一种检测细胞色素p450 2c9的近红外型荧光探针及其应用
阅读说明：本技术 一种检测细胞色素p450 2c9的近红外型荧光探针及其应用 (Near-infrared fluorescent probe for detecting cytochrome P4502C 9 and application thereof ) 是由 马骁驰 冯磊 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：一种检测细胞色素P450 2C9的近红外型荧光探针及其应用,其属于生物医药技术领域。该特异性探针底物可用于测定生物体系中CYP2C9的酶活性。CYP2C9酶活性测定的流程如下：选择1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮O-脱烷基反应为探针反应,通过定量检测单位时间内底物1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的消除量或其脱烷基代谢产物的生成量来测定各类生物样品中CYP2C9酶的活性。本发明可用于不同来源、不同种属、不同个体的生物样本中CYP2C9酶活的定量评估以及生物体中CYP2C9的成像,以期实现CYP2C9处置药物能力的评估。还可用于CYP2C9活性调节剂的体外快速筛选,评估药物及候选化合物等由于抑制或激活CYP2C9催化活性而导致药物药物相互作用的潜在性。(A near-infrared fluorescent probe for detecting cytochrome P4502C 9 and application thereof belong to the technical field of biological medicine. The specific probe substrate can be used for measuring the enzymatic activity of CYP2C9 in a biological system. The protocol for measuring CYP2C9 enzyme activity is as follows: selecting 1, 3-dichloro-7-alkoxy-9, 9-dimethyl-2 (9H) -acridone O The dealkylation reaction is a probe reaction, and the activity of the CYP2C9 enzyme in various biological samples is measured by quantitatively detecting the elimination amount of the substrate 1, 3-dichloro-7-alkoxy-9, 9-dimethyl-2 (9H) -acridone or the generation amount of dealkylation metabolites thereof in unit time. The invention can be used for CYP2C9 enzyme in biological samples of different sources, different species and different individualsQuantitative assessment of viability and imaging of CYP2C9 in organisms in an attempt to achieve an assessment of CYP2C9 ability to treat drugs. The method can also be used for in vitro rapid screening of CYP2C9 activity regulators, and evaluating the potential of drug-drug interaction caused by inhibiting or activating CYP2C9 catalytic activity of drugs, candidate compounds and the like.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测细胞色素P450 2C9(CYP2C9)的近红外荧光探针及其应用。
背景技术
细胞色素P450酶是一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白超家族，广泛分布于自然界。在人体内，可介导如脂肪酸、甾体类激素及胆固醇等内源物的生物转化，在药物、致癌物、环境污染物等外源物质的代谢清除或生物激活中亦发挥着重要作用。
CYP2C9是细胞色素P450超家族中的一员，主要分布于肝脏、肠道等人体重要代谢器官中。据统计，CYP2C9参与超过20％的临床常用药物(大于100种)的代谢，如苯妥英、华法林、甲苯磺丁脲、格列吡嗪、双氯芬酸和洛沙坦等均是CYP2C9的底物(Curr Med Chem.2011,18:667-713)。由于CYP2C9底物非常广泛，临床上常常会出现共服药物通过调节CYP2C9活性而诱发药物药物相互作用的情况。值得注意的是，CYP2C9可介导苯妥英、华法林、甲苯磺丁脲等窄治疗窗药物的代谢清除(Drug Metab Dispos.1996,24:1401-1403；Blood.2018,132:2230-2239；Drug Metab Dispos.2000,28:354-359)。由此，共服药物对CYP2C9代谢的抑制作用就极有可能导致药物暴露水平增高而诱发严重的药物毒副作用。因此，CYP2C9的催化能力与药物的安全使用息息相关。而CYP2C9在生物样本和生物体中的实时活性检测有助于准确表征CYP2C9的酶活性变化水平，对CYP2C9介导的药物代谢情况及药物药物相互作用潜在性进行定量定性评估。
荧光分子成像技术具有生物体系干扰度低、可实时成像、与高通量检测设备相匹配等特点，在生物样本的体外检测和生物靶点的在体检测方面的应用日益突出。因此，开发高选择性的CYP2C9的近红外荧光探针及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测细胞色素P450 2C9(CYP2C9)的近红外型荧光探针及其应用，该近红外型荧光探针底物没有荧光，脱烷基产物激发后可在近红外区域发射荧光。利用该探针反应可对多种生物体系或生物体中CYP2C9的表达和功能水平进行定量评价。
本发明提供了一种检测CYP2C9的近红外型荧光探针，该探针可被CYP2C9特异性催化生成相应的脱烷基产物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮，其结构通式如式(1)所示，1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类结构，其结构通式如下：
其中，R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环丁基、异丁基、正戊基、环戊基、苯基、苄基。
本发明中1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物具有代谢酶高选择性(主要由CYP2C9代谢激活)，代谢产物易于检测、且灵敏度高等特点。
本发明还提供了所述检测CYP2C9的近红外型荧光探针，采用上述式(1)化合物作为CYP2C9酶的特异性底物，进行酶促反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其脱烷基产物的生成率或荧光成像信号的变化，来定量测定不同生物体系(包括重组表达酶、人或动物组织制备品、各类细胞及制备品等生物样品)中CYP2C9活性；具体测定方法为：
——体系中以1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物作为近红外型探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；单点测定时底物浓度优选Km。
——在含有NADPH的缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH 7.4为反应pH值；
——反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的脱烷基产物达到定量限，且底物转化率不超过20％时终止反应；
——测定单位时间内的脱烷基产物生成量(底物减少量)或荧光成像信号的变化作为CYP2C9活性的评价指标。
本发明提供的CYP2C9近红外型荧光探针及其应用，该探针底物没有荧光，其脱烷基产物具有近红外荧光属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；脱烷基产物荧光检测条件分别为：激发波长600nm，发射波长为630-690nm。
该特异性探针底物为近红外型荧光探针，其在CYP2C9活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组CYP2C9酶、人及动物细胞、组织制备品中CYP2C9酶活力的定量测定；同时也可作为在体及动物整体CYP2C9的探针底物，评估代谢酶CYP2C9的个体及种属差异。该探针底物及脱烷基代谢产物的荧光检测方法，还可用于CYP2C9活性调节剂(抑制剂或激活剂)的快速筛选及调节能力的定量评价。
