防治茄科植物黑胫病和青枯病的微生物复合菌剂及其应用
阅读说明：本技术 防治茄科植物黑胫病和青枯病的微生物复合菌剂及其应用 (Microbial compound bacterium agent for preventing and treating black shank and bacterial wilt of solanaceae plants and application thereof ) 是由 陈雅琼 张仁军 王亮 李�杰 徐兴阳 谢永辉 魏刚 周元 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物防治技术领域,具体涉及一种防治茄科植物黑胫病和青枯病的微生物复合菌剂及其应用。所述微生物复合菌剂由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)组成。本发明的微生物复合菌剂不仅大为提高了茄科植物对黑胫病和青枯病的抗病能力,还明显促进了植株的生长,对农业生产有重要意义。(The invention relates to the technical field of biological control, in particular to a microbial compound microbial inoculum for controlling black shank and bacterial wilt of solanaceae plants and application thereof. The microbial compound bacteria agent consists of Paenibacillus polymyxa (Paenibacillus polymyxa), Trichoderma harzianum (Trichoderma harzianum) and Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens). The microbial compound bacterial agent provided by the invention not only greatly improves the resistance of solanaceae plants to black shank and bacterial wilt, but also obviously promotes the growth of the plants, and has important significance for agricultural production.)
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种防治茄科植物黑胫病和青枯病的微生物复合菌剂及其应用。
背景技术
黑胫病和青枯病是由病原菌疫霉(Phytophthora nicotianae)和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的维管束病害，黑胫病为真菌性病害，青枯病为细菌性病害。该两种病原可以单独侵染上百种作物，也常常混合侵染作物，严重危害蔬菜和粮食经济作物生产，带来巨大的经济损失。
目前施用化学农药仍是防治黑胫病和青枯病的主要措施，但化学药剂毒性大，会造成环境污染严重、产生抗药性等诸多问题。研究表明，利用自然界病原菌的天敌微生物进行生物防治及生态调控是控制黑胫病和青枯病的安全、有效措施之一。微生物防治不但解决了化学农药存在的农药残留、抗药性、土壤和地下水污染问题，有效延迟了土传病害的发生，还具有明显的后效作用。
在实际农业生产中，单一菌剂的防效并不理想，存在持效性差、环境依赖性强、对目标病害难以达到理想防治效果的问题，而复合微生物菌剂因具有提高生物防治效果及延长活性微生物作用期限而成为新的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服单一菌剂防治黑胫病和青枯病效果不佳的缺陷，提高茄科植物的抗病能力。
本发明提供一种防治茄科植物黑胫病和青枯病的微生物复合菌剂，由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)组成。
在本发明的一些实施例中，所述微生物复合菌剂由多粘类芽孢杆菌、哈茨木霉和荧光假单胞菌的菌粉按照1:2-3:1-2的质量比混合而成。
在本发明的一些实施例中，所述微生物复合菌剂的制备方法包括：
