一种鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法
阅读说明：本技术 一种鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法 (Separation and purification method of eicosapentaenoic acid in fish oil ) 是由 王希 陶冶 陈强强 郁明钧 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法。本发明的鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法,包括如下步骤：1)将鱼油粗品进行溶解、过滤,得到鱼油溶液；2)将步骤1)得到的鱼油溶液上样到装有UniSil微球的层析柱中进行层析,采用纯水和有机溶剂作为流动相对鱼油溶液进行洗脱；3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的鱼油溶液,对符合要求的组份液进行汇总,得到纯化的二十碳五烯酸。本发明的鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法,仅需一步层析分离纯化鱼油中EPA,不仅纯度高、收率高且稳定,而且操作简单方便,所用固定相可重复利用,所用流动相量少节约,大大降低了成本。(The invention provides a method for separating and purifying eicosapentaenoic acid in fish oil. The method for separating and purifying the eicosapentaenoic acid in the fish oil comprises the following steps: 1) dissolving and filtering the crude fish oil product to obtain a fish oil solution; 2) loading the fish oil solution obtained in the step 1) into a chromatographic column filled with UniSil microspheres for chromatography, and eluting the fish oil solution by using pure water and an organic solvent as mobile phases; 3) collecting the fish oil solution of the target peak value after chromatography and elution in the step 2) in sections, and summarizing the component liquid meeting the requirements to obtain the purified eicosapentaenoic acid. The method for separating and purifying eicosapentaenoic acid in fish oil only needs one-step chromatographic separation and purification of EPA in fish oil, not only has high purity, high and stable yield, but also has simple and convenient operation, can repeatedly utilize the used stationary phase, saves a small amount of the used mobile phase and greatly reduces the cost.)
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，涉及一种二十碳五烯酸的分离纯化方法，尤其涉及一种鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法。
背景技术
二十碳五烯酸(EicosapentaenoicAcid)是一种有机物，分子式为C20H30O2，分子量为302.451，常温下为无色至淡黄色透明液体，无味，无臭，氧化后有一定的气味，常应用于保健用途。
Ω-3脂肪酸，包括EPA在内，对肺病、肾病、2型糖尿病、大肠溃疡和节段性回肠炎的治疗都会起到积极的作用。存在于鱼油中的Ω-3脂肪酸(包括EPA)已经证实能减少有害的免疫反应，并对治疗由自身免疫缺陷引起的炎症有效，例如风湿性关节炎。Ω-3脂肪酸已经被证实能促进循环系统的健康和防止胆固醇和脂肪在动脉壁上积聚，补充鱼油也能使糖尿病患者减低高血压。保持身体里的Ω-3脂肪酸含量处于一个适当平衡的位置对正常的生长和发育是十分必要的。营养专家建议婴儿应从日常饮食和补充剂中吸收各种类型的Ω-3脂肪酸。根据这些建议的要求，婴儿在日常饮食中吸收的EPA应少于0.1％。
其中，EPA的结构式如下所示：
CN107586259A公开了一种纯化不饱和脂肪酸以及二十碳五烯酸的方法，纯化不饱和脂肪酸的方法包括提供乙酯化鱼油，以模拟移动床层析法将乙酯化鱼油中的包含二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸的不饱和脂肪酸分离开来，藉此得到高纯度的包含二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸的不饱和脂肪酸。该发明的不饱和脂肪酸的纯化方法透过应用模拟移动床层析法来从鱼油中分离出包含二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸的不饱和脂肪酸，不仅可有效提升分离效率，更可获得高纯度的包含二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸的不饱和脂肪酸。但是，该方法的二十碳五烯酸的纯度有待进一步提高。
