阅读说明：本技术 新型偶氮苯衍生物、其制备方法及其在与电离辐射联合的治疗性治疗中的用途 (Azobenzene derivatives, preparation method and use thereof in therapeutic treatment in combination with ionizing radiation ) 是由 纪尧姆·博尔特 帕特里克·库夫勒尔 西蒙娜·米拉 弗雷德里克·普祖莱 于 2020-02-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及通过电离辐射可活化的新型衍生物、其制备方法及治疗用途。(The present invention relates to novel derivatives activatable by ionising radiation, to a process for their preparation and to their therapeutic use.)

具体实施方式

实施例

I.分析色谱法

方法A

在1565二元HPLC泵(Waters)、PAD2998读数器(Waters)以及Agilent EclipseXDB-C18反相柱(长度：250mm，直径：4.6mm，固定相：5μm)上，使用0.05％水-TFA/0.05％乙腈-TFA梯度体系；0'(98/2)、5'(98/2)、25'(0/100)、27'(0/100)、29'(98/2)、35'(98/2)，流速为1mL.min^-1(注射30μL)进行HPLC(高效液相色谱)分析，在Empower上进行数据处理。

方法B

在配有Xbridge C18反相柱(长度：150mm，直径：2.1mm，固定相：3.5μm)的Alliance2695系统(Waters)上，使用0.1％水-FA/乙腈梯度体系；0'(95/5)、20'(0/100)，流速为0.25mL.min^-1(注射10μL)进行LCMS(液相色谱质谱)分析。质量分析器是TOF LCT Premier(Waters)。毛细管电压为2.8kV。锥孔电压为35V。源温度为120℃，去溶剂化温度为280℃。在MassLynx上进行数据处理。

方法C

在与515HPLC泵(Waters)、PAD 2996读数器(Waters)以及Xbridge C18反相柱(长度：100mm，直径：3.0mm，固定相：3.5μm)偶联的2525二元HPLC泵(Waters)上，使用0.05％水-TFA/乙腈等度体系，流速为0.75mL.min^-1(注入10μL)进行HPLC分析。检测波长对应于所用流动相中研究的化合物的等吸收点。在MassLynx上进行数据处理。

II.总结

概括

所有试剂均以最高纯度购自Sigma-Aldrich或Alfa Aesar，无需进一步纯化即可使用。DOTAGA酐购自CheMatech，无需进一步纯化即可使用。用于快速色谱的硅胶(Aldrich717185Si 60,40-63μm)购自VWR。RP-18反相快速色谱在CombiFlash仪器(Biotage)上进行。使用涂有60F254硅胶的铝箔进行薄层色谱法(通过254nm紫外灯或茚三酮检测)。¹H、¹³C和¹⁹FNMR谱是在Bruker 300MHz或400MHz光谱仪上在环境温度下获得的。化学位移δ以ppm为单位，使用溶剂作为参考。耦合常数J以赫兹为单位测量。耦合分布由缩写d(双峰)、t(三重峰)和m(多重峰)描述。除非另有说明，否则使用配有TOF-LCT Premier质谱仪的飞行时间质量分析仪(Waters)，在3/7H₂O/甲醇混合物中通过电喷雾电离在正模式下进行高分辨率质谱(HRMS)实验。分析色谱方法(HPLC和LCMS)在专门的段落中进行了描述。合成中间体的纯度通过¹H NMR或反相HPLC确定。最终产物的纯度通过反相HPLC测定并确认为>95％。

根据以下合成方案合成了以下化合物：

[化学式17]

其中X＝H或F，

其中M＝Cu、Ga、Y、In、Eu、Gd、Yb或Bi，

其中n＝2或3，

[化学式18]

4-羟基-4'-丁氧基偶氮苯的合成(1)

将4-丁氧基苯胺(2.00mL,12.0mmol)和亚硝酸钠(0.854g,12.0mmol,1.0当量)溶解在1:1EtOH/H₂O混合物(24mL)中，并将介质冷却至0℃。在小心加入cc HCl(2.6mL)之前，将冰(12g)加入培养基中。将冷却至0℃的预先制备的苯酚(1.14g，12.0mmol，1.0当量)和NaOH(0.960g，24.0mmol，2.0当量)的水溶液(6.3mL)小心地引入到0℃的介质中。将介质在0℃下搅拌20分钟，然后在环境温度(AT)下搅拌70分钟。将pH值调节至1(cc HCl)后，在过滤前将介质在环境温度下静置30分钟。用水(4ⅹ50mL)洗涤沉淀物，溶解在DCM中，有机相用MgSO₄干燥，然后浓缩。4-羟基-4'-丁氧基偶氮苯1(2.76g,10.2mmol,85％)被分离为黑色无定形粉末。

