具体实施方式

一个或多个本发明实施方案的详细内容在本文的附图、权利要求书和说明书中进行了阐述。除非明确地排除，本文公开和考虑的本发明实施方案的其他特征、目的和优势可以与任何其他实施方案组合。

术语“调节(modulate和modulation)”是指直接或间接地诱导细胞活性例如细胞生长或分化的增加或减少、刺激、抑制、干扰或阻断，例如诱导哺乳动物滋养层干细胞变成分化细胞，例如胰腺祖细胞。

术语“物剂(agent)”是指用于细胞生长和分化，例如哺乳动物滋养层干细胞的分化的化合物，例如生物分子或化学品。物剂的实例包括但不限于，生长因子(例如，成纤维细胞生长因子(FGF))、抗氧化剂/还原剂(例如，2-巯基乙醇)、维生素(例如，烟酰胺)及其代谢物(例如，视黄酸)、核酸(例如，RNA或DNA，例如微RNA)、激素、肽和蛋白质(例如，CREB1-结合蛋白)。生长因子的实例可以包括FGF1、FGF2(bFGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9和FGF10。抗氧化剂的更多实例可以包括2-巯基乙醇(2-ME)、二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧基乙基)膦(TCEP)。维生素的实例可以包括维生素A，维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9或B12，维生素C，维生素D，维生素E和维生素K。在一些实施方案中，本文的物剂调节CAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)的活性或表达水平，例如CREB1磷酸化。在一些实施方案中，本文的物剂激活miR124。在一些实施方案中，本文的物剂调节一种或多种转录因子，例如mix1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2或GSK3β。

术语“药物”旨在包括具有用于治疗和/或诊断和/或预防目的的效用的化合物，例如治疗性、诊断性或预防性化合物。治疗性化合物包括，例如，抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗血管生成剂、止痛剂、麻醉剂、抗炎剂(包括甾体和非甾体抗炎剂(NSAID))、皮质类固醇、抗组胺剂、散瞳剂、抗肿瘤剂、免疫抑制剂、抗变态反应剂、金属蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)、抑制剂或拮抗剂或拦截剂(intraceptors)、受体拮抗剂、RNA适体、抗体或其片段、异羟肟酸和大环抗琥珀酸异羟肟酸酯衍生物、核酸、质粒、siRNA、疫苗、DNA结合(小沟)化合物、激素、维生素、蛋白质、肽、多肽和肽样治疗剂。诊断性化合物包括，例如染料、造影剂、荧光剂、放射性同位素(例如，P-32、Tc-99、F-18、I-131)和可用于诊断疾病、状况、综合征或其症状的类似物。在检测疾病、状况、综合征或症状之前施用的治疗性化合物是预防性化合物。

除非另外指出，如本文所使用的开放性术语如“含有”、“包括”等意指包含。

本文的一些实施方案涉及数值范围。当提供数值范围时，该范围包括范围端点。数值范围包括其中的所用值和子范围，如同明确地写出。

如本文所用的术语“约”意指±15％。例如，术语“约10”包括8.5至11.5。

除非另外明确声明，如本文所用的冠词“一种”或“一个”意指一种(个)或多种(个)。

“载体”是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒，或在引入至合适的宿主细胞时导致本文所述的细胞的修饰的其他载体。合适的表达载体是本领域普通技术人员公知的，并包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些载体以及保持游离型的那些载体或整合到宿主细胞基因组内的那些载体。

载体的构建可以使用在例如如在Sambrook等人,1989中描述的技术来实现。在一些实施方案中，分离的质粒或DNA片段以所需形式被切割、裁制并再连接以产生质粒。如果需要，使用任何合适的方法进行用以确认构建的质粒中的正确序列的分析。用于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引入宿主细胞和进行评价基因表达和功能的分析的合适的方法是已知的。例如，使用可以基于本文提供的序列的适当标记的探针，通过常规的Southern印迹法、用于量化mRNA的转录的Northern印迹法、斑点印迹法(DNA或RNA分析)或原位杂交，直接在样品中测量基因的存在、扩增和/或表达。

如本文所用的术语如“转染”、“转化”等旨在表示核酸以功能形式向细胞或有机体的转移。此类术语包括将核酸转移至细胞的各种手段，包括用CaPO₄转染、电穿孔法、病毒转导、脂质转染、使用脂质体和/或其他递送媒介物的递送。

可以通过亲和技术或通过细胞分选(例如，荧光激活细胞分选)对细胞进行分选，其中它们用合适的标记物进行标记，所述标记物例如是偶联至例如反义核酸分子或免疫球蛋白的荧光团或例如反义核酸分子或免疫球蛋白的一部分，或固有发荧光的蛋白质如绿色荧光蛋白(GFP)或其变体。如本文所用的“分选”是指第一细胞类型与第二细胞类型的至少部分物理分离。

术语“治疗”等可以是指获得所需的药理学和/或生理学效果，例如，病症的部分或完全治愈，和/或逆转可归因于该病症的不良反应，和/或稳定该病症，和/或延迟该病症的进展，和/或引起该病症的消退。

将干细胞施用(例如，移植)至需要治疗的区域可以通过以下方式来实现，例如但不限于，手术期间的局部输注、通过注射、通过导管或通过植入物，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料的，包括膜如硅橡胶膜或纤维。

将组合物“移植”入哺乳动物可以是指将组合物引入到哺乳动物的身体中。引入的组合物为“移植物”，且该哺乳动物为“接受者”。移植物和接受者可以是同基因的、同种异基因的或异种的。此外，移植可以是自体移植。

“有效量”可以是足以实现预期目的的治疗剂的量。例如，用于增加hTS细胞数目的因子的有效量是足以在体内或体外(视情况而定)导致干细胞数目增加的量。用于治疗或减轻神经变性疾病或病症的组合物的有效量是足以减少或去除该神经变性疾病或病症的症状的组合物的量。给定治疗剂的有效量将随例如物剂的性质、施用的途径、接受治疗剂的动物的大小和物种和施用的目的等因素而变化。

2-巯基乙醇(也称β-巯基乙醇、BME、2BME、2-ME或β-met)是具有式HOCH₂CH₂SH的化学化合物。

烟酰胺，也称作尼克酰胺和尼克酸酰胺，是尼克酸(维生素B₃/烟酸)的酰胺化物，并具有式C₆H₆N₂O。

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞来自啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或松鼠)、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴、猿(例如，黑猩猩、大猩猩或猩猩)或人。

在一些实施方案中，本文的哺乳动物是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或松鼠)、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴、猿(例如，黑猩猩、大猩猩或猩猩)或人。

在一些实施方案中，在胚胎形成中，胰腺发育需要定形内胚层(DE)的关键衍生以供进一步分化。微RNA(miR)在多个水平上起作用，从而控制整个分化过程中细胞转变的时机。本发明的许多方面之一是使用FGF(例如，bFGF)通过由miR-124驱动的DE特化将哺乳动物滋养层干细胞分化成胰腺祖细胞。本发明的另一个方面是在胰腺分化期间通过miR-124的调节促进β调理素以用于β细胞增殖。本发明的另一个方面是提供由哺乳动物滋养层干细胞分化的分泌胰岛素的胰腺祖细胞。

在一些实施方案中，在哺乳动物滋养层干细胞中，FGF(例如，bFGF)在一天内有效地通过定形内胚层(DE)的形成而诱导朝向分泌胰岛素的胰腺祖细胞的分化。

在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)通过FGFR1/PI3K/Akt/CREB1途径激活微RNA(miR)-124的时间空间提升以执行两种功能：1)抑制Smad4并因此抑制Mixl1以用于DE形成，以及2)抑制Cdx2，并转而通过自动调节反馈环路相互激活Oct4用于DE调节。随后，通过原肠管的转变，DE分化成多能胰腺祖细胞。各个阶段特异性细胞过程在分化期间主要由独特多能转录因子来调节。

在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞衍生的胰腺祖细胞是葡萄糖敏感的，在体外和/或体内分泌免疫反应性C-肽和胰岛素。

在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)诱导有效地促进了miRNA-124a的激活，后者引导在哺乳动物滋养层干细胞中的胰腺祖细胞分化。

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞是用于糖尿病患者的基于细胞的疗法和用于药物毒性筛选的可更新干细胞源。

在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)能够有效地使哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)分化成胰腺祖细胞，从而提供在生成用于1型DM患者中的基于细胞的疗法的分泌胰岛素的胰腺祖细胞中作为干细胞的可更新来源的证据。

在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞提供了针对胰腺疾病相关药物筛选的主要优点，这是因为：1)它们易于产生在多孔板中评价所需的足够数目；2)细胞基因型和表型稳定；3)胰腺分化和增殖通过DE的特化来表征和阐明；4)单一诱导物和简单培养基的条件有利于毒性筛选中的评价；以及5)非常短的时间，例如1天，即可完成分泌胰岛素的β-细胞的分化，这在经济上满足要求。

在一种情况下，用10ng/ml成纤维细胞生长因子(例如，bFGF)处理哺乳动物滋养层干细胞在群体中产生约10％的产生胰岛素的细胞，其表达胰腺祖细胞相关标志物和胰岛组分。在细胞过程中，miRNA-124有效地抑制了Cdx2和Smad4及其下游效应物Mixl1，从而导引DE的形成和朝向胰腺祖细胞的分化。所述细胞能够进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)通过RTK激活PI3K/Akt途径以使CREB1磷酸化。CREB1-p瞬时靶向miR-124的启动子。在一种情况下，miR-124以两种方式起作用：a)抑制Smad4和Mixil1以用于DE形成；以及b)抑制Cdx2，并转而激活Oct4以用于DE调节。在一种情况下，FGF(例如，bFGF)诱导介导中内胚层、DE和原肠管的细胞过程，以在一天内在哺乳动物滋养层干细胞中形成功能性的胰腺祖细胞。

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞是人滋养层干细胞(hTS细胞)。

miR-124a也称为miR-124a、mir-124a、微RNA-124a、miRNA-124a、miR-124、mir-124、微RNA-124或miRNA-124。