CN107586609A公开了一种含有高浓度的二十碳五烯酸乙酯的鱼油及其纯化方法，涉及二十碳五烯酸乙酯制备领域。该纯化方法包括：根据鱼油中各脂肪酸的含量，获取各脂肪酸的结晶点温度范围；再采用动态熔融结晶法，在各脂肪酸的所述结晶点温度范围内以1-℃/小时的降温速率进行降温，使鱼油中所含的杂质脂肪酸结晶析出后除去。该方法使鱼油中易结晶的杂质脂肪酸通过在结晶点温度范围内设置适宜的降温速率，不断的结晶析出，同时使鱼油母液中的二十碳五烯酸乙酯不断浓缩，分离效率高。这种鱼油中二十碳五烯酸乙酯的含量高，生物活性好，医药用途广泛。但是，该方法的二十碳五烯酸的收率有待进一步提高。
因此，提供一种纯度高、收率高的鱼油中二十碳五烯酸的高效分离纯化方法很有必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足纯度>97％的要求，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低了生产成本。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将EPA纯度为70-75％的鱼油粗品进行溶解、过滤，得到EPA的浓度为10-20mg/mL的鱼油溶液；
2)将步骤1)得到的鱼油溶液上样到装有UniSil微球的层析柱中进行层析，采用纯水和有机溶剂作为流动相对鱼油溶液进行洗脱，其中，所述流动相中有机溶剂的体积百分比为89.5-90.5％；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的鱼油溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的二十碳五烯酸。
步骤2)中，所述UniSil微球的型号是C18UniSil微球。C18UniSil微球是一种粒径为10-30μm、孔径为的高分子微球，该微球具有严格控制的粒径大小和孔径结构，为单分散的、具有孔道结构的微球，使其作为色谱填料时具有很好的针对性。优选地，所述C18UniSil微球的粒径为20μm。
步骤1)中，所述鱼油粗品的EPA纯度为70-75％，例如为70％、71％、72％、73％、74％、75％等；所述鱼油溶液中EPA的浓度为10-20mg/mL，例如为10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL或20mg/mL等。
步骤2)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈中的一种；优选为甲醇。
步骤2)中，所述流动相中，所述纯水与所述有机溶剂的体积比为(9.5-10.5):(89.5-90.5)。
本发明采用有机溶剂和纯化水作为流动相，仅用6-8个柱体积就可完成EPA的洗脱，因此本过程所用流动相安全、无污染且成本较低，并且使用的流动相量较少，纯化周期比较短。其中，本发明中填料的体积为490mL，即一个柱体积为490mL。
步骤2)中，所述洗脱的具体过程为：采用有机溶剂体积百分比为89.5～90.5％的流动相对鱼油溶液进行洗脱，所述洗脱的时间为50-70min，例如洗脱的时间为50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min、64min、65min、66min、67min、68min、69min或70min等；所述流动相的流速为70-80mL/min，例如为70mL/min、71mL/min、72mL/min、73mL/min、74mL/min、75mL/min、76mL/min、77mL/min、78mL/min、79mL/min或80mL/min等。
步骤2)上样前还包括对层析柱进行柱前处理的步骤。
所述柱前处理的具体过程为：采用纯甲醇对层析柱进行除杂，再采用有机溶剂体积百分比为89.5～90.5％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡。
步骤1)中，所述过滤采用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤，例如滤膜的孔径为0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm或0.5μm等。
作为本发明的优选方案，一种鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将EPA纯度为70-75％的鱼油粗品用体积百分比为89.5～90.5％的甲醇溶液进行溶解，采用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤，得到EPA浓度为10-20mg/mL的鱼油溶液；
2)采用纯甲醇对装有C18UniSil微球的层析柱进行除杂，再采用有机溶剂体积百分比为89.5～90.5％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡，将步骤1)得到的鱼油溶液上样到经平衡处理的层析柱中进行层析，采用有机溶剂体积百分比为89.5～90.5％的流动相对鱼油溶液进行洗脱，所述洗脱的时间为50-70min，所述流动相的流速为70-80mL/min；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的鱼油溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的二十碳五烯酸。