¹H NMR(400MHz；CDCl₃)δ(ppm):7.87(d；J＝8.9Hz；2H)；7.82(d；J＝8.8Hz；2H)；6.98(d；J＝8.9Hz；2H)；6.91(d；J＝8.8Hz；2H)；4.03(t；J＝6.5Hz；2H)；1.85-1.75(m；2H)；1.58-1.45(m；2H)；0.99(t；J＝7.4Hz；3H)。

¹³C NMR(75MHz；CDCl₃)δ(ppm):161.51；158.38；146.89；146.63；124.81；124.56；116.07；114.92；68.22；31.35；19.33；13.96。

HRMS(m/z):C₁₆H₁₉N₂O₂计算为271.1447([M+H]⁺)。实际为271.1440。

R_f＝0.36(二氧化硅；DCM；UV)。

4-(N-(叔丁氧基羰基)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯的合成(2)

将4-羟基-4'-丁氧基偶氮苯1(2.00g,7.40mmol)和K₂CO₃(1.53g,11.1mmol,1.5当量)溶解在丙酮(25mL)中。在AT和氩气下搅拌30分钟后，将2-(Boc-氨基)乙基溴(4.98g,22.2mmol,3.0当量)引入介质中。回流搅拌18小时后，趁热滤出介质，用热丙酮(75mL)洗涤沉淀物。过滤前将滤液在AT下静置30分钟，所得沉淀物1用冷丙酮洗涤。过滤前将滤液在0℃下静置3小时。用冷丙酮洗涤所得沉淀物2并加入沉淀物1。将滤液浓缩并通过硅胶快速色谱法(DCM)纯化。4-(N-(叔丁氧基羰基)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯2(2.27g，5.49mmol，74％)被分离为黄色无定形粉末(沉淀57％，快速色谱17％)。

¹H NMR(400MHz；CDCl₃)δ(ppm):7.86(2d；J＝8.9Hz；4H)；6.99(2d；J＝8.9Hz；4H)；4.10(t；J＝5.0Hz；2H)；4.04(t；J＝6.5Hz；2H)；3.57(m；2H)；1.87-1.74(m；2H)；1.64-1.40(m；11H)；1.00(t；J＝7.4Hz；3H)。

¹³C NMR(100MHz；CDCl₃)δ(ppm):161.46；160.62；156.03；147.51；147.07；124.52；124.48；114.84；114.82；79.79；68.18；67.64；40.27；31.42；28.55；19.38；13.98。

HRMS(m/z):C₂₃H₃₂N₃O₄计算为414.2393([M+H]⁺)。实际为414.2396。

R_f＝0.90(二氧化硅；DCM/甲醇98:2；UV)。

4-氨基乙氧基-4'-丁氧基偶氮苯的合成(3)

将4-(N-(叔丁氧基羰基)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯2(1.26g,3.04mmol)溶解在4:1DCM/TFA混合物(63mL)中，将介质在AT搅拌1.5小时。浓缩后，加入乙醚(250mL)，形成的沉淀物凝固1小时，然后过滤并用乙醚(4ⅹ50mL)洗涤。4-氨基乙氧基-4'-丁氧基偶氮苯3(1.25g,2.93mmol,96％,TFA盐)被分离为黄色无定形粉末。

¹H NMR(400MHz；MeOD)δ(ppm):7.88(d；J＝8.9Hz；2H)；7.85(d；J＝8.9Hz；2H)；7.15(d；J＝8.9Hz；2H)；7.04(d；J＝8.9Hz；2H)；4.32(t；J＝4.4Hz；2H)；4.06(t；J＝6.4Hz；2H)；3.41(t；J＝4.4Hz；2H)；1.86-1.73(m；2H)；1.60-1.46(m；2H)；1.00(t；J＝7.4Hz；3H)。

