MYADM靶向的siRNA及其应用
阅读说明：本技术 MYADM靶向的siRNA及其应用 (MYADM targeted siRNA and application thereof ) 是由 杨秋星 张金业 郭丽媛 沈爱国 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了MYADM靶向的siRNA及其应用,属于分子生物技术与基因工程技术领域。本发明提供抑制MYADM基因表达的小干扰RNA及其应用,通过在食管癌细胞中转染该小干扰RNA,能调控和干扰MYADM基因表达,降低细胞克隆形成能力,抑制细胞伤口愈合和侵袭；因此抑制MYADM基因表达的小干扰RNA,通过降低MYADM的表达,能有效抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭。本发明为食管癌治疗提供了一个新的潜在药物,具备很高的临床实际应用前景和价值。(The invention discloses MYADM targeted siRNA and application thereof, and belongs to the technical field of molecular biotechnology and genetic engineering. The invention provides a small interfering RNA for inhibiting MYADM gene expression and application thereof, and the small interfering RNA is transfected in esophageal cancer cells, so that MYADM gene expression can be regulated, controlled and interfered, the cell clone formation capacity is reduced, and wound healing and invasion of cells are inhibited; therefore, the small interfering RNA for inhibiting the expression of MYADM gene can effectively inhibit the proliferation, migration and invasion of esophageal cancer cells by reducing the expression of MYADM. The invention provides a new potential medicine for treating esophageal cancer, and has very high clinical practical application prospect and value.)
技术领域
本发明属于分子生物技术与基因工程技术领域，更具体地说，涉及MYADM靶向的siRNA及其应用。
背景技术
食管癌是世界范围内的主要公共卫生问题，也是最具侵袭性的恶性肿瘤之一。尽管近年来已经取得了相当大的诊断和治疗进展，但由于转移和侵袭率高，食管癌患者的预后仍然很差。研究转移和侵袭相关基因对食管癌细胞增殖和转移的作用，对改善食管癌患者的预后都有重要理论意义和应用价值。
RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，应用RNAi技术特异性地向哺乳动物和人类的细胞中导入小干扰RNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，可以达到高效特异性的基因治疗作用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种MYADM靶向的siRNA。本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述MYADM靶向的siRNA在制备用于治疗食管癌的药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种MYADM靶向的siRNA分子，是核酸序列如下的双链RNA分子：
正义序列：5′-CGGCGAGAUCACUGGCUAUdTdT-3′，
反义序列：5′-AUAGCCAGUGAUCUCGCCGdTdT-3′。
所述的MYADM靶向的siRNA分子在制备抗食管癌药物中的应用。
所述的应用中，所述的抗食管癌药物是降低食管癌细胞克隆形成能力的药物。
所述的应用中，所述的抗食管癌药物是降低食管癌细胞伤口愈合能力的药物。