通过相关性分析，重组单酶代谢反应，特异性抑制等实验，证明1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物可特异性的经CYP2C9转化而生成脱烷基产物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮。
作为CYP2C9高特异性的近红外荧光探针底物，该化合物可以用来检测各种克隆表达体系中，多种哺乳动物来源的组织切片、细胞、微粒体、S9等制备物中CYP2C9的活性标定。
选用本发明所述CYP2C9的近红外型荧光探针反应检测CYP2C9酶活性具有以下突出优势：
(1)高特异性：1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物可被CYP2C9高特异性地代谢成一个代谢产物，即脱烷基产物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮。
(2)廉价易得：1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。
(3)高灵敏度：具有1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物脱烷基产物具有良好的荧光光谱特性，激发后可在近红外区域发射荧光，能很好的减少生物体系中的背景荧光干扰。
附图说明
图1. 1,3-二氯-7-烷氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物的结构通式。
图2. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的1H-NMR谱图。
图3. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的13C-NMR谱图。
图4. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的高分辨质谱图。
图5. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的人CYP重组单酶筛选试验结果
图6. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的人肝微粒体活性测试结果
图7.CYP2C9蛋白浓度标准曲线
图8.细胞激光共聚焦成像图。
图9.CYP2C9活性调节剂高通量筛选。
图10. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的合成路线。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1. 1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮
将61.6mg(0.2mmol)的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮溶于30mL乙腈中，加入69.5mg(0.5mmol)的碳酸钾和31μL(0.5mmol)碘甲烷，加热回流8小时后冷却至室温，过滤，减压蒸馏除去乙腈，将剩余固体溶于二氯甲烷，用硅胶薄层层析色谱分离，展开剂为二氯甲烷：正己烷＝1:1(体积比)，得到15.6mg橘黄色固体为1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮。通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱以及高分辨质谱表征，数据如下：1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.63(s,1H),7.61(d,J＝8.7Hz,1H),7.00(d,J＝2.7Hz,1H),6.92(dd,J＝8.7,2.7Hz,1H),3.92(s,3H),1.88(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ173.22,163.06,147.47,140.66,139.44,136.62,135.86,134.47,134.14,113.13,112.94,55.80,39.15,26.82.HRMS(ESI positive)理论值[M+H]+322.0396，实测值322.0395。
注：1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的1H-NMR谱图、13C-NMR谱图以及高分辨质谱谱图如图2、3、4所示。
实施例3.人重组CYP单酶孵育实验
(1)预先准备CYP代谢反应孵育液，包括pH 7.4的磷酸缓冲液(100mM)、人重组CYP单酶，1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮浓度为10μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入20μL浓度为10mM的NADP+溶液起始反应；
(3)反应30分钟后，加入100μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)样品于4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(Ex＝600nm，Em＝658nm)。
实施例4.不同来源个体人肝微粒体中CYP2C9的活性定量评估
(1)选取多例个体人肝微粒体(HLM)，加入反应体系中进行体外孵育实验。孵育体系包括pH 7.4的磷酸缓冲液(100mM)、人肝微粒体、6-磷酸葡萄糖(10mM)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1unit/mL)、MgCl2(4mM)、1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(10μM)，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入20μL浓度为10mM的NADP+起始反应；
(3)30分钟后，加入100μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)于4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(Ex＝600nm，Em＝658nm)，测得HLM催化1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮脱烷基反应的速率(图6)。
实施例5.CYP2C9蛋白浓度标准曲线测定
孵育体系包括pH 7.4的磷酸缓冲液(100mM)、人肝微粒体、6-磷酸葡萄糖(10mM)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1unit/mL)、MgCl2(4mM)、1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(10μM)，以及CYP2C9单酶1.25pmol/mL～12.5pmol/mL。于37℃下孵育30min，借助酶标仪进行荧光检测(Ex＝600nm，Em＝658nm)，获得脱烷基产物的荧光强度与CYP2C9蛋白浓度的标准曲线(图7)。
实施例6.细胞激光共聚焦成像图
LoVo和HepG2细胞于RPMI-1640培养基中培养，以1×105的细胞密度种于六孔板中，在37℃、5％CO2条件下孵育过夜。弃掉悬浮细胞后，加入探针底物1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮，于37℃条件下孵育1小时。随后用磷酸缓冲溶液清洗残余探针，并借助激光共聚焦显微镜拍照(Ex＝633nm，Em＝650-690nm)。(图8)
实施例7.CYP2C9活性调节剂的高通量筛选研究
(1)利用人肝微粒体、重组单酶等酶源进行体外孵育实验。孵育体系包括pH 7.4的磷酸缓冲液(100mM)、6-磷酸葡萄糖(10mM)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1unit/mL)、MgCl2(4mM)、1,3-二氯-7-甲氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(10μM)。将预筛选的化合物与孵育体系充分混匀，加入96孔板，并于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入20μL浓度为10mM的NADP+起始反应；
(3)30分钟后，加入100μL冰乙腈，终止反应；
(4)借助多光谱激光成像仪进行荧光检测(Ex＝635nm，Em＝670nm)，测得各孔样品的荧光强度(图9)。
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