步骤1.将哈茨木霉接种于PDA固体培养基中，于28℃培养至孢子长满平板，用无菌涂布棒和无菌水刮洗平板，制成孢子悬液；将孢子悬液拌于无菌的麦麸豆粕培养基质中进行28℃浅盘发酵，当1g基质中含孢子数≥1.0×108个时，收集分生孢子粉并配制哈茨木霉的菌粉；所述哈茨木霉的菌粉按质量分数包括10％-15％的分生孢子粉，5％的羧甲基纤维素钠，5％的拉开粉，其余为硅藻土；
步骤2.将多粘类芽孢杆菌和荧光假单胞菌分别接种于LB液体培养基中，于30℃摇床培养3天，得到种子液；再将两种菌的种子液分别接种于新的LB液体培养基中，在发酵罐中进行扩大培养，当1mL发酵液中的活菌数≥2.0×108个时，离心收集菌体，于50℃烘干制得多粘类芽孢杆菌和荧光假单胞菌的菌粉；
步骤3.将多粘类芽孢杆菌、哈茨木霉和荧光假单胞菌的菌粉按照1:2:1的质量比混合。
在本发明的一些实施例中，所述步骤1中，将哈茨木霉接种于PDA固体培养基中，于28℃培养8天后制备孢子悬液；将孢子悬液拌于无菌的麦麸豆粕培养基质中28℃浅盘发酵8天后收集分生孢子粉。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2中，将种子液在发酵罐中扩大培养7天后，收集培养液，于8000rpm离心5-10min收集菌体并制备菌粉。
在本发明的一些实施例中，将制备的微生物复合菌剂置于阴凉干燥处以利于长期保存。
所述茄科植物包括粮食和蔬菜作物、经济植物、药用植物和观赏植物。其中，粮食和蔬菜作物包括马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、茄子(Solanum melongena)、辣椒(Capsicum annuum)等；经济作物包括烟草(Nicotianatabacum)等；药用植物包括枸杞(Lycium barbarum)、颠茄(Atropa belladonna)等；观赏植物包括碧冬茄(Petunia hybrida)等。
本发明还提供一种防治茄科植物黑胫病和青枯病的方法，其特征在于，将任一所述的微生物复合菌剂兑水后浇灌植物根部。
在本发明的一些实施例中，所述方法包括如下步骤：
(1)栽种植物后，将所述微生物复合菌剂按照1:1000-2000的质量比兑水制成菌悬液，对植物根部进行第一次浇灌；
(2)于第一次浇灌后第二周和/或第四周，再次配制所述菌悬液并浇灌植物根部。
在本发明的一些实施例中，所述菌悬液的单次用量为每个植株100-200mL。
本发明提供的方法中，所述茄科植物包括但不限于烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopersicon esculentum)和茄子(Solanum melongena)。
本发明还提供任一所述的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括分别制备多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的菌粉，然后按比例混合。
在本发明的一些实施例中，所述多粘类芽孢杆菌和所述荧光假单胞菌的发酵制备方法包括：配制LB液体培养基→灭菌→冷却→接种→摇床200-300rpm 30℃发酵3天→种子液接种于发酵罐扩大培养→发酵液离心收集菌体→50℃干燥→粉剂；所述哈茨木霉的发酵制备方法包括：配制PDA固体培养基→灭菌→冷却→接种→培养箱28℃发酵8天→孢子悬液于麦麸豆粕培养基质浅盘发酵→50℃干燥→粉剂。
本发明还提供任一所述的微生物复合菌剂的使用方法，其特征在于，将所述微生物复合菌剂按照1:1000-2000的质量比兑水制成菌悬液，浇灌植物根部。
根据实际需要，可以在植物栽种前或栽种后，使用所述微生物复合菌剂的菌悬液浇灌植物根部。在本发明的一些实施例中，在植物栽培后需要浇水时，均使用所述微生物复合菌剂的菌悬液浇灌植物根部，以增加活性微生物在植物根部的定殖数量。在本发明的另一些实施例中，在植物栽种后，根据病害情况，间隔一定时间(例如1周、2周、3周、4周或更长的时间)使用所述微生物复合菌剂的菌悬液浇灌植物根部，例如，分别于植物栽种时、栽种后两周、栽种后四周使用所述微生物复合菌剂的菌悬液浇灌植物根部。在本发明的一些实施例中，在作物栽培时，按正常方法栽培植物小苗，将所述微生物复合菌剂按1:2000的质量比兑水后灌于植物根部，菌剂单次用量为100-200mL/株；根据病害情况，可以在第二周、第四周后补充施加菌剂。