所述的应用中，所述的抗食管癌药物是抑制食管癌细胞侵袭相关基因表达的药物。
所述的应用中，所述细胞侵袭相关基因为cadherin基因、N-cadherin基因、Vimentin基因或snail基因。
一种抗食管癌药物，含有所述MYADM靶向的siRNA分子。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明采用免疫组织化学染色技术检测食管癌中MYADM基因的表达情况，发现MYADM蛋白在食管癌组织中的表达显著高于非癌组织。随后本发明针对MYADM基因设计了三种小干扰RNA，通过实验发现，其中一种小干扰RNA，转染食管癌细胞ECA109后，能有效调控和干扰MYADM基因表达，从而降低食管癌细胞克隆形成能力，抑制食管癌细胞伤口愈合和侵袭；因此该MYADM基因靶向的小干扰RNA，具有降低MYADM的表达，有效抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的功能。本发明为食管癌治疗提供了一个新的基因靶点和药物，具备很高的临床实际应用价值。
附图说明
图1为食管癌及癌旁组织中MYADM表达水平结果图；
图2为siRNA干扰MYADM效率鉴定的蛋白免疫印迹实验结果图；
图3为siRNA干扰MYADM表达的细胞克隆形成实验结果图；
图4为siRNA干扰MYADM表达的细胞Transwell实验结果图；
图5为siRNA干扰MYADM表达的细胞划痕实验结果图；
图6为siRNA干扰MYADM表达的细胞相关基因表达的蛋白免疫印迹实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行，或按照试剂盒的说明书操作步骤进行。
实施例1：免疫组织化学染色获得MYADM基因在食管癌患者组织中的表达情况
免疫组织化学染色步骤：取多聚甲醛固定后的食管癌组织，进行石蜡包埋，连续切片，压在载玻片上；将免疫组化片，放在80℃烘箱内，烘片30min；在二甲苯I和二甲苯II中各浸泡15min；然后依次放入无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各2min；最后将片子放入超纯水中浸泡清洗；将片子放在EDTA抗原修复液中，高压锅煮至冒气后，继续加热3min，离开热源，打开高压锅盖并冷却；PBST冲洗3次后，使用免疫组化笔圈出组织，再用H2O2室温孵育20min；用抗体稀释液稀释一抗，4℃孵育过夜；第二天，室温复温30min；PBST冲洗3次后，孵育二抗20min；PBST小心冲洗后，用DAB显色，观察颜色变化，当显示棕色时，用自来水终止反应；苏木精染色30s，自来水冲洗，显微镜下观察，若染色不深，可重复苏木精染色；然后依次放入梯度乙醇浸泡4min，再放入二甲苯I和二甲苯II各浸泡10min。中性树脂封片，通风橱晾干后，显微镜下观察拍照。如图1所示，可以发现MYADM蛋白在食管癌组织中的表达明显高于癌旁组织。
实施例2：MYADM小干扰片段的设计
针对MYADM基因设计三种siRNA序列，由和元生物技术(上海)股份有限公司合成。
siRNA-1的碱基序列如下，
正义序列：5′-CGGCGAGAUCACUGGCUAUdTdT-3′，
反义序列：5′-AUAGCCAGUGAUCUCGCCGdTdT-3′；
siRNA-2的碱基序列如下：
正义序列：5′-UCUACCAGUUCGAUGAGAAdTdT-3′，
反义序列：5′-UUCUCAUCGAACUGGUAGA dTdT-3′
siRNA-3的碱基序列如下：
正义序列：5′-GGCAACUGGUCCAUGUUCAdTdT-3′，
反义序列：5′-UGAACAUGGACCAGUUGCCdTdT-3′
实施例3：MYADM小干扰片段的筛选
细胞培养条件及培养基：Eca109细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640(HyCloneSH30809.01)培养在5％CO2，37℃的培养箱中。
细胞转染：按说明书分别将siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3稀释成20μM溶液待用；将细胞消化后，铺在6孔板中，当细胞密度汇合到30-50％时进行转染；准备四个无菌1.5mL的EP管，分别在四个EP管中加入OPTI-MEM 200μL和对应的siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及阴性对照siRNA溶液5μL快速涡旋10s使其完全混匀；再分别向4个EP管中加入6μL siRNA-Mate转染试剂，室温静置10min，使siRNA和转染试剂形成转染复合物，再加入6孔板对应的孔中，轻晃摇匀；2天后，免疫印迹法验证敲低效率以及进行细胞功能实验。如图1所示。