¹³C NMR(75MHz；MeOD)δ(ppm):163.03；161.34；148.97；148.10；125.42；125.30；115.99；115.80；69.12；65.59；40.24；32.43；20.28；14.16。

HRMS(m/z):C₁₈H₂₄N₃O₂计算为314.1869([M+H]⁺)。实际为314.1864。

HPLC(方法A)；t_R 17.92分钟(顺式)-20.35分钟(反式)。

R_f＝0.70(二氧化硅；DCM/甲醇95:5；UV或茚三酮)。

4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(Azo)的合成

将4-氨基乙氧基-4'-丁氧基偶氮苯3(259mg,0.606mmol,TFA盐)溶解在无水DMF(4.3mL)中。引入三乙胺(253μL,1.81mmol,3.0当量)后，将介质在AT氩气下搅拌5分钟。然后引入DOTAGA酸酐(278mg,0.606mmol,1.0当量)，并将介质在70℃下在氩气下搅拌21小时。浓缩后，加入乙醚(100mL)，形成的沉淀物凝固30分钟，然后过滤并用乙醚(2ⅹ50mL)洗涤。通过反相快速色谱法(RP-18，Biotage，梯度H₂O0.05％FA/CH₃CN0.05％FA1:0-2:8)纯化粗产物。4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰基)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯Azo(294mg,0.381mmol,63％)通过冷冻干燥以黄色静电粉末的形式分离。

HRMS(m/z):C₃₇H₅₄N₇O₁₁计算为772.3881([M+H]⁺)。实际为772.3883。

LCMS(方法B)；t_R 12.357分钟(顺式)-14.437分钟(反式)。

2,6-二氟-4-羟基-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯的合成(4)

将2.6-二氟-4-丁氧基苯胺(2.20g,10.9mmol)和亚硝酸钠(0.755g,10.9mmol,1.0当量)溶解在1:1EtOH/H₂O混合物(22mL)中，并将介质冷却至0℃。在小心加入cc HCl(2.37mL)之前，将冰(11g)加入培养基中。将预先制备的3,5-二氟苯酚(1.42g，10.9mmol，1.0当量)和NaOH(0.876g，21.9mmol，2.0当量)的水溶液(5.7mL)冷却至0℃，在0℃下小心地将其引入培养基中。将介质在0℃下搅拌20分钟，然后在AT下搅拌70分钟。将pH值调节至1(cc HCl)后，在过滤前将介质在AT下静置30分钟。沉淀物用水(4ⅹ50mL)洗涤，溶解在DCM中，有机相用MgSO₄干燥，然后浓缩。残余物(黑色粘稠液体)在真空歧管(3.15g)下浓缩，无需进一步纯化即可用于下一步。

¹H NMR(400MHz；DMSO)δ(ppm):6.93(d；JH-F＝11.4Hz；2H)；6.64(d；JH-F＝11.4Hz；2H)；4.09(t；J＝6.5Hz；2H)；1.77-1.66(m；2H)；1.49-1.38(m；2H)；0.94(t；J＝7.4Hz；3H)。

¹³C NMR(101MHz；DMSO)δ(ppm):161.40(t；J_C-F＝14.8Hz)；161.11(t；J_C-F＝14.8Hz)；157.69(dd；J_C-F＝39.1；7.7Hz)；155.13(dd；J_C-F＝38.2；7.8Hz)；125.00(t；J_C-F＝10.2Hz)124.05(t；J_C-F＝10.3Hz)；100.26(dd；J_C-F＝22.6；2.0Hz)；99.68(dd；J_C-F＝24.2；2.1Hz)；68.74(s)；30.31(s)；18.55(s)；13.58(s)。

¹⁹F NMR(376MHz；DMSO；解耦)δ(ppm):-118.99；-119.27。

¹⁹F NMR(376MHz；DMSO)δ(ppm):-118.99(d；J_F-H＝12.1Hz)；-119.27(d；J_F-H＝12.0Hz)。

HRMS(m/z):C₁₆H₁₅F₄N₂O₂计算为343.1070([M+H]⁺)。实际为343.1060。

R_f＝0.20(二氧化硅；环己烷/乙酸乙酯9:1；UV)。

2,6-二氟-4-(N-(叔丁氧基羰基)-乙氧基胺)-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯的合成(5)

