一种滨柃精油的制备方法
阅读说明：本技术 一种滨柃精油的制备方法 (Preparation method of Eurya emarginata essential oil ) 是由 边浩宇 崔大练 陈云飞 于 2021-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种滨柃精油的制备方法,包括以下步骤：S1.将滨柃的枝叶部分置于烘箱中烘22-26小时,取出后转入中药粉碎机中粉碎得到滨柃干粉；S2.将步骤S1得到的滨柃干粉加入无水乙醇中,搅拌均匀后置于超声清洗仪中超声振荡20-40分钟得到提取液,将提取液静置2-4天分层得到上清液一；S3.将步骤S2得到的上清液一加入圆底烧瓶中,将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪中,加热后浓缩3-5小时得到浓缩液；S4.将步骤S3得到的浓缩液用离心机离心分离5-15分钟得到上清液二,将上清液二冷冻干燥后得到滨柃精油。本发明稳定可靠,且制得的滨柃精油具有较好的抑菌性能。(The invention provides a preparation method of Eurya emarginata essential oil, which comprises the following steps: s1, placing the branches and leaves of Eurya emarginata into an oven to be dried for 22-26 hours, taking out the Eurya emarginata, and then transferring the Eurya emarginata into a traditional Chinese medicine pulverizer to be pulverized to obtain Eurya emarginata dry powder; s2, adding the Eurya emarginata dry powder obtained in the step S1 into absolute ethyl alcohol, uniformly stirring, placing the Eurya emarginata dry powder into an ultrasonic cleaning instrument, carrying out ultrasonic oscillation for 20-40 minutes to obtain an extracting solution, and standing the extracting solution for 2-4 days for layering to obtain a supernatant I; s3, adding the supernatant I obtained in the step S2 into a round-bottom flask, placing the round-bottom flask into a rotary evaporator, heating, and concentrating for 3-5 hours to obtain a concentrated solution; and S4, centrifuging the concentrated solution obtained in the step S3 by using a centrifugal machine for 5-15 minutes to obtain a supernatant II, and freeze-drying the supernatant II to obtain the Eurya emarginata essential oil. The Eurya emarginata essential oil is stable and reliable, and the prepared Eurya emarginata essential oil has good bacteriostatic performance.)
技术领域
本发明涉及一种滨柃精油的制备方法。
背景技术