蛋白表达量的结果如图2所示，可以看出，与对照组比较，转染小干扰siRNA1(siRNA-1)、小干扰RNA2(siRNA-2)和小干扰RNA3(siRNA-3)的实验组的MYADM蛋白的表达量都降低，从蛋白的相对表达量能清楚得看出，转染小干扰siRNA-1的实验组对MYADM蛋白表达的干扰最大，效果最好。因此可以将干扰MYADM基因表达的siRNA-1应用在干扰MYADM基因表达中，用于后续实施例。
实施例4：MYADM小干扰片段抑制食管癌转移和侵袭的检测细胞学实验
1、克隆形成实验证明siRNA-1干扰MYADM导致细胞水平的抗肿瘤效应
将500个细胞/孔的细胞悬液放入6cm的培养皿中。在37℃孵箱中用3mL培养液培养细胞。培养细胞培养2周后，用PBS温和洗涤，福尔马林固定，0.1％结晶紫染色，测定克隆形成率。如图3所示。a图为克隆形成实验的细胞状态，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109增殖能力明显减弱，b图为克隆形成实验的统计学结果，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109数量明显下降，该克隆形成实验结果有统计学意义p＜0.05。结果表明，MYADM小干扰RNA干扰的实验组与NC组相比，细胞克隆数显著降低(p＜0.05)，表明MYADM能够促进大鼠ECA109细胞克隆形成，即通过小干扰siRNA-1转染ECA109干扰MYADM基因，能抑制细胞的克隆形成。
2、Transwell分析实验证明MYADM小干扰片段siRNA-1细胞水平的抗肿瘤效应
先准备24孔板，将小室移至24孔板内；细胞侵袭实验，基质胶需要提前一天从-20℃放入4℃冰箱，24孔板、枪头、小室都需要提前预冷，所有操作都需在冰上进行；将转染后的细胞从6孔板中消化下来，离心后，弃去上清，留细胞沉淀；加入1mL PBS重悬，离心；再加入1mL PBS重悬，离心，弃上清；加入少些基培重悬，然后取200μL体积内含5×105个细胞，置于孔径为8um的Transwell室中，进行或不进行Matrigel处理，并在下部隔室中装入1640含10％FBS的培养基500μL。温育24小时后，移去上腔室细胞悬液，用4％多聚甲醛将下腔室膜上的细胞固定30min，然后用结晶紫染色5min。用显微镜随机选择5个视野来计数迁移或侵袭细胞。结果如图4所示，a图为迁移实验的细胞状态，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109迁移能力明显减弱，b图为迁移实验的统计学结果，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109数量明显下降，该迁移实验结果有统计学意义p＜0.05，c图为侵袭实验的细胞状态，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109侵袭能力明显减弱，d图为侵袭实验的统计学结果，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109数量明显下降，该侵袭实验结果有统计学意义p＜0.05。
结果表明，MYADM小干扰RNA干扰的实验组与NC组相比，迁移和侵袭的细胞数显著降低(p＜0.05)，表明MYADM能够促进大鼠ECA109细胞迁移和侵袭，即通过小干扰siRNA-1转染ECA109干扰MYADM基因，能抑制细胞的迁移和侵袭。
3、划痕实验证明MYADM小干扰片段siRNA-1在细胞水平的抗肿瘤效应
每组细胞接种于约90％融合的6孔板中。用一个200μL的吸管尖端划痕制造了对称的伤口。用PBS洗涤两次后，用无血清DMEM培养液孵育24h。分别于拔除伤口后0h和24h拍摄移行照片。结果如图5所示，a图为划痕实验的细胞状态，划痕后培养48h，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109伤口没有明显愈合，伤口愈合能力明显减弱，b图为划痕实验的统计学结果，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109伤口愈合率明显下降，该划痕实验结果有统计学意义p＜0.05。
4、免疫印迹实验证明MYADM小干扰片段siRNA-1在蛋白水平的抗肿瘤效应
从si-control组，si-MYADM组两组细胞，吸去培养液，置于冰上。加入1mL 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。然后将六孔板置于冰上，用移液管反复清洗两次。按1mL裂解液加10μL PMSF(100mM)摇匀置于冰上。在细胞培养板每个孔中加入150μL含PMSF的裂解液，然后于冰上裂解5分钟之后，使用刮板来回刮细胞，使细胞充分裂解。