对于miR-124，感兴趣的编码序列包括但不限于，编码miR-124的前体的序列，例如，其中这类编码序列的实例在miRBase数据库中有报道，该数据库由BBSRC资助的曼彻斯特大学(University of Manchester)生命科学学院托管并维持。给定的载体根据需要可以包括单个编码序列或该编码序列的多个重复序列。

miR-124的前体还可以见于miRBase数据库中，例如，>hsa-mir-124-1MI0000443

AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUCCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAAUGGGGCUG(SEQ ID NO:3)

>hsa-mir-124-2MI0000444

AUCAAGAUUAGAGGCUCUGCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGCGGAGCCUACGGCUGCACUUGAA(SEQ ID NO:146)

>hsa-mir-124-3MI0000445

UGAGGGCCCCUCUGCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCUAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGAGGCGCCUCC(SEQ ID NO:147)。

本文的miR-124的核酸序列可以包括任意miR-124家族成员的核酸序列的片段或全长核酸序列，例如在本发明的附图、表1和表2中，例如，如在蝇类(MI0000373)、线虫蠕虫(MI0000302)、小鼠(MI0000150)和人(MI0000443)中鉴定的那些，或在miRBase——英国曼彻斯特大学(University of Manchester,UK)的微RNA数据库中发现的那些。在一些实施方案中，抗-miR-124可以具有与miR-124的序列有任意互补性(compliment)的序列，例如miRZIP124。在一些实施方案中，使用基于miRZip^TMlentiviral的微RNA敲低方法制备抗-miR-124，例如由System Biosciences生产的。

表1.miR-124家族成员的实例

注意：表1中的序列名称根据标准命名规则来表示，例如，表示为-5p或-3p。

表2.miR-124a家族成员的实例

注意：表2中的序列名称根据标准命名规则来表示，例如，表示为-5p或-3p。

表3.Smad4 shRNA的启动子序列

哺乳动物滋养层干细胞

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞来自啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、松鼠)、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴、猿(例如，黑猩猩、大猩猩、猩猩)或人。在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞并非来自灵长类动物，例如，猴、猿、人。在另一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞来自灵长类动物，例如，猴、猿、人。在另一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞是人或人源化的。

可以诱导本文的哺乳动物滋养层干细胞以使之分化成一种或多种分化细胞。在一种情况下，该分化细胞是祖细胞，例如胰腺祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是多能干细胞。在一种情况下，该分化细胞是内胚层、中胚层或外胚层祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是定形内胚层祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是胰腺内胚层祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是多能祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是寡能祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是单能、双能或三能祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是内分泌、外分泌或管祖细胞，例如内分泌祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是β-细胞。在一种情况下，该分化细胞是产生胰岛素的细胞。可以在本文公开的任何方法中使用一种或多种分化细胞。

在一个方面，本文提供了由本文的一种或多种方法分离的一种或多种分化细胞。在一种情况下，分离的分化细胞是人细胞。在一种情况下，分离的分化细胞具有正常核型。在一种情况下，分离的分化细胞具有一种或多种免疫赦免的特性，例如，低或缺乏CD33表达和/或CD133表达。本文公开的一种或多种分离的分化细胞可以在本文公开的任何方法中使用。

在另一个方面，本文提供了表达包括Foxa2、Pdx1、Ngn3、Ptf1a、Nkx6.1或其任意组合的一种或多种转录因子的分离的祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞表达Foxa2、Pdx1、Ngn3、Ptf1a、Nkx6.1中的两种、三种或四种转录因子。在一种情况下，分离的祖细胞表达Foxa2、Pdx1、Ngn3、Ptf1a和Nkx6.1。在一种情况下，分离的祖细胞是诱导的多能干细胞。在一种情况下，分离的祖细胞衍生自哺乳动物滋养层干细胞，例如，hTS细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是胰腺祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是内胚层、中胚层或外胚层祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是定形内胚层祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是胰腺内胚层祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是多能祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是寡能祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是单能、双能或三能祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是内分泌、外分泌或管祖细胞，例如内分泌祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是β-细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是产生胰岛素的细胞。在一种情况下，分离的祖细胞来自啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、松鼠)、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴、猿(例如，黑猩猩、大猩猩、猩猩)或人。在一种情况下，分离的祖细胞是人细胞。在一种情况下，分离的祖细胞具有正常核型。在一种情况下，分离的祖细胞具有一种或多种免疫赦免的特性，例如低或缺乏CD33表达和/或CD133表达。本文公开的分离的祖细胞可以在本文公开的任何方法中使用。

在另一个方面，本文提供了表达β调理素、β调理素mRNA、C-肽和胰岛素的分离的祖细胞，其中该分离的祖细胞由哺乳动物滋养层干细胞分化而来。在一种情况下，分离的祖细胞来自啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、松鼠)、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴、猿(例如，黑猩猩、大猩猩、猩猩)或人。在一种情况下，分离的祖细胞是胰腺祖细胞。在一种情况下，分离的祖细胞是人细胞。在一种情况下，分离的祖细胞具有正常核型。在一种情况下，分离的祖细胞具有一种或多种免疫赦免的特性，例如低或缺乏CD33表达和/或CD133表达。本文公开的一种或多种分离的祖细胞可以在本文公开的任何方法中使用。

在一种情况下，本文的分离的祖细胞是产生胰岛素的细胞。本文的一种或多种分离的祖细胞可以在本文公开的任何方法中使用。

在一种情况下，本文中的分化细胞是产生胰岛素的细胞。本文的一种或多种分化细胞可以在本文公开的任何方法中使用。

人滋养层干细胞

人输卵管是女性的受精部位和常见的异位妊娠部位，在其中发生若干生物事件，例如内细胞团(ICM)与滋养外胚层之间的区分(distinction)以及从全能性到多能性的具有主要表观遗传变化的转变。这些观察为输卵管作为生态位储器用于在植入前期收集胚泡相关的干细胞提供了支持。异位妊娠在工业化国家中占所有妊娠的1至2％，并且在发展中国家中要高得多。考虑到人胚胎干细胞(hES细胞)和胎儿脑组织的可得性的缺乏，本文描述了来源于异位妊娠的人滋养层干细胞(hTS细胞)作为几乎无法获得的hES细胞的替代物用于产生祖细胞的用途。

在一些实施方案中，来源于异位妊娠的hTS细胞不涉及人胚胎的破坏。在另一种情况下，来源于异位妊娠的hTS细胞不涉及活的人胚胎的破坏。在另一种情况下，hTS细胞来源于与不存活的异位妊娠相关的滋养层组织。在另一种情况下，异位妊娠不能得救。在另一种情况下，异位妊娠不会导致活的人胚胎。在另一种情况下，异位妊娠威胁母亲的生命。在另一种情况下，异位妊娠是输卵管的、腹部的、卵巢的或子宫颈的。

在一些实施方案中，在胚泡发育期间，ICM接触自身或其衍生的可扩散“诱导物”在极性滋养外胚层中触发高速率的细胞增殖，从而导致细胞在整个胚泡阶段朝向腔壁区移动，并且甚至在滋养外胚层与ICM区分后可以继续。覆盖ICM的腔壁滋养外胚层细胞能够保留ICM的“细胞记忆”。通常，在植入开始时，由于来自子宫内膜的机械约束，与ICM相对的腔壁细胞停止分裂。然而，这种约束并不存在于输卵管中，从而导致极性滋养外胚层细胞持续分裂以在停滞的异位妊娠胚泡中形成胚外外胚层(ExE)。在一些实施方案中，ExE-衍生的TS细胞以增殖状态存在至少4天的窗口期，这取决于ICM分泌的成纤维细胞生长因子4(FGF4)与其受体成纤维细胞生长因子受体2(Fgfr2)的相互作用。在另一种情况下，ExE-衍生的TS细胞以增殖状态存在至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天的窗口期。直至临床干预发生，这些细胞过程可以在植入前胚胎中产生无限数目的hTS细胞；这些细胞保留来自ICM的细胞记忆，其通过ICM相关基因的表达来反映。

本文提供的一个方面使用Affymetrix^TM平台来探询GeneChip Human Genome U133plus 2.0GeneChip以用于hTS细胞与胎盘衍生的间充质干(PDMS)细胞间的总基因比较，描述了hTS细胞与PDMS细胞之间的区分。在一些实施方案中，hTS细胞表现出比PDMS细胞中少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％或约75％的基因表达。在另一种情况下，hTS细胞显示了总共2,140个基因(倍数变化>2倍)，其比PDMS细胞(3,730个基因)少约40％。在一些实施方案中，hTS细胞的基因强度分布显示了与PDMS细胞中不同的均匀图案。在另一种情况下，hTS细胞代表了在植入前期的不同组的细胞滋养层，由此它们具有内细胞团(ICM)和/或滋养外胚层的分子特征(portrait)。在另一种情况下，hTS细胞表现出与hES细胞相似的多能性和自更新的特性。获得和分离哺乳动物滋养层干细胞的方法

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)可以从脐带、羊水、羊膜、脐带胶质(Wharton's jelly)、绒毛膜绒毛、胎盘或异位妊娠分离。

在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)可以从羊膜穿剌术活检物或从羊水中分离。在一种情况下，羊膜穿剌术可以是用于获得在妊娠期间围绕胎儿的羊水的小样品的程序。在一种情况下，羊膜穿剌术可以提供给妊娠15周至20周的、染色体异常风险增加的女性，例如分娩年龄超过35岁的女性，或已经进行了异常产妇血清(血液)筛选试验，显示染色体异常或神经管缺陷的增加的风险的那些女性。在一种情况下，可以在超声引导下使用针，例如长的、细的中空针，通过腹部进入子宫和羊膜囊。可以将预定量的羊水，例如1盎司，抽取到注射器中。

