具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的利用乌饭树为砧木嫁接蓝莓的解决方法采用以下的步骤进行实施：

S1:选取砧木和接穗：选取健康无病的乌饭树砧木的以及蓝莓基接穗作备用；所述蓝莓基接穗为蓝莓基生枝或侧生枝；

S2：嫁接前处理：将S1选取的蓝莓基接穗放入塑料袋中，并且在常温下放置2-3天；

S3：嫁接

S3.1:嫁接口的选择

步骤S1选取的乌饭树砧木离地面高度30cm～60cm的部位作为砧木嫁接口，并在所述砧木嫁接口上部10～20cm处截去砧木顶部，形成断面；

S3.2:枝条腹接

将所述蓝莓基接穗的下端削成类楔形的的削面，并在所述乌饭树砧木的枝干平滑处将剪子与枝干呈25～40°角向下斜剪一个接口，且所述接口的大小与深度与所述削面相适配，将所述削面插入所述接口中，完成嫁接。

S4：嫁接后处理

用塑料薄膜包扎步骤S3处理后的嫁接口，之后再用塑料袋包裹嫁接口。

S5:去腋芽

待步骤S4处理后，砧木上的接芽成活后，将所述砧木上的腋芽全部掰去。

以下提供具体的实施例以及测试：

实施例1：利用乌饭树为砧木嫁接蓝莓

1材料

本发明中以生长在海拔800米以上四明山乌饭树为砧木，采用蓝莓栽培品种奥尼尔为接穗。在奉化溪口蓝莓基地进行嫁接试验。

2方法

2.1嫁接

选择春秋季进行嫁接，采用枝接方法，将蓝莓奥尼尔接穗嫁接到乌饭树砧木上，具体的嫁接方式如下：

(1)接穗选择

挑选奥尼尔蓝莓植株进入冬眠的无花芽枝条作为接穗，所述接穗的直径要求大于5mm且小于10mm，然后直接进行嫁接；

(2)嫁接时间

选择春季2月20日-3月10日和秋季10月10日-10月30日进行嫁接，采用枝接方法，将蓝莓奥尼尔接穗嫁接到乌饭树砧木上；

(3)砧木和接穗的选取

砧木选择直径大于5cm，接穗选择直径大于5mm小于40mm的带由3-4个芽的奥尼尔蓝莓基生枝或侧生枝；

(4)接穗在嫁接前的处理

接穗带有3-4个芽的奥尼尔蓝莓基生枝或侧生枝放入在塑料袋里,春季2月20日-3月10日在常温中放置2-3天；秋季10月10日-10月30日，从奥尼尔蓝莓树上剪下带有3-4个花芽，大小5mm-40mm，长度大于10cm且小于20cm的奥尼尔接穗直接嫁接到乌饭树上。

2.2转录组测序

基于Illumina技术测序平台，利用双末端测序(Paired-End)的方法，完成对蓝莓、乌饭树和蓝莓新种质(即上述嫁接后的产物)的转录组测序分析。

结果与讨论

嫁接材料的成活率分析

结果表明春天比秋天嫁接的成活率高，嫁接时间以春季2月20日-3月10日和秋天10月20日-11月10日成活率高，如表1所示

表1：嫁接时间对成活率的影响

实施例2：嫁接材料与母本的基因表达水平测试：

为了探究嫁接材料与母本材料在基因表达层面的差异，本实施例中将嫁接材料与母本材料进行转录组测序，并进行差异基因表达分析。结果显示，嫁接材料F1与乌饭树母本P1差异表达基因数量与蓝莓母本P2与乌饭树母本P1差异表达基因数量相近(45485vs46571)，且上调基因和下调基因数量也相近(分别为25828vs 25568和19657vs21003)(如图1所示)，这说明不同物种之间，基因表达模式差异较大，而同一种物种之间，基因表达模式很相近，嫁接并不能显著改变基因表达模式。但是我们也能观察到嫁接材料F1与蓝莓母本P1之间也有16146个差异表达基因(如图1A所示)，这也说明嫁接能够在一定程度改变基因的表达模式。另外，差异表达基因韦恩图结果我们可以看到(如图1B所示)，共有6577个差异表达基因在三个不同比较组中出现，这些差异表达基因可能就是使得嫁接材料出现新性状的分子基础。

实施例2也证明了通过本发明的方法进行嫁接之后，这些差异表达基因的出现，可能是因为在进行嫁接之后，接穗材料能够同粘木进行信息交流，接穗材料能够同时获得蓝莓母本和粘木母本的性状，还能够表现出新获得的性状，从而表现出更好的生长发育状态。