将2,6-二氟-4-羟基-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯4(2.18g粗制，考虑为6.37mmol)和K₂CO₃(1.32g，9.57mmol，1.5当量)溶解在丙酮(22mL)中。在AT和氩气下搅拌30分钟后，将2-(Boc-氨基)乙基溴(4.29g，19.1mmol，3.0当量)引入介质中。回流搅拌18小时后，将介质浓缩并通过硅胶快速色谱纯化(环己烷/乙酸乙酯，梯度1/0-7/3)。2,6-二氟-4-(N-(叔丁氧基羰基)-乙氧基胺)-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯5(624mg,1.28mmol,17％分2个步骤)被分离为无定形黄色粉末。

¹H NMR(400MHz；DMSO)δ(ppm):7.04(s；1H)；6.95(d；JH-F＝11.8Hz；4H)；4.10(m；4H)；3.34-3.26(m；2H)；1.75-1.67(m；2H)；1.49-1.39(m；2H)；1.38(s；9H)；0.94(t；J＝7.4Hz；3H)。

¹³C NMR(101MHz；DMSO)δ(ppm):161.53(t；J_c-F＝14.3Hz)；161.16(t；J_c-F＝14.2Hz)；157.59(t；J_c-F＝7.9Hz)；155.64(s)；155.03(t；J_c-F＝7.7Hz)；125.09(t；J_c-F＝8.3Hz)；124.90(t；J_c-F＝8.3Hz)；99.90(dd；J_c-F＝11.3；1.7Hz)；99.67(dd；J_c-F＝11.3；1.7Hz)；77.86(s)；68.80(s)；67.87(s)；38.71(s)；30.29(s)；28.17(s)；18.53(s)；13.57(s)。

¹⁹F NMR(376MHz；DMSO；解耦)δ(ppm):-118.79；-118.85。

¹⁹F NMR(376MHz；DMSO)δ(ppm):-118.79(d；J_F-H＝12.0Hz)；-118.85(d；J_F-H＝11.9Hz)。

HRMS(m/z):C₂₃H₂₈F₄N₃O₄计算为486.2016([M+H]⁺)。实际为486.2015。

R_f＝0.30(二氧化硅；环己烷/乙酸乙酯8:2；UV)。

2,6-二氟-4-氨基乙氧基-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯的合成(6)

将2,6-二氟-4-(N-(叔丁氧基羰基)-乙氧基胺)-2,6-二氟-4'-丁氧基偶氮苯5(879mg,1.81mmol)溶解在4:1DCM/TFA混合物中(37mL)，并将介质在AT搅拌1.5小时。浓缩后，加入乙醚(200mL)，形成的沉淀物1凝结1小时，然后过滤并用乙醚(4ⅹ100mL)洗涤。浓缩滤液并在正己烷(200mL)中形成粘性沉淀物2，过滤并用正己烷(3ⅹ200mL)洗涤。沉淀物1和2在真空歧管下干燥。2,6-二氟-4-氨基乙氧基-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯6(858mg，1.72mmol，95％，TFA盐)被分离为无定形黄色粉末(沉淀物1，70％)和黄色油(沉淀2，25％)。

¹H NMR(400MHz；DMSO)δ(ppm):7.98(s；3H)；7.00(d；J_H-F＝11.3Hz；2H)；6.96(d；J_H-F＝11.8Hz；2H)；4.30(t；J＝5.0Hz；2H)；4.11(t；J＝6.5Hz；2H)；3.26(t；J＝5.0Hz；2H)；1.80-1.63(m；2H)；1.53-1.33(m；2H)；0.94(t；J＝7.4Hz；3H)。

¹³C NMR(101MHz；DMSO)δ(ppm):161.76(t；J_C-F＝14.4Hz)；160.27(t；J_C-F＝14.0Hz)；157.57(dd；J_C-F＝25.8；7.6Hz)；155.00(dd；J_C-F＝25.9；7.4Hz)；125.57(s)；124.86(s)；100.07(dd；J_C-F＝24.7；2.7Hz)；99.80(dd；J_C-F＝24.7；2.5Hz)；68.85(s)；65.82(s)；38.06(s)；30.29(s)；18.54(s)；13.57(s)。