在另一种情况下，可以在植入前遗传学诊断(PGD)过程中，例如与生殖疗法例如体外受精(IVF)组合，从卵裂球活检物获得本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)。在一种情况下，本文的细胞可以通过用于胚泡的活组织检查的方法产生，其中胚泡的剩余物被植入并导致怀孕及随后导致活产，例如从胚泡中去除透明带并随后对胚泡进行活组织检查。

在另一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)可以由产前绒毛膜绒毛取样(CVS)获得。在一种情况下，CVS可以是涉及从胎盘取得组织样品以测试染色体异常和某些其他遗传问题的产前检查。在一种情况下，可以在妊娠10周至12周进行CVS。在一种情况下，CVS程序是经子宫颈的，例如，将导管插入穿过子宫颈进入胎盘以获得组织样品。在一种情况下，CVS程序是经腹的，例如，将针插入穿过腹部和子宫进入胎盘以获得组织样品。

在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)可以在足月妊娠后从胎盘活检物获得。在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)可以在阴道分娩或剖腹产分娩后从胎盘分离。

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)可以从妊娠早期绒毛膜绒毛取样(例如，8⁺³至12⁺⁰周胎龄)或来自剖腹产分娩的足月胎盘分离。绒毛膜组织可以从切碎的和/或酶消化(例如，用0.05％的胰蛋白酶EDTA，例如，持续20min)的羊膜分离。随后，对细胞进行离心(例如，在1500rpm下，例如持续5min)、计数和/或重新接种(例如，每cm²10⁴个细胞)在培养基(例如，Dulbecco改良Eagle培养基+10％胎牛血清)中。在一种情况下，分离的细胞可以是塑料附着的。在一种情况下，细胞可以在传代(passage)4-8次时使用。

在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)可以根据下面的程序从足月(例如，38–40周妊娠)胎盘分离。使脐带血从胎盘排尽，然后小心地切开胎盘。将收集的组织片洗涤若干次(在磷酸盐缓冲盐水中)，并随后切碎(例如，机械地)并进行酶消化(例如，用0.25％胰蛋白酶-EDTA))。随后将匀浆通过离心沉淀并悬浮于完全培养基(例如，Dulbecco改良Eagle培养基，其补充有10％的胎牛血清、100U/ml青霉素和/或100g/ml链霉素)中。使细胞培养物保持在合适的条件下，例如37℃以及水饱和的气氛和5％CO₂。培养基定期更换，例如每周1到2次。当细胞达到所需的汇合水平时，例如大于80％汇合时，将细胞用例如0.25％胰蛋白酶/EDTA回收并以例如1:3的稀释度重新接种。

在另一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)可以根据如下的程序从分娩后的人胎盘分离。通过将它们剥开从羊膜分离绒毛膜。将蜕膜组织刮下(例如，机械地)并洗涤(例如，在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中)，然后切成小片(例如，-2×2cm)。将绒毛膜切碎成小片并经受酶(例如，0.5％胰蛋白酶-EDTA，例如持续5min)，接着用胶原酶I(例如，以0.3％在37℃孵箱中持续20至30min)消化。然后采集动员的细胞并使其通过细胞过滤器(例如，100μm)。通过离心(例如，在2,500rpm下，例如持续5min)采集过滤的细胞。将细胞再悬浮于培养基(例如，补充有10％胎牛血清和/或1％青霉素-链霉素的α-改性的极限必需培养基)中，并在合适的条件下(例如，在37℃和/或5％CO₂下)在容器(例如，T25烧瓶)中培养。定期更换培养基，例如每3天，直至绒毛膜MSC达到所需的汇合水平，例如70％汇合。

在另一种情况下，本文还提供了用于获得哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)的方法，该方法包括：(a)在异位妊娠(例如，妊娠4-6、5-7或6-8周)的输卵管处获得胚胎；以及(b)从胚胎的绒毛滋养层获得干细胞。在一些实施方案中，胚胎可以从未破裂的异位妊娠获得。在一些实施方案中，未破裂的异位妊娠可以是处于受精后少于6周的阶段。绒毛滋养层可以包含细胞滋养层。

在另一种情况下，胚胎绒毛膜绒毛可以从具有异位妊娠(例如，胎龄：5-7周)的女性的未破裂的植入前胚胎的输卵管获得。可将细小的绒毛组织在合适的培养基(例如，无血清α-MEM)中完全切碎并在显微镜下鉴定，接着胰蛋白酶化(例如，用0.025％胰蛋白酶/EDTA)一段时间(例如，15min)，并随后添加培养基(例如，包含10％FBS的α-MEM)以使反应停止。可以获得粘附的细胞并将其在合适的条件下(例如，在37℃在5％CO₂下的条件α-MEM、10％FBS和1％青霉素-链霉素中)培养。在两次传代后，hCG的水平会变得利用商业试剂盒(例如，Dako,Carpinteria,CA)测量无法检测到。

哺乳动物滋养层干细胞的分化方法

在许多方面的一个方面，本文提供了分化哺乳动物滋养层干细胞的方法，该方法包括调节miR-124以诱导哺乳动物滋养层干细胞向分化细胞的分化。在一种情况下，该哺乳动物滋养层干细胞是人滋养层干(hTS)细胞。在一种情况下，该分化细胞是多能干细胞。在一种情况下，该分化细胞是祖细胞，例如胰腺祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是内胚层、中胚层或外胚层祖细胞，例如定形内胚层祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是胰腺内胚层祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是多能祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是寡能祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是单能、双能或三能祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是内分泌、外分泌或管祖细胞，例如，内分泌祖细胞。在一种情况下，该分化细胞是β-细胞。在一种情况下，该分化细胞是产生胰岛素的细胞。一种或多种分化细胞可以在本文公开的任何方法中使用。

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞来自啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、松鼠)、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴、猿(例如，黑猩猩、大猩猩、猩猩)或人。

在一些实施方案中，所述调节激活了miR-124。在一种情况下，所述调节在时间空间上，例如在定形内胚层阶段，在约1小时至约8小时之间激活了miR-124。在一种情况下，所述调节提升了miR-124表达。在一种情况下，调节使miR-124失活。在一种情况下，所述调节降低了miR-124表达。在一种情况下，所述调节包括使哺乳动物滋养层干细胞与一种或多种物剂例如蛋白质或类固醇激素接触。在一种情况下，所述一种或多种物剂包括生长因子，例如成纤维细胞生长因子(FGF)。在一种情况下，该FGF是FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9或FGF10的一种或多种。在一种情况下，所述一种或多种物剂包括FGF2(碱性成纤维细胞生长因子，bFGF)。在一种情况下，所述调节包括使哺乳动物滋养层干细胞与不大于约200ng/mL，例如100至200ng/mL的FGF(例如bFGF)接触。在一种情况下，所述调节包括使哺乳动物滋养层干细胞与不大于约100ng/mL的FGF(例如，bFGF)，例如约0.1至1ng/mL；或约1至约100ng/mL的FGF(例如bFGF)接触。在一种情况下，本文所用的FGF(例如，bFGF)的浓度为约：0.1-1、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、50-70、80-90或90-100ng/mL。在一种情况下，本文所用的FGF(例如，bFGF)的浓度为约：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90ng/mL。在一种情况下，所述一种或多种物剂进一步包括抗氧化剂或还原剂(例如，2-巯基乙醇)。在一种情况下，所述一种或多种物剂进一步包括维生素(例如，烟酰胺)。在一种情况下，所述调节包括使哺乳动物滋养层干细胞与FGF(例如，bFGF)、2-巯基乙醇和烟酰胺接触。在一种情况下，抗氧化剂/还原剂(例如，2-巯基乙醇)的浓度不大于约10mmol/L，例如约0.1至约10mmol/L。在一种情况下，抗氧化剂/还原剂(例如，2-巯基乙醇)的浓度为约：0.1-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10mmol/L。在一种情况下，抗氧化剂/还原剂(例如，2-巯基乙醇)的浓度为约：0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8或9mmol/L。在一种情况下，抗氧化剂/还原剂(例如，2-巯基乙醇)的浓度为约1mmol/L。在一种情况下，维生素(例如，烟酰胺)的浓度不大于约100mmol/L，例如约1至约100mmol/L。在一种情况下，维生素(例如，烟酰胺)的浓度为约：1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、50-70、80-90或90-100mmol/L。在一种情况下，维生素(例如，烟酰胺)的浓度为约：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80或90mmol/L。在一种情况下，维生素(例如，烟酰胺)的浓度为约10mmol/L。

在一种情况下，所述调节包括使哺乳动物滋养层干细胞与一种或多种物剂接触以调节cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)的活性或表达水平。在一种情况下，所述一种或多种物剂调节CREB1磷酸化。在一种情况下，所述一种或多种物剂包括维生素代谢物，例如视黄酸。在一种情况下，所述一种或多种物剂包括CREB1-结合蛋白。在一种情况下，所述一种或多种物剂调节包含mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2或GSK3β的一种或多种因子。

在一种情况下，所述一种或多种物剂包括外源性miR-124前体或外源性抗-miR-124。在一种情况下，哺乳动物滋养层干细胞用外源性miR-124前体或外源性抗-miR-124转染。在一种情况下，miR-124的启动子的TGACGTCA(SEQ ID NO:158)的顺式调节元件(CRE)得到调节。

在一些实施方案中，miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR-124e。在一种情况下，miR-124是miR-124a，例如智人miR-124a(hsa-miR-124a)。在一种情况下，miR-124a是hsa-miR-124-5p(SEQ ID NO:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或其片段。在一种情况下，miR-124a是hsa-miR-124-3p(SEQ ID NO:2:UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或其片段。在一种情况下，miR-124包含选自表1、表2和附图中的序列或其片段。