本发明将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)进行复配后，不仅改善了单一生防菌株在环境中适应性不足的缺点，还能在植物根部繁殖形成有益的微生物优势菌群，改善土壤微生态环境，提高植物抗病能力。田间试验证明，将多粘类芽孢杆菌、哈茨木霉、荧光假单胞菌的菌粉按一定比例混合施用后，大大提高了茄科植物对黑胫病和青枯病的防治效果，并且对植物有明显的促生作用，能够增强植物抵抗病原菌及其他病虫害的能力。
附图说明
图1为烟草黑胫病/青枯病的防效试验结果；图中的复合菌剂由多粘类芽孢杆菌、哈茨木霉、荧光假单胞菌的菌粉按照1:2:1的质量比混合而成。
图2为番茄青枯病的防效试验结果；图中的复合菌剂由多粘类芽孢杆菌、哈茨木霉、荧光假单胞菌的菌粉按照1:2:1的质量比混合而成。
图3为茄子青枯病的防效试验结果；图中的复合菌剂由多粘类芽孢杆菌、哈茨木霉、荧光假单胞菌的菌粉按照1:2:1的质量比混合而成。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中使用的微生物材料：
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，购自北京北纳创联生物技术研究院，菌株编号为BNCC212056。
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，由云南省作物病害生物防控技术研究中心赠予，菌株编号为RJ17。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，购自北京北纳创联生物技术研究院，菌株编号为BNCC231887。
上述微生物材料本单位实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于必要的验证实验。
以下实施例中使用的供试植物：
烟草(Nicotiana tabacum)，品种为红花大金元，由云南省烟草公司昆明市公司提供。
番茄(Lycopersicon esculentum)，品种为云番68号，由云南省农业科学院提供。
茄子(Solanum melongena)，品种为云茄9号，由云南省农业科学院提供。
以下实施例中使用的培养基：
LB培养基的配方：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH 7.4。若配制固体培养基，则加入琼脂15g/L。121℃高压蒸汽灭菌20min。
PDA琼脂培养基的配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1L，自然pH。配制步骤：先将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，加热，加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，加入葡萄糖20g，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1L。115℃灭菌20min。
麦麸豆粕培养基质：将粉碎的麦麸和豆粕粉按1:1的质量比混合均匀，121℃高温灭菌25min，初始含水量为60％-80％。
以下实施例中使用的羧甲基纤维素钠(CMC)、拉开粉、硅藻土均可商购获得，规格为工业级即可。
若未特别说明，以下实施例中所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例中所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
实施例1.微生物复合菌剂的制备与筛选
1.菌粉的制备
按照如下方法分别制备多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的菌粉：
配制LB液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基冷却至室温后接菌，然后置于30℃、200-300rpm的摇床中培养3天，得到种子液。将种子液按照1:200的体积比接种于新的无菌LB液体培养基中，在发酵罐中进行扩大培养，温度为30℃，搅拌速度为160r/min。发酵7天后，检测1mL发酵液中的活菌数≥2.0×108个，收集发酵液，于8000rpm离心5-10min收集菌体，于50℃干燥得菌粉。