实施例3：嫁接材料中抗性基因测试：

病害实验显示嫁接材料F1较蓝莓亲本P2更加抗病。植物抗病反应分为两种，一种是植物组成性抗病反应，另一种是植物诱导性抗病反应。植物组成性抗病反应是植物会形成特定的组织来抵御病虫害的侵害，比如角质和蜡质能够阻止病虫害的侵害。在拟南芥中，当遭遇伤害胁迫时，叶片表面会释放角质和蜡质，从而达到修复伤害的目的。在我们的转录组差异表达基因数据中，我们发现嫁接材料F1较蓝莓亲本P2角质和蜡质合成基因CYP86和CER1上调表达(如图2A所示)。另外，我们发现CYP86和CER1基因在蓝莓亲本P2中较乌饭树亲本P1要上调表达(如图2A所示)，这说明嫁接材料F1中CYP86和CER1基因高表达是从母本蓝莓中获得的。

植物在遭遇病原菌侵害时，会诱导一系列抗性基因的表达，比如抗病相关的转录因子以及它们下游靶基因。WRKY22是一类WRKY类转录因子，其能够结合到PR1启动子上调控PR1基因的表达从而介导植物免疫反应。我们转录组数据发现，嫁接材料F1较蓝莓亲本P2的材料，PR1和WRKY22基因均上调表达(如图2B所示)，这说明嫁接材料F1较亲本P2，免疫反应提高，这也解释了嫁接材料F1抗性增强的表型。同样的，转录组差异表达结果也显示，嫁接材料F1的高抗能力是从母本蓝莓中获得的(如图2B所示)。

实施例3的测试验证了通过本发明嫁接后的蓝莓具有更好的抗病性能。

实施例4：嫁接材料中抗寒性能测试：

我们发现嫁接材料较蓝莓亲本更加耐寒，为了阐明嫁接材料耐寒机制，我们对转录组差异表达基因进行分析，我们发现嫁接材料F1与蓝莓亲本P2之间，植物激素ABA和JA相关基因差异表达较明显(如图3所示)。植物激素ABA是调控植物抗寒的主要激素之一，当植物遭遇冷害胁迫时，植物诱导产生ABA，激发ABA信号传导途径，从而抵抗冷害胁迫。我们转录组结果显示，ABA合成基因NCED5在嫁接材料F1中较蓝莓亲本P2上调表达，另外ABA信号通路基因SnRK2和ABF也上调表达(如图3A所示)，这些结果说明嫁接材料F1中ABA水平较高，从而较蓝莓亲本P2更加耐寒。而两个亲本之间比较发现，ABA合成和信号基因在蓝莓亲本P2中表达量较乌饭树亲本P1要低(如图3A所示)，这说明嫁接材料耐寒能力的获得是通过亲本P1。最近有研究表明，JA在调控植物抗寒过程中起着重要作用。JA信号通路中的转录抑制子JAZ蛋白能够与CBF转录因子互作，从而调控植物抗寒过程。我们转录组结果也显示，JA合成基因AOC3、OPR1和JMT在嫁接材料F1中较蓝莓亲本P2上调表达(如图3B所示)，说明嫁接材料F1中内源JA含量高于蓝莓亲本P2。而JA信号分子JAZ1表达量也上调表达(如图3B所示)，这说明嫁接材料F1中JA信号较活跃。这些结果也表明，JA也参与了嫁接材料F1耐寒能力的提高，同时证明了本发明获得的蓝莓嫁接材料具备较好的抗寒能力，相较于蓝莓亲本具有较大的进步。

实施例5：嫁接材料中甜度口感测试：

我们发现嫁接材料F1甜度口感较蓝莓亲本P2要提高。而果实的甜度口感与果实中淀粉的含量成正比关系。而在我们转录组差异表达基因中，我们发现，在嫁接材料F1与蓝莓亲本P2中，虽然淀粉合成基因没有显著上调表达(数据未展示)，但是淀粉转化相关的酶表达显著下降(如图4所示)，这说明F1中淀粉含量得到积累。另外，我们也发现淀粉转化酶基因表达在乌饭树亲本P1中较高(如图4所示)，因此，F1淀粉积累的能力是通过蓝莓亲本P2获得的，从而也进一步地证明了嫁接材料的甜度相较于亲本也是提高的。

通过上述实施例2-5的测定中，也成功的证明了本发明所嫁接后得到的嫁接材料相较于蓝莓亲本以及乌饭树亲本都是有着较大的改善的，本发明成功的通过嫁接技术将二者的优点融合，最终所获得的的嫁接材料无论在抗病性、抗寒性以及成活率上，都有着较大的改善，并且在口感方面也有了进一步地提升，也证明了本发明的一种利用乌饭树为砧木嫁接蓝莓的嫁接方法有效地提高了蓝莓的抗病能力，同时改善了蓝莓的果实口味，提高了蓝莓果实的耐寒性能。

以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。