在一种情况下，哺乳动物滋养层干细胞在调节开始后一天内分化成分化细胞。

在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞的分化的诱导包括在足以诱导分化的条件(例如，12、24、48、76或96小时)下在包含生长因子(例如，bFGF)的培养基中培养未分化的哺乳动物滋养层干细胞。培养基可以进一步包含血清(例如，FBS)、碳水化合物(例如，葡萄糖)、抗氧化剂/还原剂(例如，β-巯基乙醇)和/或维生素(例如，烟酰胺)。测量分化细胞的收率，例如，作为胰腺祖细胞的指示物的胰岛素⁺/Ngn3⁺细胞或胰岛素⁺/胰高血糖素⁺细胞。在一种情况下，例如，如通过Western印迹分析所指示的，FBS与胰岛素水平在FGF(例如bFGF)诱导期间是正相关的。

在一些实施方案中，在细胞诱导(例如，通过bFGF)时，可以进行时程分析，例如，持续4、8、16、24、32、40或48小时，以监测标识细胞分化发育的级联阶段的转录因子的水平。在一些实施方案中，下降的Mixl1和高水平的T和Gsc可能暗示从哺乳动物滋养层干细胞到中内胚层的转变。在一些实施方案中，各个分化阶段的主导多能转录因子包括针对中内胚层的Cdx2，针对DE的Oct4或Nanog，针对原肠内胚层的Cdx2或Nanog，或针对胰腺祖细胞的Sox2。在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)通过上调Oct4、Sox17或Foxa2，但在DE阶段下调Smad4或Mixl1来诱导miR-124a的多方面功能。

在一些实施方案中，在细胞分化期间，还用时程分析(例如，持续4、8、16、24、32、40或48小时)来测量目标分化细胞特有的蛋白质或激素的水平。例如，针对胰腺祖细胞产生，例如使用qPCR分析测量β调理素、C-肽和胰岛素。

在一些实施方案中，在此使用生长因子来诱导哺乳动物滋养层干细胞的分化。在一种情况下，该生长因子是FGF(例如，bFGF)、骨形态发生蛋白(BMP)或血管内皮生长因子(VEGF)。在一些实施方案中，生长因子的有效量不大于约100ng/ml，例如，约：1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100ng/mL。在一种情况下，哺乳动物滋养层干细胞是hTS细胞。

在一些实施方案中，在此用于分化哺乳动物滋养层干细胞的培养基可进一步包含有效量的第二物剂，该第二物剂与第一物剂协同作用以诱导向中内胚层方向的分化。在一些实施方案中，第一和第二物剂是不同的生长因子。在一些实施方案中，第一物剂在第二物剂之前添加到培养基中。在一些实施方案中，第二物剂在第一物剂之前添加到培养基中。在一种情况下，第一物剂是FGF(例如，bFGF)。在一些实施方案中，第二物剂是在第一物剂之前或之后添加的BMP，例如BMP2、BMP7或BMP4。在一些实施方案中，BMP的有效量不大于约100ng/ml，例如约：1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100ng/mL。在一种情况下，哺乳动物滋养层干细胞是hTS细胞。

在一些实施方案中，在此用于分化哺乳动物(例如，人)滋养层干细胞的培养基可包含饲养细胞。饲养细胞是这样一种类型的细胞，其与另一种类型的细胞共培养以提供第二种类型的细胞可以生长的环境。

在一些实施方案中，本文所用的培养基不含或基本不含饲养细胞。

在一些实施方案中，使用GSK-3抑制剂来诱导哺乳动物(例如，人)滋养层干细胞的分化。

药物组合物和施用

在一些实施方案中，本文提供了包含本文的分化细胞的组合物。在一种情况下，该组合物进一步包含缓冲溶液或药学上可接受的载体，其被提供以保持哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)的生物活性。例如但非限制地，该缓冲溶液是盐水、PBS(磷酸盐缓冲盐水)或FBS(胎牛血清)缓冲液。

在一些实施方案中，本文的组合物进一步包含治疗性化合物。例如但非限制地，该治疗性化合物是化学品或抗体或其片段。

在一些实施方案中，本文的组合物可以通过注射、移植或手术操作施用。

在一些实施方案中，患者是哺乳动物。在一些实施方案中，本文的哺乳动物是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或松鼠)、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴、猿(例如，黑猩猩、大猩猩或猩猩)或人。在一种情况下，患者是人。

在一些实施方案中，本文提供了用于治疗或预防糖尿病的组合物，该组合物包含如上文所述的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)或分化细胞。在一种情况下，哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)从异位妊娠的胚胎获得。所述糖尿病是1型糖尿病、2型糖尿病或成人潜伏性自身免疫糖尿病(LADA)。

在一些实施方案中，本文提供了用于治疗或预防神经系统疾病的组合物，该组合物包含哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)或分化细胞。在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞从异位妊娠的胚胎获得。该神经系统疾病是神经变性疾病。神经变性疾病可以指以由于细胞死亡而导致受试者的中枢神经系统的神经元逐渐损失为特征的任何状况。在一种情况下，该神经变性疾病是帕金森病、亨延顿舞蹈病(Huntington's disease)、阿耳茨海默病(Alzheimer's disease)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、多系统萎缩症、路易体痴呆症(Lewy body dementia)、周围感觉神经病或脊髓损伤。在一种情况下，该神经变性疾病是帕金森病。

本文所述的分离的干细胞制剂的施用模式包括但不限于，系统性静脉内注射和直接向预期活性部位的注射。所述制剂可以通过任何方便的途径，例如通过输注或团注来施用，并可以与其他生物活性剂一起施用。在一种情况下，施用是系统性局部施用。

在一些实施方案中，干细胞制剂或组合物被配制为适用于向包括人类在内的哺乳动物静脉内施用的药物组合物。在一种情况下，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。当需要时，所述组合物还包括局部麻醉剂以减轻在注射部位的任何疼痛。当组合物将通过输注施用时，其可以用包含无菌药品级水或盐水的输液瓶来分配。当组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得成分在施用前混合。

在一些实施方案中，合适的药物组合物包含治疗有效量的祖干细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水及其组合。

在一些实施方案中，分离的干细胞通过适合于将细胞靶向至特定组织的递送系统递送至目标部位(例如，胰腺、大脑、脊髓或任何其他神经损伤和/或变性部位)。例如，将细胞封装在允许细胞在目标部位缓慢释放的递送媒介物中。修饰递送媒介物使得其特异性地靶向至特定组织。以多种方式修饰靶向递送系统的表面。在脂质体靶向递送系统的情况下，将脂质基团并入脂质体的脂双层中以保持靶向配体与脂质体双层的稳定关联。

在另一个实例中，使用胶态分散体系。胶态分散体系包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。

在一些实施方案中，本文描述的干细胞的施用任选地通过以下方式针对个体进行调整：(1)增加或减少注射的细胞量；(2)改变注射的次数；(3)改变递送细胞的方法；或(4)改变细胞源，例如，通过基因工程化细胞，或来自体外细胞培养。

在一些实施方案中，干细胞制剂以有效促进细胞在接受者中的植入的量使用。在医师的裁量下，调节施用以满足最佳功效和药理给药。

筛选方法

本文提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法。在一种情况下，该方法包括使分离的哺乳动物滋养层干细胞或其分化细胞与该化合物接触。在另一种情况下，该方法进一步包括检测哺乳动物滋养层干细胞或分化细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的活性的变化。在另一种情况下，该方法进一步包括检测哺乳动物滋养层干细胞或分化细胞中的至少一种转录物或蛋白质的水平的变化。在另一种情况下，该方法包括检测哺乳动物滋养层干细胞或分化细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的活性的变化。在一些实施方案中，所述疾病与胰岛素病症，例如糖尿病相关。在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞是hTS细胞。在一些实施方案中，分化细胞是胰腺祖细胞。在一些实施方案中，分化细胞是产生胰岛素的细胞。

本文提供的一种情况描述了针对调节细胞变化的能力筛选化合物的方法。在另一种情况下，该方法包括使分离的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)与该化合物接触以及检测对哺乳动物滋养层干细胞的生长和分化的诱导。在一种情况下，该方法包括使本文的分化细胞(例如，祖细胞)与该化合物接触以及检测细胞增殖或细胞功能的变化。在一些实施方案中，分离的祖细胞是胰腺祖细胞。在一些实施方案中，分离的祖细胞是产生胰岛素的细胞。

在一些实施方案中，本文提供了针对其调节胰腺细胞功能(例如，β-细胞功能)的能力筛选化合物的方法，该方法包括将该化合物与本文的胰腺祖细胞或分化细胞组合起来，确定细胞中的任何表型或代谢变化，以及将该变化与化合物调节胰岛素、胰高血糖素或β调理素的分泌的能力相关联。

本文还提供了针对细胞的细胞毒性筛选化合物的方法，该方法包括使本文的分化细胞与该化合物接触。在另一种情况下，该方法进一步包括确定由与该化合物接触而引起的细胞的表型或代谢变化，以及将该变化与细胞毒性或细胞功能或生物化学的任何其他变化相关联。在另一种情况下，促进了对治疗性化合物、毒素或潜在的分化调节剂的筛选。这些物质(例如，治疗性化合物、毒素或潜在调节剂)可以添加至培养基。

本文还提供了筛选增殖因子、分化因子和治疗性化合物的方法。在一种情况下，哺乳动物滋养层干细胞用于筛选在培养中影响哺乳动物滋养层干细胞或分化细胞的特性的因子(例如，小分子药物、肽、多核苷酸等)或条件(例如培养条件或操作)。在一种情况下，该系统具有不被测试化合物对饲养细胞的干扰所引起的继发效应所复杂化的优点。在另一种情况下，测试影响生长的物质。在另一种情况下，将条件培养基从培养物中取出，且用更简单的培养基替代。在另一种情况下，随后用作为替代条件培养基的组分的候选物的可溶性因子的不同混合物处理不同的孔。如果所处理的细胞以令人满意的方式(最佳地还在条件培养基中)被保持并增殖，则确定各混合物的功效。可以通过根据测试方案处理细胞并随后确定所处理的细胞是否发展出特定谱系的分化细胞的功能或表型特性来测试潜在分化因子或条件。在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞是hTS细胞。