¹⁹F NMR(376MHz；DMSO；解耦)δ(ppm):-73.46；-118.60；-118.74。

¹⁹F NMR(376MHz；DMSO)δ(ppm):-73.46(s)；-118.60(d；J_F-H＝11.9Hz)；-118.73(d；J_F-H＝11.8Hz)。

HRMS(m/z):C₁₈H₂₀F₄N₃O₂计算为386.1492([M+H]⁺)。实际为386.1491。

R_f＝0.33(二氧化硅；DCM/甲醇95:5；UV或茚三酮)。

2,6-二氟-4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯(FAzo)的合成

将2,6-二氟-4-氨基乙氧基-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯6(267mg，0.535mmol，TFA盐)溶解在无水DMF(3.8mL)中。引入三乙胺(223μL,1.60mmol,3.0当量)后，将介质在氩气下于AT下搅拌5分钟。然后引入DOTAGA酸酐(245mg，0.533mmol，1.0当量)并将介质在70℃下在氩气下搅拌21小时。浓缩后，加入乙醚(100mL)，形成的沉淀物凝固30分钟，然后过滤并用乙醚(2ⅹ50mL)洗涤。通过反相快速色谱法(RP-18，Biotage，梯度H₂O 0.05％FA/CH₃CN0.05％FA 1:0-2:8)纯化粗产物。2.6-二氟-4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-2,6-二氟-4'-丁氧基偶氮苯FAzo(92.1mg,0.109mmol,20％)通过冷冻干燥以黄色静电粉末的形式分离。

HRMS(m/z):C₃₇H₅₀F₄N₇O₁₁计算为844.3504([M+H]⁺)。实际为844.3495。

LCMS(方法B)；t_R 14.107分钟(顺式)-14.894分钟(反式)。

Azo和FAzo络合的通用方案

Azo或FAzo和金属试剂溶解在H₂O(26mM)中。将pH调至5.5后，将介质在50℃下搅拌17小时，确保pH值保持在5.5-6.0范围内。然后在通过冷冻干燥浓缩介质和反相快速色谱纯化(RP-18，Biotage，梯度H₂O/CH₃CN1:0-0:1)之前将pH值调节至6.5。通过冷冻干燥将最终产物以静电粉末的形式分离。

[表1]

*：250mM在6N HCl中。

表1.络合反应的实验条件。

铜4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(CuAzo)

HRMS(m/z):C₃₇H₅₁N₇NaO₁₁Cu计算为855.2840([M+Na]⁺)。实际为855.2854.

LCMS(方法B)；t_R 13.550分钟(顺式)-15.934分钟(反式)。

镓4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(GaAzo)

HRMS(m/z):C₃₇H₅₁N₇O₁₁Ga计算为838.2902([M+H]⁺)。实际为838.2906。

LCMS(方法B)；t_R 12.840分钟(顺式)-15.072分钟(反式)。

钇4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(YAzo)

HRMS(m/z):C₃₇H₄₉N₇Na₂O₁₁Y计算为902.2344([M-H+2Na]⁺)。实际为902.2349。

LCMS(方法B)；t_R 15.957分钟(顺式)-19.660分钟(反式)。

铟4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(InAzo)

HRMS(m/z):C₃₇H₄₉N₇Na₂O₁₁In计算为928.2324([M-H+2Na]⁺)。实际为928.2319。

LCMS(方法B)；t_R 15.451分钟(顺式)-18.899分钟(反式)。

铕4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(EuAzo)

HRMS(m/z)(负离子模式):C₃₇H₄₉N₇O₁₁Eu计算为920.2702([M-H]^-)。实际为920.2694。

LCMS(方法B)；t_R 13.419分钟(顺式)-16.718分钟(反式)。

钆4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(GdAzo)

HRMS(m/z):C₃₇H₄₉N₇Na₂O₁₁Gd计算为971.2527([M-H+2Na]⁺)。实际为971.2529。

LCMS(方法B)；t_R 15.956分钟(顺式)-19.633分钟(反式)。

钆2,6-二氟-4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-2',6'-二氟-4'-丁氧基偶氮苯(GdFAzo)