BCA定量法测定蛋白含量，使用前面已经标记提取好的细胞蛋白，然后在4度离心机下离心，弃去下层沉淀后重新标记每管。从负20度冰箱拿出loading buffer，使其在室温融化，然后向每管标记好的细胞蛋白溶液加入loading buffer 50μL。提前使恒温干式煮蛋白机器加热至100度，将混匀的细胞蛋白溶液于恒温干式煮蛋白机器孵育10分钟使其变性。应用标准曲线计算待测样本的浓度，测量三次后取其平均值。
SDS-PAGE电泳，将配胶使用的玻璃板清洗干净，然后验漏5分钟。按照一定比例配置10％的下层胶。然后使用移液枪灌胶，在此过程中注意不要有气泡，然后用乙醇进行封压，凝30分钟。用自来水轻轻洗去封压的乙醇，清洗不掉的使用吸水纸吸去乙醇，按照一定比例配置上层胶，然后使用移液枪注上层胶，此过程注意也不要有气泡，然后插梳子，凝30分钟。胶凝固之后取胶，注意动作要轻柔，防止板子碎裂，加少量水之后放入袋子中4℃冰箱保存备用，最好是现配现用。
电泳需要提前按照一定比例配置好电泳液(最好现配现用)，后将SDS-PAGE胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。用移液枪贴壁吸取样品，将si-control，si-MYADM组两组样品吸出。使其每个孔道加入总量200ug的蛋白量，将移液枪调至相应体积的刻度，然后加样器针头插入样品中吸取蛋白至加样孔中缓慢加入样品。先把电压设置80V，开始跑胶，当把样品跑至分离胶后把电压增120V，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
按照一定比例配置好转膜液，然后在加有转膜液的盘里放入转膜用的剪刀，刮板，夹子及海绵垫。然后准备好PVDF膜，将PVDF膜依次放入甲醇，ddH2O，转膜液中，滤纸浸入转膜液中。在夹子两面放入各放一张海绵垫，然后将两片滤纸再分别放在海绵垫上面。将板子放入转膜液中，然后使用刮板轻轻撬开两边的玻璃板，然后将上层胶除去不要，轻轻的将胶置于靠黑面的海绵垫上，注意动作一定要轻柔，防止胶破碎，然后将PVDF膜置于胶上，这时可以做好膜正面的标记，之后使PVDF膜和胶对齐，使用刮板轻轻擀去气泡。将夹子放入转膜槽中(转膜的时候会产热，使转膜槽放入冰盆中)，使槽的黑面对着夹子的黑面，使槽的红面对着夹子的白面。使用300mA转90分钟。
将转好的PVDF膜(注意此时可以看到膜上的maker)移至含有牛奶的玻璃皿中，室温下在摇床上摇动封闭2h。TBST洗4次。每次5分钟。将膜按照所需要的目标蛋白所处位置剪切下来并做好标记，加入目标蛋白抗体，然后用封口膜封好之后在4℃过夜。第二天取出膜之后在室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次15分钟。同上方法准备目标蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和snail所对应的二抗放入膜中，β-tublin作内参，在室温下孵育2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次15分钟。
显影时将A液和B液两种试剂在离心管中等体积混合，注意避光。取适量显影液于显影仪台面上，将膜用镊子夹起来正反面充分和显影液接触，注意切角在左上，即正面朝上。
蛋白实验结果如图6所示，E-cadherin(E-cad)、N-cadherin(N-cad)、Vimentin(Vim)和snail蛋白表达量也明显下调；即通过小干扰RNA抑制MYADM基因后，ECA109细胞中转移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和snail表达量随MYADM表达下调而同步下调。因此，可以将小干扰siRNA-1应用到制备抑制细胞迁移和侵袭相关基因表达的靶向药物中。
综合上述来说，本发明实施例提供的抑制MYADM基因表达的小干扰RNA可作为靶向药物，通过小干扰RNA抑制MYADM基因表达，能调控食管癌细胞活力，抑制细胞增殖、细胞迁移和侵袭等，对于临床开发食管癌靶向药物具有较好的应用前景。
序列表
<110> 南通市肿瘤医院
<120> MYADM靶向的siRNA及其应用
<130> 100
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> siRNA-1-F(Artificial)
<400> 1
cggcgagauc acuggcuau 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> siRNA-1-R(Artificial)
<400> 2
auagccagug aucucgccg 19