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)用于筛选细胞分化的潜在调节剂。在一种情况下，该细胞分化是胰腺分化。例如，在用于筛选细胞分化的调节剂的一个试验中，根据情况需要，可以在无血清、低密度条件下，在存在或不存在LIF的情况下，在调节剂的存在下，以及在存在或不存在RA的情况下，培养哺乳动物滋养层干细胞，并且可以检测对分化的影响。在另一种情况下，本文所述的筛选方法可以用于研究与细胞发育相关的状况以及筛选该状况的潜在治疗性或矫正性药物或调节剂。例如，在一种情况下，将正常的哺乳动物滋养层干细胞的发育与具有状况的细胞的发育进行比较。在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞是hTS细胞。

在一些实施方案中，可以比较从哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)获得的不同细胞群体之间的基因和蛋白质表达，并用于鉴定并表征在分化过程中上调或下调的因子，以及生成受影响的基因的核苷酸拷贝。

在一些实施方案中，不含饲养细胞的哺乳动物滋养层干细胞培养物还可以用于药物研究中的药物化合物的测试。候选药物化合物的活性的评价通常包括将本文的分化细胞与候选化合物组合起来，确定任何产生的变化，并随后将该化合物的影响与所观察到的变化相关联。在另一种情况下，例如，由于化合物被设计成对某些细胞类型具有药理学效应，或由于化合物被设计成具有在其他情况下具有非预期的副作用的效应，而完成所述筛选。在另一种情况下，对两种或更多种药物进行组合测试(通过同时或顺序与细胞组合)以检测可能的药物-药物相互作用效应。在另一种情况下，在开始时针对潜在的毒性筛选化合物。在另一种情况下，细胞毒性取决于对细胞活力、存活率、形态的影响，对某些标志物、受体或酶的表达或释放的影响，对DNA合成或修复的影响。在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞是hTS细胞。

疾病的治疗

在一个方面，本文提供了治疗或预防有需要的哺乳动物的疾病的方法，该方法包括将本文的细胞(例如，分离的祖细胞)施用至有需要的哺乳动物。在一种情况下，该细胞是免疫赦免的。在一种情况下，该细胞具有低水平的CD33表达和/或CD133表达。在一种情况下，所述施用包括注射、植入或手术操作。在一种情况下，所述疾病是胰岛素病症。在一种情况下，所述疾病是糖尿病，例如，1型糖尿病或2型糖尿病。在一种情况下，所述有需要的哺乳动物是啮齿动物、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴或猿。在一些实施方案中，本文的啮齿动物是小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或松鼠。在一些实施方案中，本文的猿是黑猩猩、大猩猩或猩猩。在一种情况下，所述有需要的哺乳动物具有一种或多种与糖尿病相关的症状，例如多尿症(尿频)、烦渴(增加的口渴)、多食症(增加的饥饿)、体重减轻、视力模糊、发痒、周围神经病、复发性阴道感染、疲乏、创伤或溃疡的缓慢愈合及其任意组合。

在一个方面，本文提供了治疗或预防疾病或状况的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的使用本文公开的本发明方法制备的分离的哺乳动物滋养层干细胞或分化细胞。在一种情况下，所述疾病是免疫缺陷病、神经系统疾病、造血系统疾病、癌症或糖尿病。

在一些实施方案中，本文提供了生成分泌胰岛素的细胞以例如用本文的分离的哺乳动物滋养层干细胞或分化细胞治疗糖尿病患者的方法。

在一些实施方案中，本文的糖尿病可以指在碳水化合物(例如，葡萄糖)的产生和利用中的任何代谢缺陷或任何胰岛素病症。

在一些实施方案中，糖尿病患者患有1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病或成人潜伏性自身免疫糖尿病(LADA)。在1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)中，患者产生极少的胰岛素或不产生胰岛素(调节葡萄糖利用的激素)。在2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)中，患者通常具有与非糖尿病受试者相比相同或甚至升高的血浆胰岛素水平，但已经发展了对在主要胰岛素敏感组织(其为肌肉、肝和脂肪组织)中的葡萄糖和脂质代谢的胰岛素刺激效应的抗性，且血浆胰岛素水平当提高时并不足以克服显著的胰岛素抗性。妊娠糖尿病(或妊娠期糖尿症，GDM)可以是没有先前诊断的糖尿病的女性在妊娠期间表现出高血糖水平的状况。成人潜伏性自身免疫糖尿病(LADA)可以是1型糖尿病在成人中发展的状况。

在一些实施方案中，本文的细胞、组合物和方法可以用于治疗或预防糖尿病(例如，糖尿病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性血管病和微血管病)、高血糖症、肥胖症、脂质病症(例如，血脂异常、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL、高LDL、代谢综合征(血脂异常)、全身性和肺机能亢进、心血管疾病(例如，心肌梗死后的心脏纤维化、心脏肥大和心功能不全、动脉硬化)、肾病(例如，肾小球硬化症、肾硬化、肾炎、肾病、电解质排泄病症)和/或纤维化和炎性过程(例如，肝硬化、肺纤维化、纤维化胰腺炎、风湿病和骨关节炎(arthroses)、克罗恩病、慢性支气管炎、放射性纤维化、硬化性皮炎、囊性纤维化、瘢痕形成、阿耳茨海默病)。本文的细胞、组合物和方法还可以抑制癌症、肿瘤细胞的生长和肿瘤转移并因此适用于肿瘤治疗。

在一些实施方案中，本文的细胞、组合物和方法可以用于治疗患有2型糖尿病或葡萄糖耐量降低或具有糖尿病家族史和至少一种下列状况的受试者的胰岛素抵抗综合征：血脂异常、高血压、高尿酸血症、促凝血状态、动脉粥样硬化和躯干性肥胖。

在一些实施方案中，本文的细胞、组合物和方法可以用于治疗或预防一种或多种糖尿病相关病症，包括代谢综合征(综合征X或血糖升高、高血压、肥胖症、血脂异常)、高血糖症、高胰岛素血症、葡萄糖耐量受损、空腹血糖降低、胰岛素抗性、肥胖症、动脉粥样硬化病、心血管疾病、脑血管疾病、外周血管病、狼疮、多囊卵巢综合征、癌形成、糖尿病性神经病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿和增生。

在一些实施方案中，本文的细胞、组合物和方法可以用于治疗或预防一种或多种疾病、病症和状况，包括：(1)高血糖症，(2)低葡萄糖耐量，(3)胰岛素抗性，(4)肥胖症，(5)脂质病症，(6)血脂异常，(7)高脂血症，(8)高甘油三酯血症，(9)高胆固醇血症，(10)低HDL水平，(11)高LDL水平，(12)动脉粥样硬化及其后遗症，(13)血管再狭窄，(14)肠易激综合征，(15)炎性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，(16)其他炎性状况，(17)胰腺炎，(18)腹部肥胖，(19)神经变性疾病，(20)视网膜病，(21)肾病，(22)神经病，(23)综合征X，(24)卵巢雄激素过多症(多囊卵巢综合征)，以及其中胰岛素抗性是组成部分的其他病症。

在一些实施方案中，本文的细胞、组合物和方法可以例如与抗高血脂剂联合用于治疗或预防心血管疾病(CVD)。抗高血脂剂的实例包括他汀类(statin)化合物，其为胆固醇合成抑制剂(例如，西立伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、伊伐他汀或它们的盐等)；鲨烯合酶抑制剂；或具有甘油三酯降低作用的贝特类(fibrate)化合物(例如，苯扎贝特、氯贝特、双贝特、克利贝特)等。

在一些实施方案中，本文的细胞、组合物和方法可以例如与降血压剂联合用于治疗或预防异常血管生长和由高胰岛素水平引起的肾钠潴留并由此减轻高血压。降血压剂的实例包括血管紧张素转换酶抑制剂(例如，卡托普利、依那普利、地拉普利)、血管紧张素II拮抗剂(例如，坎地沙坦西酯、氯沙坦、依普罗沙坦、缬沙坦(valsantan)、替米沙坦、依贝沙坦、他索沙坦)、钙拮抗剂(例如，马尼地平、硝苯地平、尼卡地平、氨氯地平、依福地平)和可乐定。

在一些实施方案中，本文的细胞、组合物和方法可以例如与减肥剂联合使用。减肥剂的实例包括作用于中枢神经系统的减肥药(例如，右芬氟拉明、苯氟拉明、苯丁胺、西布曲明、安非拉酮(anfepramon)、右旋苯丙胺(dexamphetamine)、氯苯咪吲哚、苯丙醇胺、氯苄雷司)、胰脂酶抑制剂(例如，奥利司他(orlistat))、β-3激动剂(例如，CL-3 16243、SR-58611-A、UL-TG-307、SB-226552、AJ-9677、BMS-196085、AZ-40140)、厌食肽(anorecticpeptide)(例如，瘦蛋白(leptin))、CNTF(睫状神经营养因子)和胆囊收缩素激动剂(例如，林替曲特(lintitript)，FPL-1 5849)。

在一些实施方案中，本文提供了治疗神经变性疾病的方法，该方法包括向患者施用有效量的滋养层干细胞或其分化细胞。哺乳动物滋养层干细胞从异位妊娠的输卵管处的滋养层绒毛获得。在一种情况下，所述神经变性疾病是帕金森病、亨延顿舞蹈病、阿耳茨海默病或化学品诱导的神经元损伤。

在一些实施方案中，本文提供了治疗病症的方法，其中该方法包括向有需要的患者移植纯神经元群体或由本文的方法生成的特异性神经干细胞群体的复合物。在一种情况下，所述患者被诊断患有神经疾病。在另一种情况下，所述患者被诊断患有神经精神性病症。在另一种情况下，所述患者被诊断患有神经变性病症。在另一种情况下，所述纯神经元群体包含多巴胺能神经元。