HRMS(m/z):C₃₇H₄₅F₄N₇Na₂O₁₁Gd计算为1043.2150([M-H+2Na]⁺)。实际为1043.2158。

LCMS(方法B)；t_R 18.900分钟(顺式)-20.524分钟(反式)。

镱4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(YbAzo)

HRMS(m/z):C₃₇H₄₉N₇Na₂O₁₁Yb计算为987.2674([M-H+2Na]⁺)。实际为987.2683。

LCMS(方法B)；t_R 16.112分钟(顺式)-19.968分钟(反式)。

铋4-(N-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-戊二酰)-乙氧基胺)-4'-丁氧基偶氮苯(BiAzo)

HRMS(m/z):C₃₇H₄₉N₇Na₂O₁₁Bi计算为1022.3089([M-H+2Na]⁺)。实际为1022.3093。

LCMS(方法B)；t_R 14.235分钟(顺式)-19.055分钟(反式)。

III.电离辐射和细胞实验

概括

缓冲液培养基如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、杜氏改良伊戈尔(Dulbecco's ModifiedEagle)培养基-高葡萄糖(DMEM)、洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park MemorialInstitute)培养基(RPMI)、青霉素、链霉素和台盼蓝溶液(0.4％)购自Sigma Aldrich(法国)。胎牛血清(FBS)购自Gibco(法国)，碘化丙啶(PI)购自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific，法国)，盐酸吉西他滨(Gem)购自红杉研究产品(Sequoia ResearchProducts，英国)。

细胞系

人胰腺癌(PANC-1)和人急性成淋巴细胞白血病(CCRF-CEM)细胞购自ATCC(US)并按照供应商的建议进行维持。Gem抗性人类急性成淋巴细胞白血病细胞(CCRF-CEM ARAC8C，hENT-1受体未表达)由Buddy Ullmann博士(俄勒冈健康科学大学(Oregon HealthSciences University))友情提供。简而言之，将PANC-1细胞维持在补充有10％(v/v)热灭活FBS的DMEM缓冲液中。CCRF-CEM和CCRF-CEM ARAC-8C细胞维持在补充有10％(v/v)热灭活FBS的RPMI缓冲液中。所有细胞培养基都补充有青霉素(50U.mL^-1)和链霉素(0.05mg.mL^-1)。将细胞维持在37℃和5％CO₂的潮湿气氛中。在达到第十八代之前使用细胞并在70-80％汇合时收获。

电离辐射源

UV照射。在配备两个15W管(365nm)的CN-15.LC室(Vilber Lourmat)中进行UV照射以诱导反式异构体异构化为顺式异构体，其在辐射位置提供0.817mW.cm^-2的辐射(由Cole-Parmer VLX-3W微处理器控制的辐射计确定，校准为365nm，Vilber Lourmat)。

X射线照射。使用X射线发生器(Xrad 320 Dx)进行X射线照射，提供平均能量为80keV(范围0-200keV)的光子，剂量速率约为1Gy/min(200kV，20mA)。辐射剂量以灰色表示。

伽马射线照射。用铯137源(IBL637)进行伽马辐射，以约1Gy/min的剂量速率提供662keV光子。辐射剂量以灰色表示(1Gy＝1J/L)。

电子束照射。使用线性电子加速器(Linac，Kinetron)以大约4Gy/min的剂量速率以4.5MeV的能量传递电子进行电子束照射。辐射剂量以灰色表示。

通过吸收分光光度法和HPLC对电离辐射诱导的异构化进行量化(图1)

将含钆化合物(GdAzo或GdFAzo)和对照化合物(Azo或FAzo)(50μM，200μL，PBS)引入两个96孔微孔板(每种化合物10个孔)。将两个微孔板首先在紫外光下照射(365nm，0.817mW.cm^-2，5分钟)。然后将一个微孔板(板1)保持在黑暗中并用作未照射的对照，而第二块微孔板(板2)则用增加的电离辐射剂量(2Gy、3Gy、5Gy和10Gy)进行照射。每次照射后，对未照射(板1)和照射(板2)化合物进行吸光度分光光度法和HPLC注射(方法C)分析。使用板1和板2的UV照射之间的26分钟时间延迟，以便在UV照射后同时分析未照射的对照化合物(板1)与电离照射的化合物(板2)。完整的实验在4.6小时内进行。通过三次重复的平均值绘制吸收光谱。每种异构体的相对量通过HPLC(在洗脱条件下在等吸收点波长处检测)获得，分子活化(％)由介质中的反式异构体比例的差异确定(3个独立实验)。