按照如下方法制备哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的菌粉：
配制PDA琼脂培养基，115℃高压蒸汽灭菌20min，在超净工作台中倒入无菌培养皿中，待培养基冷却和凝固后接种哈茨木霉，然后置于28℃培养箱中培养8天。待孢子长满平板，用无菌涂布棒和无菌水刮洗平板，制成孢子悬液。将孢子悬液拌于灭菌的麦麸豆粕培养基质中进行浅盘发酵，28℃培养8天后开始检测，当1g基质中含孢子数≥1.0×108个时，得到分生孢子粉。将分生孢子粉与羧甲基纤维素钠(CMC)、拉开粉、硅藻土混合均匀，制成哈茨木霉的菌粉。所述哈茨木霉的菌粉按质量分数包括10％-15％的分生孢子粉，5％的羧甲基纤维素钠(分散剂)，5％的拉开粉(湿润剂)，其余为硅藻土(载体)。
2.复合菌剂的配制
按照如下质量比混合多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的菌粉，制成微生物复合菌剂：
复合菌剂A
多粘类芽孢杆菌：哈茨木霉：荧光假单胞菌＝1:1:1
复合菌剂B
多粘类芽孢杆菌：哈茨木霉：荧光假单胞菌＝1:2:1
复合菌剂C
多粘类芽孢杆菌：哈茨木霉：荧光假单胞菌＝1:3:1
复合菌剂D
多粘类芽孢杆菌：哈茨木霉：荧光假单胞菌＝1:2:2
将配制好的微生物复合菌剂置于阴凉干燥处，备用。
微生物复合菌剂的用法：
A、在植物栽培时，按正常方法栽培植物小苗，将复合菌剂按1:1000-2000的质量比兑水制成菌悬液，然后灌于植物根部，单次用量为100-200mL/株。
B、根据病害情况，可以在第二周、第四周补充施加微生物复合菌剂。
实施例2.微生物复合菌剂对茄科植物黑胫病/青枯病的防效检验
1.菌悬液的配制
使用实施例1中制备的菌粉和复合菌剂，按照如下方法配制各种菌悬液，用于烟草黑胫病/青枯病、番茄青枯病和茄子青枯病的田间防效试验。菌悬液现配现用。
多粘类芽孢杆菌悬浮液：称取多粘类芽孢杆菌的菌粉，加入2000倍重量的清水，混匀。
哈茨木霉悬浮液：称取哈茨木霉的菌粉，加入2000倍重量的清水，混匀。
荧光假单胞菌悬浮液：称取荧光假单胞菌的菌粉，加入2000倍重量的清水，混匀。
复合菌剂A悬浮液：称取复合菌剂A，加入2000倍重量的清水，混匀。
复合菌剂B悬浮液：称取复合菌剂B，加入2000倍重量的清水，混匀。
复合菌剂C悬浮液：称取复合菌剂C，加入2000倍重量的清水，混匀。
复合菌剂D悬浮液：称取复合菌剂D，加入2000倍重量的清水，混匀。
2.烟草黑胫病/青枯病的防效试验
选取往年黑胫病和青枯病发病的烟田(位于云南省昆明市禄劝县)作为试验地，按常规要求整理好烟田土壤。供试烟草(Nicotiana tabacum)品种为红花大金元。设置8种处理，处理液分别是：清水、多粘类芽孢杆菌悬浮液、哈茨木霉悬浮液、荧光假单胞菌悬浮液、复合菌剂A悬浮液、复合菌剂B悬浮液、复合菌剂C悬浮液、复合菌剂D悬浮液，完全随机区组设计，三重复。选取健壮、整齐、五叶期的烟苗进行栽培，栽培的株距为50cm、左右间距为110cm、窝深为20cm。在每个烟苗栽培的穴内，按照常规烟苗栽培规范进行管理，将处理液浇灌于烟草植株的根部，浇灌量为每次200ml/株。每隔14天做一次浇灌处理，总共浇灌三次，增加活性微生物在土壤中的定殖数量。2个月后记录和统计烟草植株的生长情况以及烟草黑胫病/青枯病的发病率。
烟草黑胫病的诊断标准为：烟株茎基部发黑，茎秆内部病征呈碟片状，植株发病表现出发黄萎焉。烟草青枯病的诊断标准为：烟株茎秆半边呈现连续黑斑点症状，茎秆内部呈粘稠状发臭胶状物，植株发病表现出发黄萎焉。
统计结果如表1所示，与清水对照相比，单一菌剂和复合菌剂都促进了烟草植株的生长并降低了黑胫病/青枯病的发病率。尤其是复合菌剂，将烟草黑胫病/青枯病的发病率降低至4.7％。图1是清水对照组、各单一菌剂处理组和复合菌剂处理组的烟草黑胫病/青枯病发病率对比图，其中的复合菌剂是指复合菌剂B。
表1不同处理下烟草植株的生长情况和发病情况
处理
株高(cm)
茎围(cm)
叶长(cm)
叶宽(cm)
发病率(％)
清水
83.5
7.2
63.4
18.9
48.3
多粘类芽孢杆菌
85.3
7.3
64.7
19.2
24.7
哈茨木霉
89.2
7.7
68.4
20.1
19.3
荧光假单胞菌
86.5
7.2
66.6
19.4
28.3
复合菌剂A
87.7
7.7
68.6
20.2
8.6
复合菌剂B
90.5
7.8
70.5
20.4
4.7
复合菌剂C
89.9
7.6