在一种情况下，所述疾病是神经疾病。在另一种情况下，所述疾病是神经变性疾病或病症。神经病症的非限制性实例包括帕金森病、阿耳茨海默病、亨延顿舞蹈病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、弗里德希共济失调症(Friedreich's ataxia)、路易体疾病(Lewy bodydisease)、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩症、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化、脊髓损伤、大脑损伤(例如，中风)、颅神经病症、周围感觉神经病、癫痫、朊病毒病症、克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、阿耳珀病(Alper's disease)、小脑/脊髓小脑变性、巴藤病(Batten disease)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、贝尔麻痹(Bell'spalsy)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、匹克病和孤独症。

在一些实施方案中，本文描述的方法可以用于减轻或改善神经疾病或病症的症状。与神经疾病或病症相关的症状的非限制性实例包括震颤、步态障碍、不良性步态(maldispositional gait)、痴呆、过度肿胀(浮肿)、肌无力、下肢萎缩、运动障碍(舞蹈症)、肌僵硬、物理运动变慢(运动迟缓)、物理运动的丧失(运动不能)、健忘、认知(智力)受损、认知丧失(认识不能)、诸如做决定和计划等功能受损、单侧面麻痹(hemifacial paralysis)、感觉缺失、麻木、刺痛、四肢的疼痛感觉异常、无力、颅神经麻痹、言语困难、眼动、视野缺损、失明、出血、渗出物、近端肌肉萎缩、运动障碍、肢体肌肉的强直性异常、肌强直减少、不协调、指-指试验或指-鼻试验中的错误指示、辨距不良、霍-斯二氏现象(Holmes-Stewartphenomenon)、不完全或完全全身性麻痹、视神经炎、视物显多症(multiple vision)、眼运动障碍(ocular motor disturbance)例如眼球震颤、痉挛性瘫痪、痛苦的强直性发作、莱尔米特综合征(Lhermitte syndrome)、共济失调、口吃、膀胱直肠障碍(vesicorectaldisturbance)、直立性低血压、运动功能下降、遗尿、言语表达不良、不良睡眠模式、睡眠障碍、食欲障碍、体重变化、精神运动性激动或阻滞、能量降低、无价值感或过度或不合适的内疚感、思考或集中精神困难、反复的死亡想法或自杀意念或企图、恐惧、焦虑、易怒、沉思或强迫性穷思竭虑、过度关心身体健康、惊恐发作和恐惧。

在一些实施方案中，本文的方法可以用于治疗或预防癌症，其中该癌症是癌。进一步地，该癌是腺癌或绒毛膜癌。在一种情况下，该绒毛膜癌是恶性合胞体瘤。

胰岛素、C-肽、β调理素蛋白质和β调理素mRNA的产生

在一个方面，本文提供了产生胰岛素的方法，该方法包括使哺乳动物滋养层干细胞与一种或多种物剂接触以激活miR-124，从而产生响应于葡萄糖刺激而分泌胰岛素的祖细胞。在另一个方面，本文提供了产生β调理素蛋白质和/或β调理素mRNA的方法，该方法包括使哺乳动物滋养层干细胞与一种或多种物剂接触以激活miR-124，从而产生胰腺祖细胞，该胰腺祖细胞产生β调理素蛋白质和/或β调理素mRNA。在一种情况下，β调理素蛋白质或β调理素mRNA在诱导后约12-28小时期间，例如在诱导后约12-16、16-20、20-24或24-28小时期间产生。在一种情况下，所述祖细胞是胰腺祖细胞。在一种情况下，所述祖细胞产生C-肽和/或胰岛素。

在一些实施方案中，所述哺乳动物滋养层干细胞是hTS细胞。在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞来自啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或松鼠)、兔、牛、绵羊、猪、狗、猫、猴或猿(例如，黑猩猩、大猩猩或猩猩)。

在一些实施方案中，在定形内胚层阶段在时间空间上，例如在定形内胚层阶段在约1小时至约8小时之间激活miR-124。在一些实施方案中，提升了miR-124的表达。在一些实施方案中，所述一种或多种物剂包括蛋白质或类固醇激素，例如生长因子。在一些实施方案中，所述一种或多种物剂包括FGF，例如FGF1、FGF2(bFGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9或FGF10。在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)不大于约200ng/mL，例如100-200ng/mL。在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)不大于约100ng/mL，例如约0.1至1ng/mL；或约1至约100ng/mL。在一些实施方案中，本文使用的FGF(例如，bFGF)的浓度为约：0.1-1、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、50-70、80-90或90-100ng/mL。在一些实施方案中，本文使用的FGF(例如，bFGF)的浓度为约：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90ng/mL。在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)为约10ng/mL。在一些实施方案中，所述一种或多种物剂进一步包括抗氧化剂或还原剂(例如，2-巯基乙醇)。在一些实施方案中，所述一种或多种物剂进一步包括维生素(例如，烟酰胺)。在一些实施方案中，使哺乳动物滋养层干细胞与FGF(例如，bFGF)、2-巯基乙醇和烟酰胺接触。在一些实施方案中，抗氧化剂或还原剂(例如，2-巯基乙醇)的浓度不大于约10mmol/L，例如约0.1至约10mmol/L。在一些实施方案中，抗氧化剂或还原剂(例如，2-巯基乙醇)的浓度为约：0.1-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10mmol/L。在一些实施方案中，抗氧化剂或还原剂(例如，2-巯基乙醇)的浓度为约：0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8或9mmol/L。在一些实施方案中，抗氧化剂或还原剂(例如，2-巯基乙醇)的浓度为约1mmol/L。在一些实施方案中，维生素(例如，烟酰胺)的浓度不大于约100mmol/L，例如约1至约100mmol/L。在一些实施方案中，维生素(例如，烟酰胺)的浓度为约：1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、50-70、80-90或90-100mmol/L。在一些实施方案中，维生素(例如，烟酰胺)的浓度为约：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80或90mmol/L。在一些实施方案中，维生素(例如，烟酰胺)的浓度为约10mmol/L。

在一些实施方案中，使哺乳动物滋养层干细胞与一种或多种物剂接触以调节CAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)的活性或表达水平，例如CREB1磷酸化。在一些实施方案中，所述一种或多种物剂包括维生素代谢物，例如视黄酸。在一些实施方案中，所述一种或多种物剂包括CREB1-结合蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种物剂调节选自mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2和GSK3β的一种或多种因子。

在一些实施方案中，本文的miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR-124e，例如miR-124a。在一些实施方案中，miR-124a是智人miR-124a(hsa-miR-124a)，例如hsa-miR-124-5p(SEQ ID NO:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或hsa-miR-124-3p(SEQ IDNO:2:UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或其片段。在一些实施方案中，miR-124包含选自表1、表2和附图的序列或其片段。

再生医学研究及疗法

在一些实施方案中，本文的哺乳动物滋养层干细胞(例如，hTS细胞)或其分化细胞可以用于器官和/或组织的生长和/或生成。在一种情况下，哺乳动物滋养层干细胞可以用于在没有支架的情况下或在支架(例如，天然组织支架或由可生物降解材料制成的支架)上生成器官或组织或其构建体。在一种情况下，本文的生物支架中的材料可以是水凝胶，例如I型胶原、胶原/纤维蛋白、纤维蛋白、Extracel^TM水凝胶、Extracel^TMUV、酪胺取代的透明质酸(TS-NaHy)-Corgel^TM、甲基纤维素-透明质酸(MC-HA)、壳聚糖、壳聚糖/胶原、海藻酸盐、海藻酸盐/明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，或其任意组合。在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞可以用于用3D细胞生物打印技术生成器官和/或组织。3D细胞生物打印技术包括在美国专利申请公开号20130017564、2012/0190078、2012/0116568、2011/0250688、2011/0136162和2009/0263849中公开的那些技术。在一种情况下，3D细胞生物打印技术可以保持高细胞活力和/或多能性，和/或产生具有统一尺寸的球状体。在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞可以用于生成胰腺组织。

在一种情况下，本文的哺乳动物滋养层干细胞可以用于生成功能性胰腺。在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞是hTS细胞。

实施例

以下的实施例是非限制性的并仅代表本发明的多个方面和特征。

实施例1

hTS细胞的分离

本实验获得了高雄医学大学医院人文学科研究与伦理委员会的机构审查委员会(Institutional Review Board on Human Subjects Research and Ethics Committees,Kaohsiung Medical University)的批准。异位妊娠衍生的hTS细胞从知情同意的捐赠者获得。胚胎绒毛膜绒毛从人文学科研究与伦理委员会的机构审查委员会批准的具有异位妊娠(胎龄：5-7周)的女性的未破裂的植入前胚胎的输卵管获得。将细小的绒毛组织在无血清的α-MEM(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中完全切碎，并在显微镜下鉴定，接着用0.025％胰蛋白酶/EDTA(Sigma-Aldrich)胰蛋白酶化15min，并随后添加包含10％FBS的α-MEM以使反应停止。获得粘附细胞并将其在37℃在5％CO₂下的条件α-MEM、10％FBS和1％青霉素-链霉素中培养。在两次传代后，hCG的水平变得通过商业试剂盒(Dako,Carpinteria,CA)测量无法检测到。

实施例2

通过调节miR-124a使hTS细胞向胰腺祖细胞的体外分化

含有5.5mM葡萄糖的α-MEM培养基、1mmol/Lβ-巯基乙醇(ME)、10mmol/L烟酰胺、20％FBS和10ng/ml bFGF的组合，相比于在群体中表达2.1％和1.9％的胰岛素阳性细胞的其他组合，生成了11.2％的最大免疫反应性胰岛素阳性(图5)。bFGF诱导使用多个水平的bFGF(即，10、20、40和80ng/ml)和FBS(即，无血清，1％、5％、10％和20％)。结果显示不同剂量的bFGF分别产生8.6％、2.2％和0.6％的胰岛素⁺/Ngn3⁺细胞(图6)。通过使用免疫反应性胰岛素⁺/胰高血糖素⁺细胞(8.5％)作为指示物获得了相似的结果(图7)。胰岛素⁺胰高血糖素⁺表达细胞的总细胞计数＝1,232个细胞。胰岛素⁺Ngn3⁺表达细胞的总细胞计数＝502个细胞(bFGF 10ng/ml)、712个细胞(bFGF 20ng/ml)、485个细胞(bFGF 40ng/ml)和571个细胞(80ng/ml)。Western印迹分析指示了在bFGF诱导过程中FBS与胰岛素水平的正相关性。

bFGF诱导后，时程分析揭示了标识胰腺发育的级联阶段的转录因子的动态分布(dynamic profile)(图1A和图8)。在诱导开始时，Mix-样1同源异型框蛋白(Mixl1)——中内胚层相关蛋白——在诱导后15min升高。通过与升高的Brachyury(T)或Goosecoid(Gsc)相结合，证据表明了使新生的中内胚层迁移的阶段。Mixl1在1hr时下降，而T和Gsc保持高水平，暗示了从hTS细胞到中内胚层的早期转变。

