L·mol-1·cm-1)。因此，SQ衍生物以其独特的光学特性和良好的光稳定性成为一类有前途的PTAs。然而，SQ固有的化学不稳定性和较差的水溶性阻碍了其在生物学和医学上的应用。因此开发一种以SQ小分子为基础，同时具有高稳定性以及很好水溶性的光热剂是很有潜力的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高稳定性的水溶性方酸菁型近红外有机大分子光热剂的合成方法，它具有高的光热转换效率，以及良好的光、热、化学稳定性。
本发明具体是通过如下技术方案实现的：
一种具有高稳定性的水溶性方酸菁型近红外有机大分子光热剂的合成方法，包括以下步骤：
1)合成1,3-型方酸菁光热剂(SQ1)；
2)合成高稳定性的水溶性1,2,3-型方酸菁大分子光热剂(PSQ)；
3)将PSQ在水溶液中自组装形成纳米粒子。
进一步地，步骤1)所述SQ1的合成方法包括：
S1、将1,8-萘内酰亚胺(化合物1)溶于N,N-二甲基甲酰胺，冰水浴条件下缓慢加入氢化钠，搅拌15min后缓慢滴入碘乙烷，反应体系缓慢升至室温后继续搅拌2h，加水猝灭反应，萃取后使用柱色谱分离提纯得到黄色固体(化合物2)；
S2、将化合物2溶于超干四氢呋喃，冰水浴搅拌5min，逐滴滴加甲基氯化镁/四氢呋喃溶液之后将反应体系加热至60℃反应2h，加水猝灭反应，加入碘化钾溶液析出橙红色固体，抽滤得到化合物3；
S3、将化合物3与方酸溶于正丁醇/甲苯体积比1：1的混合溶剂中，使用分水器加热至回流反应3h，真空旋转蒸发反应溶剂后通过柱色谱分离提纯(洗脱液：二氯甲烷/甲醇体积比100：1)得到棕色产物即为SQ1。
反应过程如下：
进一步地，S1所述1,8-萘内酰亚胺、氢化钠、碘乙烷物质的量之比为5：25：6。
进一步地，S2所述化合物2、甲基氯化镁/四氢呋喃、碘化钾物质的量之比为1：3：0.001。
进一步地，S3所述化合物3与方酸物质的量之比为2：1。
进一步地，步骤2)所述PSQ的合成方法为：将步骤1)所得SQ1溶于二氯甲烷中，缓慢滴加三氟甲烷磺酸甲酯，室温搅拌6h后加入碘化钾溶液萃取，真空旋转蒸发二氯甲烷溶液后通过柱色谱分离提纯(洗脱液：二氯甲烷/甲醇体积比100：1)得到棕色产物(MSQ)；将MSQ与NH2-PEG5000溶于二氯甲烷，室温搅拌6h旋干反应溶剂后通过柱色谱分离提纯(洗脱液：二氯甲烷/甲醇体积比20：1)得到棕色油状液体即为PSQ。
反应过程如下：
进一步地，所述SQ1与三氟甲烷磺酸甲酯物质的量之比为1：3；所述MSQ与NH2-PEG5000物质的量之比为1：1。
进一步地，步骤3)自组装的具体操作为：将步骤2)所得PSQ溶于二甲基亚砜中，剧烈搅拌下缓慢滴入去离子水，然后室温搅拌过夜，透析后得到纳米粒子溶液。
反应过程如下：
进一步地，所述PSQ与滴入去离子水的质量体积比为20：1.8，mg:mL。
进一步地，所述透析使用的是去离子水，截留分子量为3500，每6h更换一次去离子水；所得的纳米粒子溶液存储于4℃条件下待用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首先合成了一种传统的1,3-型方酸菁光热剂SQ1，SQ1具有高的摩尔消光系数，因其水溶性较差以及化学不稳定性，本发明在SQ1的中心四元环的2’位通过共价键连接氨基修饰的PEG5000长链，得到一个1,2,3-型方酸菁大分子光热剂。该光热剂在单分子的状态拥有高的光稳定性、化学稳定性，以及很好的水溶性；同时PSQ大分子是一个两亲性分子，它可以在水中自组装形成粒径、形貌均一的纳米粒子，纳米粒子在体外的光热性能研究中展示出了优异的光热性质。
附图说明
图1是大分子光热剂PSQ的合成路线。
图2是SQ1与PSQ分别在磷酸盐缓冲盐溶液和二氯甲烷中的吸收光谱。
图3是SQ1、PSQ以及商用的光热剂ICG在自然光照12个小时后最大吸收强度。
图4是SQ1与PSQ是在37℃条件，与GSH反应35分钟后它们的最大吸收强度的变化。
图5中：(A)为SQ1和PSQ的计算吸收光谱；(B)为SQ1/PSQ和GSH的反应能量曲线；(C)为SQ1和PSQ的前线分子轨道。
图6是PSQ的分子结构及简化模型，在水溶液中自组装形成纳米粒子的示意图。
图7是纳米粒子的动态光散射粒径图，插入图为纳米粒子的环境扫描电子显微镜图片。
图8是不同浓度的纳米粒子水溶液，在功率密度为0.1W·cm-2的激光照射照射4分钟水溶液的升温曲线。