无电离辐射的共聚焦显微镜(图2a)

实验开始前24h将细胞(PANC-1)转移至成像板(ibiTreat 8孔显微镜玻片，购自德国Ibidi)，在37℃和5％CO₂的潮湿环境下维持在培养基中(33000个细胞，200μL/孔)。在实验之前即刻，将细胞培养基替换为不含FBS和酚红的培养基(100μL)，然后将IP(5μL，终浓度为1μM)添加到培养基中。添加IP后15分钟，获取了第一组图像。然后将顺式GdAzoor、反式GdAzo化合物(100μL，终浓度0μM、250μM或500μM)引入细胞培养基中。然后将成像板保持在黑暗中，每5分钟采集一次图像，持续1小时。通过UV照射(365nm,0.817mW.cm^-2,30min)96孔微孔板中的化合物反式GdAzo(105μL,500μM或1mM,顺式GdAzo>85％)得到化合物顺式GdAzo。利用配有Fluotar CS2 10ⅹ/0.30秒HC PL物镜的Leica TCS SP8门控STED倒置显微镜(Leica，德国)观察细胞。该仪器配有白光激光器(激发波长538nm)。在560-650nm的带宽上收集红色荧光发射，并使用相同的光线和PMT-trans检测器获得透射图像。针孔设置为1.0Airy(直径73.19μm)。使用Leica SP8 LAS X软件(2.0.1版，Leica，德国)获得16位数字图像。

存在电离辐射的共聚焦显微镜(图2b-c)

在实验开始前24小时，将细胞(PANC-1)转移到成像板(Lab-Tek室载玻片系统，玻璃，8孔，购自Thermo Fisher Scientific，法国)，并在37℃和5％CO₂的潮湿环境下保持在培养基中(10,000个细胞，200μL/孔)。就在实验之前，将细胞培养基替换为PBS(100μL)，并将IP(5μL，终浓度1μM)加入培养基中。添加PI后15分钟，将顺式GdAzo(100μL，终浓度为0μM、250μM、500μM或850μM)引入细胞培养基中。在这个阶段采集了第一组图像，然后照射成像板(伽马射线，2Gy)。然后将成像板保持在37℃(板加温器)的黑暗中，每5分钟采集一次图像，持续30分钟，然后每10分钟采集一次，持续90分钟。除了成像板没有用伽马射线辐射之外，类似的程序用于未辐射的对照实验。顺式GdAzo化合物是通过UV照射(365nm，0.817mW.cm^-2，30分钟)96微孔板中的反式GdAzo化合物(105μL、500μM、1mM或1.7mM，顺式GdAzo>85％)获得的。使用ⅹ10秒物镜、N.A.0.4并配备Yokogawa CSU-X1头的尼康倒置显微镜(NikonInstruments Inc.，东京，日本)观察细胞。该仪器配备了激发波长为561nm的激光二极管。在598-672nm的带宽上收集红色荧光发射，并用白色二极管获得透射图像。针孔设置为50μm，放大透镜设置为1.2。图像由e-Volves-CMOS相机(Photometrics)记录。每孔记录四个图像，每个浓度的顺式GdAzo使用两个孔。使用ImageJ软件(带有可调分水岭插件的1.50i版)对16位数字图像进行分析。辐射前获得的图像中的细胞数量是手动确定的，辐射前后获得的图像中的荧光细胞的数量是使用ImageJ上编码的脚本自动计算的。细胞通透性是通过伽马辐射之前和之后30分钟荧光细胞比例的差异来确定的(3个独立实验)。

电离辐射下的治疗效果(图2d-f)