69.9
20.3
5.1
复合菌剂D
90.4
7.8
70.4
20.2
4.9
3.番茄青枯病的防效试验
选取往年番茄青枯病发病严重的大棚地块(位于云南省玉溪市峨山县)作为试验地，按常规要求整理好大棚土壤。供试番茄(Lycopersicon esculentum)品种为云番68号。设置8种处理，处理液分别是：清水、多粘类芽孢杆菌悬浮液、哈茨木霉悬浮液、荧光假单胞菌悬浮液、复合菌剂A悬浮液、复合菌剂B悬浮液、复合菌剂C悬浮液、复合菌剂D悬浮液，完全随机区组设计，三重复。选取健壮的番茄苗进行栽培，栽培的株距为40cm、左右间距为70cm、窝深为20cm。在每个番茄苗栽培的穴内，按照常规番茄栽培规范进行管理，将处理液浇灌于番茄植株根部，浇灌量为每次200ml/株。每隔14天做一次浇灌处理，总共浇灌三次，增加活性微生物在土壤中的定殖数量。2个月后记录和统计番茄植株的生长情况及番茄青枯病的发病率。
番茄青枯病的诊断标准为：叶片表现为，初始顶部新叶萎蔫下垂，后下部叶片发展产生凋萎，接下来才是中部叶片产生凋萎；发病后叶片色泽较淡，呈青枯状。发病初始植株叶片白天出现萎蔫，傍晚以后恢复正常，后很快扩展至整株菱蔫，并不再恢复而死亡。
统计结果如表2所示，与清水对照相比，单一菌剂和复合菌剂都促进了番茄植株的生长并降低了番茄青枯病的发病率。尤其是复合菌剂，将番茄青枯病的发病率降低至8.9％。图2是清水对照组、各单一菌剂处理组和复合菌剂处理组的番茄青枯病发病率对比图，其中的复合菌剂是指复合菌剂B。
表2不同处理下番茄植株的生长情况和发病情况
处理
株高(cm)
茎围(cm)
发病率(％)
清水
65.8
4.5
63.3
多粘类芽孢杆菌
71.9
4.6
31.0
哈茨木霉
73.1
4.9
26.7
荧光假单胞菌
72.4
4.8
36.0
复合菌剂A
75.0
4.8
11.2
复合菌剂B
76.2
4.9
9.3
复合菌剂C
75.1
4.7
10.2
复合菌剂D
76.5
4.9
8.9
4.茄子青枯病的防效试验
选取往年茄子青枯病发病严重的大棚地块(位于云南省玉溪市峨山县)作为试验地，按常规要求整理好大棚土壤。供试茄子(Solanum melongena)品种为云茄9号。设置8种处理，处理液分别是：清水、多粘类芽孢杆菌悬浮液、哈茨木霉悬浮液、荧光假单胞菌悬浮液、复合菌剂A悬浮液、复合菌剂B悬浮液、复合菌剂C悬浮液、复合菌剂D悬浮液，完全随机区组设计，三重复。选取健壮的茄子幼苗进行栽培，栽培的株距为40cm、左右间距为80cm、窝深为20cm。在每个茄子幼苗栽培的穴内，按照常规茄子栽培规范进行管理，将处理液浇灌于茄子植株根部，浇灌量为每次200ml/株。每隔14天做一次浇灌处理，总共浇灌三次，增加活性微生物在土壤中的定殖数量。2个月后记录和统计茄子植株的生长情况及茄子青枯病的发病率。
茄子青枯病的诊断标准为：主要在结果期发病，发病初期个别枝上一片或几片叶变淡，呈现局部委垂，后扩展到全株，早晚可恢复，很快植株呈青枯状凋萎。后期病叶变褐枯焦，剖开病茎基部可见木质部变褐。
统计结果如表3所示，与清水对照相比，单一菌剂和复合菌剂都促进了茄子植株的生长并降低了茄子青枯病的发病率。尤其是复合菌剂，将茄子青枯病的发病率降低至7.3％。图3是清水对照组、各单一菌剂处理组和复合菌剂处理组的茄子青枯病发病率对比图，其中的复合菌剂是指复合菌剂B。
表3不同处理下茄子植株的生长情况和发病情况
处理
株高(cm)
茎围(cm)
发病率(％)
清水
62.5
5.4
46.7
多粘类芽孢杆菌
63.8
5.4
17.0
哈茨木霉
67.2
5.7
19.7
荧光假单胞菌
66.5
5.6
23.0
复合菌剂A
68.9
5.7
11.2
复合菌剂B
69.7
5.8
7.3
复合菌剂C
68.6
5.7
8.9
复合菌剂D
68.9
5.8
7.7
从烟草、番茄和茄子的田间防效试验中可以发现，在目标病害黑胫病或青枯病发病严重的地块，在不施用微生物菌剂防治病害的情况下发病率高达40％以上。与施用单一微生物菌剂(多粘类芽孢杆菌、哈茨木霉或荧光假单胞菌)相比，施用本发明的复合菌剂能够大大降低这些作物黑胫病或青枯病的发病率，将发病率降低至10％以下，病害防治效果显著。
以上所述的仅是本发明的具体实施例，方案中公知的具体特性等常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
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