在1-8hr时，Mixl1水平在4hr时下降到最低点并在8hr时返回至初始水平。该结果可以使内胚层中的细胞在原肠胚形成期间保持静息(stationary)。在1-4hr时Mixl1强度的变化(图1B)导致中内胚层分离成两个细胞群体：一个表达针对中胚层的Pdx1⁺Mixl1⁺，而另一个表达针对内胚层的Pdx1⁺Mixl1^-(图1C)。Mixl1 mRNA表达局限于中胚层；而不存在于内胚层。SRY同源异型框17(Sox17)、叉头框蛋白A2(Foxa2)以及胰腺和十二指肠同源异型框1(Pdx1)的上调标志了胰芽的生长。需要Sox17来引发分离成Pdx1⁺腹胰和Sox17⁺胆原基，而非肝。Foxa2和Pdx1的共表达增强了向不同的胰腺细胞亚型的分化。Pdx1的过表达确定了胰腺特化，但甚至在分化的后期也不诱导胰岛素产生。

在8-16hr时，SRY同源异型框9(Sox9)和Pdx1——前肠胰腺内胚层的标志物——升高。Sox9保持多能胰腺祖细胞。Pdx1的遗传消除导致肠器官形成期间胰腺、尾侧胃和十二指肠的缺陷。证据表明向前肠胰腺内胚层阶段的分化。

在16-24hr时，神经元素3(Ngn3)和Nkx6同源异型框1(Nkx6.1)的水平保持在高水平，而T、Sox17、Foxa2、Pdx1、Sox9和Ptf1a的水平逐渐降低，从而使细胞分化朝向胰腺祖细胞。Pdx1调节Ngn3以使内胚层细胞变成内分泌细胞，从而通过胰高血糖素和促生长素抑制素在间充质中的表达形成胰岛。Nkx6.1的升高增加了β-细胞增殖。总之，这些结果指示，在24hr内bFGF通过DE形成和原肠内胚层诱导朝向胰腺祖细胞的hTS细胞分化。

图2A和图9显示了Cdx2、Oct4、Nanog和Sox2在时程分析中的动态分布。各个分化阶段的主导多能转录因子包括针对中内胚层的Cdx2，针对DE的Oct4和Nanog，针对原肠内胚层的Cdx2和Nanog，以及针对胰腺祖细胞的Sox2。免疫细胞化学研究指示了细胞转变(图2B、图14)期间的相互负自动调节反馈环路(reciprocal negative autoregulatory feedbackloop)(图10-13)，其与hES细胞中的发现相符。图2C显示了在4hr时Oct4与Sox17、Foxa2、Pdx1和Gsc的免疫细胞化学过表达，从而确认了Oct4在DE阶段。这些结果显示了多能转录因子与表型变化的独特相互作用，这在胰腺分化期间决定细胞命运。

图3A说明了通过miR-124a向DE特化的分子途径。免疫印迹分析揭示了bFGF通过FGFR1激活了PI3K/Akt途径及其下游效应物cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1()图15-18)。随时间的推移观察到miR-124a与p-CREB1表达之间的相关性(图3B)，表明CREB1促进了miR-124a的产生(图3C、图19-20)。这些结果表明bFGF通过CREB1的磷酸化诱导了miR-124a的生物发生。

miRNA是靶向3’非翻译区(3’UTR)内的mRNA序列的基因的转录后调节剂，其抑制翻译和/或引起RNA降解。通过序列分析和萤光素酶报告试验表明，miR-124a抑制Smad4(图3D)、Cdx2(图3E)和GSK3β(图3F)。证据通过miR-124a和抗-miR-124a的预转染确认了这些结果(图3G)。与报告一致，Smad4的敲低抑制了Mixl1(图21)，解释了DE转变期间Mixl1的下调。然后Cdx2的抑制促进了Oct4激活。染色质免疫沉淀(ChIP)试验揭示了Oct4靶向Sox 17的启动子(图3H)以用于Sox17表达(图22)。转而，GSK3β在1-4hr时的抑制导致β-联蛋白在细胞质中的稳定和积聚(图23)。β-联蛋白的核转位靶向基因Foxa2(图3I)以用于Foxa2表达(图8)。先前报道了miR-124a调节β-细胞系中的Foxa2。为达到该目的，bFGF通过上调Oct4、Sox17和Foxa2但在DE阶段下调Smad4和Mixl1诱导miR-124a的多方面功能。

β调理素——一种蛋白质激素——主要在肝脏中表达并功能性地诱导高胰腺β-细胞增殖速率。Foxa2靶向基因C19orf80的启动子以在12hr时产生β调理素(图3J、图24)。qPCR分析揭示β调理素mRNA的时间空间升高在12hr时开始，在16hr时到达峰值约100％，并在此后下降直到24hr(图3K)。在20-28hr期间(涵盖原肠内胚层和胰腺祖细胞两个阶段)，观察到在β调理素、C-肽和胰岛素之间的平行表达(图3L、图25)。在免疫细胞化学上，hTS细胞衍生的胰腺祖细胞共表达β调理素和胰岛素(图3M、图26)。不受任何特定理论限制或受限于任何特定理论，认为β调理素还可以在胰腺发育期间调节胰腺祖细胞增殖。

实施例3

hTS细胞衍生的胰腺祖细胞响应于葡萄糖刺激分泌胰岛素

胰腺祖细胞通过将免疫反应性胰岛素分泌到培养基中来监测葡萄糖水平(图4A)。有趣的是，证据显示细胞快速聚集以形成3D葡萄状细胞团，双硫腙(DTZ)染色为阳性，这是β-细胞的特异性染色。一旦移去高葡萄糖，细胞团即回复为成纤维细胞样特征(图4B)。该细胞过程由计算机-显微镜-视频系统记录。

放射免疫试验测量了免疫反应性C-肽和胰岛素水平响应于高葡萄糖(25mM)刺激的显著升高(图4C)。DTZ-阳性细胞团的超结构研究揭示了具有大的胞质/核比的圆形细胞、细胞间桥(桥粒接合点)、丰富的线粒体、未成熟的颗粒和模拟胰腺的α-和β-细胞的分泌颗粒的分泌颗粒的存在(图4D)。

在免疫细胞化学上，hTS细胞衍生的胰腺祖细胞表达多种标志物，包括Sox2、Nkx6.1、Ptf1a、Ngn3、Pdx1、Sox9、β调理素，以及内分泌组分，例如胰岛素(β-细胞)、促生长素抑制素(δ-细胞)、胰高血糖素(α-细胞)、胰多肽(PP-细胞)、葡萄糖代谢转运蛋白Glut2和催化酶淀粉酶(图4E)。所有证据表明了胰腺祖细胞的存在，并且它们通过表达C-肽和胰岛素阳性响应于葡萄糖刺激测试。

用于实施例2-3中描述的实验的材料和方法

细胞培养和分化

将未分化的hTS细胞保持在补充有10％(v/v)胎牛血清(SAFC Biosciences)的α-MEM(Gibco)中。每2-3天将培养物以1:3–1:6分割比进行人工传代。通过在37℃、5％CO₂的培养箱中在包含20％FBS、1mM 2-巯基乙醇、10mM烟酰胺和10ng/ml bFGF的条件α-MEM培养基中24hr来进行胰腺祖细胞的分化。分化的方案通过如图5-7中所示的经验实践来确定。谱系的阶段特异性分化参考如先前描述的多种细胞标志物(M.Borowiak,Rev.Diabet.Stud.7,93-104(2010)；K.A.D’Amour等人，Nat.Biotech.23,1534-1541(2005)；E.Kroon等人，Nat.Biotech.26,443-452(2008))。在如针对不同试验指示的时间收集细胞。

试剂

DTZ(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)、bFGF(Sigma)、异硫氰酸荧光素(FITC)、Texas Red 594(Invitrogen)、DyLight 488-、DyLight 594-(Thermo Scientific)、藻红蛋白(PE)偶联的第二抗体(Jackson ImmunoResearch,Baltimore,MD)。

Western印迹法

该试验的方法在先前进行了描述(T.T.Y.Lee等人.,PLoS ONE7,e52491(2012))。简言之，将细胞收集至补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)的RIPA裂解溶液(Millipore,Billerica,MA)中。在聚丙烯酰胺凝胶上电泳30-μg裂解物后，进行向PDVF膜(Millipore)上的电印迹。靶蛋白在室温下于在PBS中的5％脱脂奶粉中封闭1hr后，通过使用第一抗体进行检测。所有膜均与化学发光剂(Millipore)一起孵育，并通过ChemiDoc XRS系统(Bio-RAD)来捕获图像。所用的抗体列于表S1中。通过AlphaEaseFC(4.0.0版本)来分析数据。