随着社会的发展，人们对生活质量的追求日益提高，危害小、环境友好并且具有多种实际用途的植物精油渐渐走进人们的视野，玫瑰精油等植物精油备受人们青睐，不仅如此，对于植物精油的提取与研究一直是热门话题。植物精油又称挥发油、香精油或者芳香油，为植物体产生的具有挥发性芳香气味的次生代谢产物。植物精油作为一种新型冷杀菌技术，具有多种优势，如抗菌谱较广、抑菌效果明显、残留毒性小。早在四百多年前，李时珍撰写的《本草纲目》中就详细记录了一些植物精油提取以及应用的资料。目前，植物精油在香料工业、医疗、农业等方面均得到了应用和发展，在其抑菌性、成分、生理作用、药理作用等方面都有较为系统的研究。现今植物精油存在的问题是，有些植物的精油提取无法使用实验室最基本的水蒸气蒸馏法提取，有的植物提取出来的精油的抑菌效果也不佳。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种滨柃精油的制备方法，该制备方法稳定可靠，且制得的滨柃精油具有较好的抑菌性能。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种滨柃精油的制备方法，包括以下步骤：
S1.将滨柃的枝叶部分置于烘箱中烘22-26小时，取出后转入中药粉碎机中粉碎得到滨柃干粉；
S2.将步骤S1得到的滨柃干粉加入无水乙醇中，搅拌均匀后置于超声清洗仪中超声振荡20-40分钟得到提取液，将提取液静置2-4天分层得到上清液一；
S3.将步骤S2得到的上清液一加入圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪中，加热后浓缩3-5小时得到浓缩液；
S4.将步骤S3得到的浓缩液用离心机离心分离5-15分钟得到上清液二，将上清液二冷冻干燥后得到滨柃精油。
进一步地，本发明所述步骤S1中，滨柃干粉的粒径为150μm。
进一步地，本发明所述步骤S2中，滨柃干粉、无水乙醇的比例为(0.5-1.5)g:2mL。
进一步地，本发明所述步骤S2中，超声清洗仪的功率为70％。
进一步地，本发明所述步骤S3中，加热的温度为70-80℃。
进一步地，本发明所述步骤S4中，离心分离的速度为5000rpm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明先将滨柃的枝叶部分烘干、粉碎，然后与提取剂无水乙醇混匀，通过超声提取得到提取液，将提取液静置分层后旋蒸浓缩，再离心分离、冷冻干燥制得滨柃精油，其中，超声提取步骤利用超声波空化作用加速滨柃组织中的有效成分释放溶出，此外，超声波次级效应(如机械震动、击碎、化学效应等)同样也能加速滨柃组织中有效成分的扩散、释放，使其与提取剂充分混合而利于滨柃精油的提取，有效提高了滨柃精油的提取率和抑菌性能。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
按照以下步骤制备滨柃精油：
S1.将滨柃的枝叶部分置于烘箱中烘24小时，取出后转入中药粉碎机中粉碎得到粒径为150μm的滨柃干粉；
S2.按照1g:2mL的比例将步骤S1得到的滨柃干粉加入无水乙醇中，搅拌均匀后置于功率为70％的超声清洗仪中超声振荡30分钟得到提取液，将提取液静置3天分层得到上清液一；
S3.将步骤S2得到的上清液一加入圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪中，加热至78℃后浓缩4小时得到浓缩液；
S4.将步骤S3得到的浓缩液用离心机5000rpm速度下离心分离10分钟得到上清液二，将上清液二冷冻干燥后得到滨柃精油。
试验例一：对白色念珠菌抑菌圈测试
试验器材：培养皿；锥形瓶；超净工作台；1000mL瓷杯；电磁炉；电热恒温培养箱；恒温摇床；万分之一天平；接种环；精灯；涂布棒；滤纸片；玻璃棒；高压灭菌锅；移液枪。
试验试剂：白色念珠菌菌种；实施例1制得的滨柃精油；LB肉汤；琼脂粉；水。
试验方法：
(1)取已消毒的无菌平皿，将已溶化并冷却至50℃左右的LB培养基按无菌操作法倒入平皿中，使其冷却制成平板。
(2)制备菌悬液，取无菌试管，用接种环取白色念珠菌1-2环接入无菌水中，充分均匀，制成菌悬液。
(3)接种，用无菌移液枪吸取已经制好的菌悬液0.1mL接种于平板，用无菌玻璃铲涂匀。
(4)浸药，将无菌滤纸片浸入供式药剂(实施例1制得的滨柃精油)中。
(5)加药剂，用无菌镊子夹取浸药滤纸片(注意把药液沥干)，分别平铺于同一含菌平板上，注意药剂之间勿互相沾染，并在平板背面做好标记培养，将平板置于37℃下培养48-72h后观察结果。
测试结果如表1所示：
表1
试验例二：对大肠杆菌抑菌圈测试
试验器材：培养皿；锥形瓶；超净工作台；1000mL瓷杯；电磁炉；电热恒温培养箱；恒温摇床；万分之一天平；接种环；精灯；涂布棒；滤纸片；玻璃棒；高压灭菌锅；移液枪。
试验试剂：大肠杆菌菌种；实施例1制得的滨柃精油；LB肉汤；琼脂粉；水。
试验方法：
(1)取已消毒的无菌平皿，将已溶化并冷却至50℃左右的LB培养基按无菌操作法倒入平皿中，使其冷却制成平板。
(2)制备菌悬液，取无菌试管，用接种环取大肠杆菌1-2环接入无菌水中，充分均匀，制成菌悬液。
(3)接种，用无菌移液枪吸取已经制好的菌悬液0.1mL接种于平板，用无菌玻璃铲涂匀。
(4)浸药，将无菌滤纸片浸入供式药剂(实施例1制得的滨柃精油)中。
(5)加药剂，用无菌镊子夹取浸药滤纸片(注意把药液沥干)，分别平铺于同一含菌平板上，注意药剂之间勿互相沾染，并在平板背面做好标记培养，将平板置于37℃下培养48-72h后观察结果。