图9是500μg·mL-1的纳米粒子水溶液，经过6个循环的激光照射升温-自然冷却的温度曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(1)SQ1的制备：第一步：1,8-萘内酰亚胺(化合物1，5mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，在冰水浴的条件下缓慢加入氢化钠(25mmol)，搅拌15min后缓慢滴入碘乙烷(6mmol)，反应体系缓慢升至室温后继续搅拌2h后，加水淬灭反应，萃取后使用柱色谱(洗脱剂石油醚，乙酸乙酯体积比为15：1)分离提纯得到化合物2，得到黄色固体827mg，产率84％。第二步：将化合物2(2mmol)溶于超干四氢呋喃(20mL)，冰水浴搅拌5min后，通过注射器逐滴滴加甲基氯化镁/四氢呋喃溶液(2mL,3mol/L)之后反应体系加热至60℃反应2h后，加水淬灭反应后加入碘化钾溶液(2mL,1mmol/L)析出橙红色固体，抽滤得到化合物3，无需处理可直接进行下一步反应。第三步：化合物3(2mmol)与方酸(1mmol)溶于正丁醇/甲苯1：1的混合溶剂中，使用分水器加热至回流反应3h，真空旋转蒸发反应溶剂后通过柱色谱分离提纯(洗脱液：二氯甲烷/甲醇体积比100：1)得到SQ1棕色产物249mg，产率为53.2％。
(2)PSQ的制备：第一步：将SQ1(1mmol)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加三氟甲烷磺酸甲酯(3mmol)，室温下搅拌6h加入KI溶液萃取，真空旋转蒸发二氯甲烷溶液后通过柱色谱分离提纯(洗脱液：二氯甲烷/甲醇体积比100：1)得到棕色产物(MSQ)；第二步：将MSQ(0.1mmol)与NH2-PEG5000(0.1mmol)溶于20mL的二氯甲烷后，室温搅拌6h旋干反应溶剂后通过柱色谱分离提纯(洗脱液：二氯甲烷/甲醇体积比20：1)得到PSQ棕色油状液体296mg，产率为53.3％。具体过程如图1所示。
(3)由图2可见，SQ1和PSQ在二氯甲烷中的最大吸收波长分别为883与875nm，而在水溶液中二者的最大吸收波长均出现明显的蓝移，SQ1蓝移至710nm，而PSQ则蓝移至740nm。接下来研究了SQ1、PSQ以及商用光热剂ICG的光稳定性，在自然光连续照射12h，每隔1h测量一次他们在最大吸收波长的吸光度，由图3可得，SQ1与PSQ在连续照射12h后，最大吸收波长处的吸光度没有明显变化，而相比于ICG，其吸光度则是一直下降，可见SQ1与PSQ的光稳定性较ICG更好。PSQ相对于SQ1的化学稳定性在接下来被研究，在37℃水浴的条件下，用过量的GSH分别处理SQ1和PSQ，吸收变化的时间分辨如图4所示，30分钟后，PSQ的吸收光谱几乎保持不变，至于SQ1，吸收强度随时间急剧下降，10分钟后溶液几乎完全褪色。这表明PSQ的化学稳定性明显优于SQ1。为了进一步了解SQ1和PSQ的光学行为和稳定性，通过DFT和TDDFT方法计算了PSQ和SQ1的吸收光谱以及与GSH的反应机制。如图5(A)，SQ1和PSQ分子在DCM中从基态到激发态的吸收波长分别为881和862nm，所有计算出的吸收都与实验值很一致。如图5(B)所示，计算了SQ1和PSQ与GSH的反应能量曲线，第一步是GSH对SQ1中心四元环的亲核加成，通过过渡态TSSQ1形成加合物PSQ1。这个过程的能垒和反应能分别为15.83千卡/摩尔和-3.99千卡/摩尔。然而，PSQ和GSH之间的反应却非常不同。GSH对PSQ中心四元环的亲核加成导致过渡态TSPSQ的能量障碍为22.76千卡/摩尔，随后形成产物PPSQ。PSQ和GSH之间的反应能量为4.02千卡/摩尔。作为一个吸热反应以及拥有较高的能量屏障和意味着后者在生理条件很难进行。但SQ1和GSH之间的反应在相同条件下很容易进行，因为它是一个放热反应以及拥有较低的反应能垒。
(4)如图6所示，PSQ的是一个两亲性的分子，方酸菁部分疏水，而PEG长链部分亲水，分子构型如图中示意图所示，其可以在水溶液搅拌后自组装形成粒径均一的纳米粒子，之后再去离子水中透析72h，分别用环境扫描电子显微镜和动态光散射粒径分析仪表征纳米粒子，结果显示该纳米粒子平均粒径为105nm球形粒子。这表明该粒子可通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)富集在肿瘤组织内，从而达到好的光热治疗效率。接下来研究了纳米粒子的光热效应，首先不同浓度的纳米粒子水溶液在激光(0.1W/cm，808nm)的激发下，展现出不同的升温效果，其中500μg/mL的纳米粒子在4分钟的照射后，从28摄氏度升至98摄氏度，结果如图8所示，而在图9中，是最大浓度的一组在6个循环激光加热升温与自然冷却降温的温度曲线图，纳米粒子展示出良好的光热稳定性，在第6次循环仍然能保持良好的升温效果。
以上所描述的实施例仅为本发明优选实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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