就在实验之前，将细胞(CCRF-CEMARAC-8C)分散在PBS中并转移到48孔微孔板(TPP细胞培养微孔板，购自Thermo Fisher Scientific，法国)(40,000个细胞，80μL/孔)中。将Gem(20μL，终浓度0.1μM)或PBS(20μL)和顺式GdAzo化合物(100μL，终浓度0μM、250μM、500μM或850μM)在培养基的伽马辐射之前立即加入(2Gy)。将培养基在黑暗和潮湿的气氛中于37℃和5％CO₂保持1小时。接下来，将培养基(600μL)添加到每个孔中，并通过三个离心循环(300G，5分钟，每次洗涤使用800μL培养基)洗涤细胞。最后将细胞分散在含有或不含Gem(终浓度为0μM或0.1μM)的培养基(600μL)中，并在37℃和5％CO₂的潮湿环境中保持4天。在存在1:1(v/v)台盼蓝(一式三份)的情况下，通过细胞计数确定活细胞的数量。实验独立重复3次。细胞活力表示为处理后的活细胞数量与未经任何处理(无辐射，不存在Gem和顺式GdAzo)的活细胞数量之比。除了未用伽马射线照射48孔板之外，类似的程序用于未照射的对照实验。除了使用代替顺式GdAzo外，类似的程序用于的对照实验(图2f)。通过紫外线照射(365nm，0.817mW.cm^-2，30min)96孔微孔板中的反式GdAzo化合物(105μL，500μM，1mM或1.7mM，顺式GdAzo>85％)获得顺式GdAzo化合物。

这些结果表明：

(i)通过使用电离辐射(X射线、伽马射线、电子)激活治疗分子的新构思(图1a-f)。由于这些辐射在活组织中具有非常高的穿透能力，因此这种新的激活构思具有强大的临床应用潜力。当下文献中描述的所有有机分子都需要使用紫外线到近红外线辐射，这种辐射不会深入穿透生物组织(在最佳条件下可以穿透数百微米)。

(ii)根据所使用的金属和辐射源，可以通过不同效率的电离辐射来激活MAzo化合物(M＝Cu、Ga、Y、In、Eu、Gd、Yb、Bi)(图1a-c，f)。GdFAzo化合物也可以通过电离辐射激活(图1c-e)。这种化合物的特点是足够缓慢的热弛豫，以考虑在体内进行研究。尽管在体外使用的实验条件下，化合物GdFAzo的活化相对较低(与化合物GdAzo相比，图1c)，但很难预测该化合物在体内的分子活化效率。

(iii)用于使得能够激活有机单元的金属类型。已经表明，金属的原子序数Z必须大于39(钇的原子序数)以允许一致的活化(在5Gy下大于30％)。事实上，含有大小大于或等于钇的金属的6种化合物显示出这种活化，而含有较小金属(Cu，Z＝29和Ga，Z＝31)的2种化合物显示出低活化(在5Gy下小于10％)(图1f)。

(iv)分子活化可以在各种类型的电离辐射(X射线、伽马射线、电子)下进行，具有不同的粒子(光子和电子)和不同的能量(从1keV到4.5MeV)(图1c)，因此，目前临床使用的一组放射治疗设备应该能有效地产生所描述的分子激活。

(v)化合物GdAzo能够在低剂量的电离辐射下诱导癌细胞膜的通透性(GdAzo在浓度分别为250μM、500μM和850μM，通过2Gy的伽马射线时，6.9％(相对于1.2％未辐射的)、8.2％(相对于2.8％未辐射的)和12.4％(相对于7.5％未辐射的))(图2a、b、c)。

(vi)在吉西他滨不存在或存在的情况下，化合物GdAzo能够在吉西他滨抗性癌细胞系(人急性成淋巴细胞白血病)中诱导毒性(图2d、e)，用2Gyγ辐射处理后在没有吉西他滨的情况下，GdAzo在浓度分别为250μM、500μM和850μM时，治疗4天后的细胞活力分别降低至23％(相对于79％未辐射的)、18％(相对于42％未辐射的)和3.0％(相对于27％未照射的)。在吉西他滨存在的情况下，GdAzo在浓度分别为250μM、500μM和850μM时，治疗4天后的细胞活力分别降低至15％(相对于49％未照射的)、9.1％(相对于30％未照射的)和1.2％(相对于16％未照射的)。该研究表明，该化合物在电离辐射下单独具有活性，并且周围活性物质的存在仅略微增强了该化合物的治疗效果(图2d、e)。

(vii)由于商业对照化合物(单独钆螯合物)在电离辐射下没有治疗效果，因此分子上偶氮苯或茋(stillbene)基序的存在是产生治疗效果所必需的(图2f)。