测试结果如表2所示：
空白组
1
2
3
4
5
6
均值
抑菌圈直径(mm)
0
1.8
2.2
2.0
1.8
2.6
2.2
2.1
表2
试验例三：对金黄色葡萄球菌抑菌圈测试
试验器材：培养皿；锥形瓶；超净工作台；1000mL瓷杯；电磁炉；电热恒温培养箱；恒温摇床；万分之一天平；接种环；精灯；涂布棒；滤纸片；玻璃棒；高压灭菌锅；移液枪。
试验试剂：金黄色葡萄球菌菌种；实施例1制得的滨柃精油；LB肉汤；琼脂粉；水。
试验方法：
(1)取已消毒的无菌平皿，将已溶化并冷却至50℃左右的LB培养基按无菌操作法倒入平皿中，使其冷却制成平板。
(2)制备菌悬液，取无菌试管，用接种环取金黄色葡萄球菌1-2环接入无菌水中，充分均匀，制成菌悬液。
(3)接种，用无菌移液枪吸取已经制好的菌悬液0.1mL接种于平板，用无菌玻璃铲涂匀。
(4)浸药，将无菌滤纸片浸入供式药剂(实施例1制得的滨柃精油)中。
(5)加药剂，用无菌镊子夹取浸药滤纸片(注意把药液沥干)，分别平铺于同一含菌平板上，注意药剂之间勿互相沾染，并在平板背面做好标记培养，将平板置于37℃下培养48-72h后观察结果。
测试结果如表3所示：
表3
由表1至表3可看出，本发明实施例1制得的滨柃精油对白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌效果。
试验例四：比浊法测试滨柃精油对白色念珠菌的抑菌效果
试验器材：超净工作台、酒精灯、分光光度计、比色皿、恒温摇床、移液枪、三角烧瓶、无菌PC管。
试验试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、白色念珠菌菌种；实施例1制得的滨柃精油。
试验方法：
用移液枪分别移去0.5mL和1mL滨柃精油转入盛有94mL和95mL LB液的250mL三角烧瓶内，并标号1和2。用移液枪移取5mL白色念珠菌过夜培养液(培养10-12h)转入含有95mLLB液的三角烧瓶并标号空白和标号1和2的三角烧瓶内，混合均匀后置于摇床37℃震荡培养(震荡频率250r/min)，分别再培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20h时严格按无菌操作取样3mL放入无菌PC管中，并用封口膜进行封口，样品立即置入冰箱中贮存，最后同一测定吸光度。取样后将三角烧瓶立刻放回摇床，继续震荡培养，为后续取样所用。
比浊测定：用未接种的LB培养基做对照，选取600nm波长进行光电比浊测定，从最早起初的培养液开始依次测定。
测试结果如表4所示：
时间
0
1.5
3
4
6
8
10
12
14
16
18
20
空白组OD
0.087
0.109
0.382
0.432
0.731
1.109
0.898
1.392
1.581
1.645
1.622
1.903
1号瓶OD
0.539
0.604
0.739
0.87
0.98
1.105
1.029
1.339
1.453
1.674
1.675
0.821
2号瓶OD
0.985
1.049
2.12
1.242
1.586
1.632
1.457
1.727
1.628
1.807
1.799
1.782
表4
由表4可看出：
1.正常培养条件下，随着时间的增加，培养基越来越浑浊，白色念珠菌的浓度不断增加，大约12h后，白色念珠菌的浓度趋于稳定。
2.在含有0.5mL滨柃精油(1号瓶)的培养基中，白色念珠菌的浓度趋于一种平缓增长，但在18h时由于营养物质的消耗和滨柃精油的抑制导致菌液浓度陡然下降。
3.在含有1mL的滨柃精油(2号瓶)的培养基中，菌液在3h时出现大幅度增长，随后又在4h时趋于一种平缓增长，可能是由于滨柃精油的持续抑制。
试验例五：比浊法测试滨柃精油对大肠杆菌的抑菌效果
试验器材：超净工作台、酒精灯、分光光度计、比色皿、恒温摇床、移液枪、三角烧瓶、无菌PC管。
试验试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、大肠杆菌菌种；实施例1制得的滨柃精油。
试验方法：
用移液枪分别移去0.5mL和1mL滨柃精油转入盛有94mL和95mL LB液的250mL三角烧瓶内，并标号1和2。用移液枪移取5mL大肠杆菌过夜培养液(培养10-12h)转入含有95mLLB液的三角烧瓶并标号空白和标号1和2的三角烧瓶内，混合均匀后置于摇床37℃震荡培养(震荡频率250r/min)，分别再培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20h时严格按无菌操作取样3mL放入无菌PC管中，并用封口膜进行封口，样品立即置入冰箱中贮存，最后同一测定吸光度。取样后将三角烧瓶立刻放回摇床，继续震荡培养，为后续取样所用。
比浊测定：用未接种的LB培养基做对照，选取600nm波长进行光电比浊测定，从最早起初的培养液开始依次测定。