本发明的目的之二在于提供一种目的之一所述的分离纯化方法得到的二十碳五烯酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的鱼油中二十碳五烯酸的分离纯化方法，仅需一步层析分离纯化鱼油中EPA，不仅纯度高、收率高且稳定，而且操作简单方便，所用固定相可重复利用，所用流动相量少节约，采用有机溶剂和纯化水作为流动相，仅用6-8个柱体积就可完成EPA的洗脱，因此本过程所用流动相安全、无污染且成本较低，并且使用的流动相量较少，纯化周期比较短，大大降低了成本。具体的，仅需一步层析纯化即可满足纯度>98％的要求，纯化收率>95％。
附图说明
图1为本发明的实施例1使用的C18UniSil微球的扫描电镜照片；
图2为本发明的实施例1纯化前的鱼油中二十碳五烯酸(EPA)的气相色谱分析；
图3为本发明的实施例1纯化后的鱼油中二十碳五烯酸(EPA)的气相色谱分析。
具体实施方式
下面结合附图1-3，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备得到。
实施例1
1)取EPA纯度为73％的鱼油粗品，加入89.5％甲醇溶解，溶液中EPA含量为15mg/mL；待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用；
2)采用50×250mm的色谱柱，UniSilC18(苏州纳微科技股份有限公司生产，粒径为20μm、孔径为)作为层析柱填料，装柱体积为490mL；对层析柱进行柱前预处理，先用纯甲醇进行除杂，后用甲醇体积百分比为89.5％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡；然后采用甲醇体积百分比为89.5％的流动相对鱼油溶液进行洗脱60min，流速控制在75mL/min；
3)分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中EPA的纯度为98.52％，收率为95.6％。
其中，图1为实施例1使用的C18UniSil微球的扫描电镜照片，可以看出C18UniSil微球具有严格控制的粒径大小和孔径结构，为单分散的、具有孔道结构的微球。图2是纯化前的鱼油中二十碳五烯酸的气相色谱分析，可见有一定的杂质。图3是纯化后的鱼油中二十碳五烯酸的气相色谱分析，可见杂质非常少，杂峰非常小。
实施例2
1)取EPA纯度为73％的鱼油粗品，加入90.5％甲醇溶液，溶液中EPA含量为15mg/mL；待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用；
2)采用50×250mm的色谱柱，UniSilC18(苏州纳微科技股份有限公司生产，粒径为20μm、孔径为)作为层析柱填料，装柱体积为490mL；对层析柱进行柱前预处理，先用高浓度有机相进行除杂，后用甲醇体积百分比为90.5％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡；然后采用甲醇体积百分比为90.5％的流动相对鱼油溶液进行洗脱60min，流速控制在75ml/min；
3)分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中EPA的纯度为98.05％，收率为96.1％。
实施例3
本实施例与实施例1的区别之处在于，未进行柱前处理，即未对层析柱进行除杂和平衡，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中EPA的纯度为98.33％，收率为95.4％。
实施例4
本实施例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相中的有机溶剂为乙醇，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中EPA的纯度为98.09％，收率为95.3％。
对比例1
本对比例与实施例1的区别之处在于，层析柱中的填充相为市场上非均粒华谱15μmC18，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中EPA的纯度为96.7％，收率为90.8％。
对比例2
本对比例为常规的EPA的纯化方法，直接采用分子精馏法。
馏分中EPA的纯度为85％。
对比例3
本对比例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为纯甲醇，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中EPA的纯度为90％，收率为96％。
对比例4
本实施例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为中有机溶剂的体积百分比为50％，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中EPA的纯度为98.5％，收率为80％。
对比例5
本对比例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为有机溶剂的体积百分比为95％，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中EPA的纯度为90.1％，收率为97％。
本发明用于鱼油中二十碳五烯酸(EPA)的深度精纯，仅需一步层析纯化即可满足EPA纯度>98％的要求，纯化收率>95％而稳定，同时本发明纯化分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低了生产成本。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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