免疫荧光

将具有细胞培养物的载玻片在室温下在95％(v/v)乙醇中固定30min，在PBS中洗涤3次，并与包含0.1％(wt/v)Triton X-100(Sigma)和5％(v/v)正常驴血清(Millipore)的封闭缓冲液PBS孵育60min。将第一和第二抗体在封闭缓冲液中稀释。将第一抗体在4℃下孵育(24hr)或在室温下孵育2hr。在与在PBS中的特异性第一抗体孵育后，在室温下添加合适的异硫氰酸荧光素(FITC,Invitrogen)或Alexa Fluor 488、594、647(Invitrogen)或Dylight 488、594(BioLegend)偶联的第二抗体1hr。通过4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，对核(5min)细胞进行显微镜检查。随后在室温下与第二抗体孵育(1hr)并洗涤，用50％甘油固定载玻片。在共聚焦激光扫描显微镜(LSM700；Zeiss Z1或Olympus FluoView1000共聚焦激光扫描显微镜)或TissueFAXS系统(TissueQnostics GmbH,Vienna,Austria)上捕获图像，并通过如先前所述的TissueQuest软件(T.T.Y.Lee等人,PLoS ONE 7,e52491(2012))分析数据。

TaqMan miRNA和定量实时PCR试验

根据制造商的方案使用TRIZOL试剂(Invitrogen)与DNAase I柱上消化(Qiagen,Valencia,CA)从一式三份或五份样品中的hTS细胞中分离RNA。总RNA(500ng)用于使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)进行逆转录。使用每反应1/40的cDNA和400nM正向和反向引物一式两份地进行PCR。针对miRNA茎环qPCR，根据制造商的说明(AppliedBiosystems)使用单管TaqMan miRNA试验。所有的RT反应，包括无模板对照和RT-对照，均在GeneAmp PCR 9700热循环仪(Applied Biosystems)中进行。使用miR-124或RNU6B的特异性引物(Applied Biosystems)，一式三份或五份地进行比较实时PCR，包括无模板对照。U6snRNA(RNU6B；Applied Biosystems)用作内源性对照。使用SDS2.2.2软件(AppliedBiosystems)计算相对表达用于比较ΔC_t分析。用于β调理素mRNA的引物的序列：引物1，正向：5’-acatctccctccccagactc-3’(SEQ ID NO:122)和反向：5’-tgctctgtgctcagaagtgg-3’(SEQ ID NO:123)；引物2：正向：5’-ctgtcggctgagggtttccat-3’(SEQ ID NO:124)和反向：5’-gagtctggggagggagatgt-3’(SEQ ID NO:125)。

免疫沉淀(IP)试验

采集bFGF-处理的hTS细胞的细胞裂解物。通过与蛋白G-琼脂糖(Minipore)孵育30min，将总蛋白质(100μg)用列于(表S1)中的特异性第一抗体处理过夜。在用蛋白G-琼脂糖珠粒处理2h后，将样品用RIPA裂解缓冲液(Minipore)洗涤3次，接着添加蛋白质上样染料并煮沸5min。将样品通过8％SDS-PAGE解析并进行免疫印迹分析。

染色质免疫沉淀(ChIP)试验

按照制造商的说明通过使用ChIP试验试剂盒(Millipore)进行ChIP试验。简言之，从hTS细胞(1x10⁶)提取免疫沉淀DNA片段，并如先前所述(T.T.Y.Lee等人,PLoS ONE 7,e52491(2012))使用抗-CREB1或抗-Oct4或抗-β-联蛋白的抗体。特异性引物用于扩增在miR-124a或Sox17或Foxa2的启动子区域处的保守结合位点，并如下列出：

针对miR124-2的启动子：正向，5’-tctgcggctctttggtttca-3’(SEQ ID NO:126)，和反向，5’-tctgccttcagcacaagagg-3’(SEQ ID NO:127)；以及正向，5’-gcggctctttggtttcaagg-3’(SEQ ID NO:128)；反向，5’-ctgccttcagcacaagagga-3’(SEQ IDNO:129)；针对miR124-3的启动子：5’-cccgcagttctcaaggacac-3’(SEQ ID NO:130)，和反向，5’-agaagggagccaggcaagtc-3’(SEQ ID NO:131)；针对Sox17的启动子：5’-ttgtagattgctctctctcctcc-3’(SEQ ID NO:132)，和反向，5’-gtgaagccttggctagggg-3’(SEQ ID NO:133)；针对Foxa2的启动子：5’-cccatcattgattcctggat-3’(SEQ ID NO:134)，和反向，5’-ttgggaggctgagatttgtc-3’(SEQ ID NO:135)；针对β调理素的启动子：5’-gtcagccctccctgactgat-3’(SEQ ID NO:136)，和反向，5’-catgtggatttccagcctgc-3’(SEQID NO:137)。

双萤光素酶试验

为制备萤光素酶-3'UTR报告质粒，从hTS细胞的基因组DNA提取物对扩增的3’UTR片段进行扩增。通过使用PsiI和MfeI(Thermo Scientific,Rockford,IL)，将3'UTR PCR片段克隆至pGL4.51载体(Promega,Madison,WI)的萤光素酶基因下游。用于3’UTR报告构建体的引物如下列出：

针对Cdx2 3’UTR：正向，5’-aaattataagctgtttgggttgttggtct-3’(SEQ ID NO:138)，和反向，5’-aaacaattgcccccataatttctgactgc-3’(SEQ ID NO:139)；针对Smad4 3’UTR区域1：正向，5’-aaattataactcccaaagtgctgggatta-3’(SEQ ID NO:140)，和反向，5’-aaacaattgctgcactgttcacaggagga-3(SEQ ID NO:141)；针对Smad4 3’UTR区域2：正向，5’-aaattataacagttgtcccagtgctgcta-3’(SEQ ID NO:142)，和反向，5’-aaacaattgatgacttgcccaaaggtcac-3’(SEQ ID NO:143)；针对GSK3β3’UTR：正向，5’-aaattataacccacaactggggtaaaaga-3’(SEQ ID NO:144)，和反向，5’-aaacaattgctgtggaaggggcaaagata-3’(SEQ ID NO:145)。

对于双萤光素酶试验，将萤火虫萤光素酶报告基因(500ng)或不具有任何3’UTR的空载体与pGL4.74海肾萤光素酶质粒(500ng；Promega)共转染，且使用-LT1转染试剂(Mirus Bio LLC,Madison,WI,US)将非特异性对照miRNA(30pmol)或miR-124a前体(30pmol；System Biosciences,Mountain View,CA)共转染至hTS细胞(每个孔中1.5x10⁴个细胞)。在转染(36hr)后，通过双萤光素酶报告试验系统(Promega)和Centro LB 960微孔板发光检测仪(Microplate Luminometer)(Berthold Technologies,Bad Wildbad,Germany)分析萤光素酶活性。为进行评价，首先将海肾萤光素酶值相对于萤火虫萤光素酶活性进行归一化，并进一步将计算的各3’UTR报告基因的活性相对于对照载体的活性进行归一化。数据表示为平均值±SD,n＝8,p<0.05作为统计显著性。使在细胞裂解缓冲液中制备的全细胞提取物经受利用Cdx2、Smad4、GSK3β和β-肌动蛋白抗体的免疫印迹分析。

miR-124a前体或抗-miR-124a的转染

miR-124a前体和抗-miR-124a购自System Biosciences。简言之，使用TransIT-LT1转染试剂(Mirus,Madison,WI)将miR-124a前体(60pmol)或抗-miR-124a(60pmol)转染至在12孔培养皿中的hTS细胞。总RNA用于在转染后36hr时量化miR-124a。

C-肽和胰岛素的放射免疫测定

在葡萄糖刺激试验中，在bFGF处理后在超过80％的细胞汇合时将高葡萄糖(25mM)添加到α-MEM培养基(5ml)中。在不同的时间(5、10、20、30、60和120min)采集培养基。将采集的培养基用冻干机(VirTis,Warminster,PA)冻干，并用无菌水(400μl)再水合以供放射免疫测定。分别通过C-PEP II-RIA-CT(DIAsource ImmunoAssays S.A.Belgium)和Coat-A-Count胰岛素(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.LA,CA)确定培养基中的C-肽和胰岛素水平。n＝5，p<0.05作为统计显著性。

流式细胞术

在用非特异性shRNA或针对Cdx2或Oct4或Sox2或Nanog的shRNA转染后，将细胞(5×10⁶个细胞/ml)与特异性第一抗体(列于表S1中)孵育30min。通过在4℃下，在调节的稀释度下，与合适的荧光染料偶联的第一抗体孵育1hr，将样品洗涤并再悬浮于PBS中，接着在流式细胞术(FACScan,BD Biosciences,San Jose,CA)前使之通过具有细胞过滤器盖(BDFalcon)的聚苯乙烯圆底试管。用Cell-Quest软件(BD Biosciences)分析数据。

透射电子显微术

在高葡萄糖刺激后，将培养皿上的hTS细胞衍生的胰岛状细胞团用钨针切开。为进行透射电子显微术，将细胞块在包含3％wt/vol甲醛、1.5％(wt/vol)戊二醛和2.5％(wt/vol)蔗糖的0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)中在室温下固定1hr以及在4℃下固定过夜。在4℃下在包含1％(vol/vol)OsO₄的Palade固定液中锇处理(osmication)2hr之前和之后将样品用二甲胂酸钠缓冲液洗涤，用鞣酸处理，用乙酸铀酰染色，通过分级系列的乙醇溶液脱水，并嵌入TABB环氧树脂(Agar Scientific Ltd.)中。将超薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并使用JEM-2000EXII(JEOL,Tokyo)检查。囊泡颗粒的成像参考先前所述(K.A.D’Amour等人.,Nat.Biotech.23,1534-1541(2005))。

统计分析

所有实验均一式三份进行并重复两次或如所指示的进行。从Western印迹、qPCR、萤光素酶试验和流式细胞术获得的数据通过Student t检验进行计算。p-值<0.05被认为是统计上显著的。

表S1.本研究中使用的抗体

本文公开的一个或多个实施方案、实例或方面在合适时可以与本文公开的任何其他实施方案、实例或方面结合。

尽管本文中已经示出并描述了一些实施方案，但这些实施方案仅以示例的方式提供。在不偏离本发明的情况下可以进行多种变化、改变和替代。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。