测试结果如表5所示：
时间
0
1.5
3
4
6
8
10
12
14
16
18
20
空白组OD
0.173
0.232
0.411
0.409
0.297
0.494
0.598
0.619
0.789
0.893
0.946
0.795
1号瓶OD
0.639
0.938
0.931
0.569
0.968
0.666
1.141
1.236
1.322
1.495
1.08
0.453
2号瓶OD
0.469
0.597
0.531
0.737
0.658
0.664
0.744
0.747
0.847
0.857
1.074
0.944
表5
由表5可看出：
1.1号瓶和2号瓶相比，2号瓶更加稳定。
2.2号瓶的整体走势与空白组类似，有可能是由于2号瓶的抑菌不明显导致。
3.在试验过程中发现1号瓶出现了沉淀，故推测1号瓶出现骤升随后紧接着断崖式下降是因为沉淀，导致所取得的吸光度测试样品的浓度发生了较大变化。
试验例六：比浊法测试滨柃精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
试验器材：超净工作台、酒精灯、分光光度计、比色皿、恒温摇床、移液枪、三角烧瓶、无菌PC管。
试验试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、金黄色葡萄球菌菌种；实施例1制得的滨柃精油。
试验方法：
用移液枪分别移去0.5mL和1mL滨柃精油转入盛有94mL和95mL LB液的250mL三角烧瓶内，并标号1和2。用移液枪移取5mL金黄色葡萄球菌过夜培养液(培养10-12h)转入含有95mL LB液的三角烧瓶并标号空白和标号1和2的三角烧瓶内，混合均匀后置于摇床37℃震荡培养(震荡频率250r/min)，分别再培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20h时严格按无菌操作取样3mL放入无菌PC管中，并用封口膜进行封口，样品立即置入冰箱中贮存，最后同一测定吸光度。取样后将三角烧瓶立刻放回摇床，继续震荡培养，为后续取样所用。
比浊测定：用未接种的LB培养基做对照，选取600nm波长进行光电比浊测定，从最早起初的培养液开始依次测定。
测试结果如表6所示：
表6
由表6可看出：
数据波动很大，尤其是2号瓶的波谷值甚至到了负值，而与2号瓶精油浓度相差0.5mL的1号瓶却是上升趋势，且有数值较大的波峰，这种情况的出现可能是沉淀产生而导致的。
实施例2
按照以下步骤制备滨柃精油：
S1.将滨柃的枝叶部分置于烘箱中烘22小时，取出后转入中药粉碎机中粉碎得到粒径为150μm的滨柃干粉；
S2.按照1.5g:2mL的比例将步骤S1得到的滨柃干粉加入无水乙醇中，搅拌均匀后置于功率为70％的超声清洗仪中超声振荡40分钟得到提取液，将提取液静置2天分层得到上清液一；
S3.将步骤S2得到的上清液一加入圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪中，加热至80℃后浓缩3小时得到浓缩液；
S4.将步骤S3得到的浓缩液用离心机5000rpm速度下离心分离15分钟得到上清液二，将上清液二冷冻干燥后得到滨柃精油。
实施例3
按照以下步骤制备滨柃精油：
S1.将滨柃的枝叶部分置于烘箱中烘26小时，取出后转入中药粉碎机中粉碎得到粒径为150μm的滨柃干粉；
S2.按照0.5g:2mL的比例将步骤S1得到的滨柃干粉加入无水乙醇中，搅拌均匀后置于功率为70％的超声清洗仪中超声振荡20分钟得到提取液，将提取液静置4天分层得到上清液一；
S3.将步骤S2得到的上清液一加入圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪中，加热至70℃后浓缩5小时得到浓缩液；
S4.将步骤S3得到的浓缩液用离心机5000rpm速度下离心分离5分钟得到上清液二，将上清液二冷冻干燥后得到滨柃精油。
实施例4
按照以下步骤制备滨柃精油：
S1.将滨柃的枝叶部分置于烘箱中烘25小时，取出后转入中药粉碎机中粉碎得到粒径为150μm的滨柃干粉；
S2.按照1.2g:2mL的比例将步骤S1得到的滨柃干粉加入无水乙醇中，搅拌均匀后置于功率为70％的超声清洗仪中超声振荡35分钟得到提取液，将提取液静置3天分层得到上清液一；
S3.将步骤S2得到的上清液一加入圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪中，加热至75℃后浓缩3.5小时得到浓缩液；
S4.将步骤S3得到的浓缩液用离心机5000rpm速度下离心分离8分钟得到上清液二，将上清液二冷冻干燥后得到滨柃精油。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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