一种适配体dna-荧光探针传感器及其制备方法和利用其定量检测gtx1/4的方法
阅读说明：本技术 一种适配体dna-荧光探针传感器及其制备方法和利用其定量检测gtx1/4的方法 (Aptamer DNA-fluorescent probe sensor, preparation method thereof and method for quantitatively detecting GTX1/4 by using aptamer DNA-fluorescent probe sensor ) 是由 王广凤 戴天玥 盛祝涛 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于GTX1/4检测的适配体DNA-荧光探针传感器及其制备方法和利用其定量检测GTX1/4的方法；所述制备方法包括以下步骤：首先制备双链S1-Spc溶液；将HKUST-1以甲醇蒸汽熏蒸7h,得到HK-7；将双链S1-Spc溶液与HK-7的分散液混合后稀释,进行震荡培养；向上述溶液中加入DNA S2溶液,震荡培养得到装载有S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液,即为用于GTX1/4检测的适配体DNA-荧光探针传感器；根据本发明的方法构建的适配体DNA-荧光探针传感器,仅利用适配体DNA与荧光探针的识别作用即可实现对于GTX1/4的定量检测,其操作简单,灵敏度高。(The invention discloses an aptamer DNA-fluorescent probe sensor for GTX1/4 detection, a preparation method thereof and a method for quantitatively detecting GTX1/4 by using the same; the preparation method comprises the following steps: firstly, preparing a double-chain S1-Spc solution; fumigating HKUST-1 with methanol vapor for 7h to obtain HK-7; mixing the double-chain S1-Spc solution with the dispersion liquid of HK-7, diluting, and performing shake culture; adding a DNA S2 solution into the solution, and performing shake culture to obtain an HK-7 solution loaded with an S1-Spc double chain and an S2 single chain, namely the aptamer DNA-fluorescent probe sensor for GTX1/4 detection; the aptamer DNA-fluorescent probe sensor constructed by the method can realize quantitative detection of GTX1/4 only by utilizing the recognition effect of the aptamer DNA and the fluorescent probe, and has simple operation and high sensitivity.)
技术领域
本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种适配体DNA-荧光探针传感器及其制备方法和利用其定量检测GTX1/4的方法。
背景技术
膝沟藻毒素1/4(GTX1/4)是麻痹性贝类毒素中最具代表性的神经毒素，因该类毒素导致的消费者中毒死亡事件在我国沿海地区具有广布性和高发性。近年来，对GTX1/4的定量检测收到越来越多人的关注。
GTX1/4所属的麻痹性贝类毒素是全球三大海洋生物危害之一。人们误食了含有此类毒素的食物会造成因钠离子通道活性降低而导致的神经传导衰弱。中毒严重者会因其强烈的毒性迅速死亡。
对GTX1/4定量检测的研究，目前的研究方法主要局限在等速电泳法、毛细管电泳法、液相色谱以及酶链免疫吸附实验(ELISA)等。但是，这些等量检测 GTX1/4的方法，其精细的操作步骤对于实验人员的操作技巧要求较高，难以普及，这样限制了对GTX1/4定量检测的推广和普及。
因此，有关GTX1/4的定量检测已经成为食品环境检测的研究热点，能够实现对GTX1/4的操作简便、灵敏度高的定量检测是当下需要解决的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于GTX1/4检测的适配体DNA- 荧光探针传感器及其制备方法和利用其定量检测GTX1/4的方法。根据本发明的方法构建的适配体DNA-荧光探针传感器，仅利用适配体DNA与荧光探针的识别作用即可实现对于GTX1/4的定量检测，其操作简单，灵敏度高。
本发明采取的技术方案为：
一种用于GTX1/4检测的适配体DNA-荧光探针传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将等体积等浓度的DNA S1溶液、DNA Spc溶液混合后稀释，进行加热反应，冷却后得到双链S1-Spc溶液，所述DNA S1、DNA Spc的基因序列分别为：
DNA S1:3’-CCTTAATGGATTGGAGTTCCTC-5’-6-FAM；DNA S1上带有荧光基团；
DNA Spc:Dabcyl-3’-GAGGATTTCCAATCC-5’；DNA Spc上带有淬灭基团，且DNA S1与DNA Spc的基因序列可部分配对；
(2)将金属框架化合物HKUST-1以甲醇蒸汽熏蒸7h，得到HK-7；
(3)将双链S1-Spc溶液与HK-7的分散液混合后稀释，进行震荡培养；
(4)向步骤(3)得到的溶液中加入DNA S2溶液，震荡培养得到装载有 S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液，即为用于GTX1/4检测的适配体DNA-荧光探针传感器S1-Spc/S2/HK-7；
所述DNA S2的基因序列为：3’-GAGGAACTCCAATCC-5’；DNA S2的基因序列与DNASpc的基因序列大部分重合。
所述的用于GTX1/4检测的配体DNA-荧光探针传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将等体积等浓度的DNA S1溶液、DNA Spc溶液混合后稀释至DNA S1 的浓度为3μM，95℃加热反应5min，冷却后得到双链S1-Spc溶液；
(2)将金属框架化合物HKUST-1以甲醇蒸汽熏蒸7h，得到HK-7；
(3)将20μL双链S1-Spc溶液与10μL 20mg/mL的HK-7的分散液混合后稀释至总体积200μL，37℃震荡培养3h；
(4)向200μL步骤(3)得到的溶液中加入10μL 4μM DNA S2溶液，37℃震荡培养2h，得到装载有S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液，即为用于GTX1/4 检测的适配体DNA-荧光探针传感器S1-Spc/S2/HK-7。
所述DNA S1溶液、DNA Spc溶液、DNA S2溶液、HK-7的分散液是通过分别将DNA S1、DNA Spc、DNA S2、HK-7溶解在PH＝8.0的含有40mM Tris、 1mM EDTA、12.5mM乙酸镁的TAE/Mg2+缓冲溶液中得到。
所述DNA S1溶液、DNA Spc溶液、DNA S2溶液的浓度分别为10μM、10μM、 4μM。
所述步骤(1)、(3)中，稀释所用的溶液均为PH＝8.0的含有40mM Tris、 1mM EDTA、12.5mM乙酸镁的TAE/Mg2+缓冲溶液。
步骤(2)中，所述HK-7的制备方法包括以下步骤：
(a)将1,3,5-苯三甲酸(1,3,5-BTC)溶解于等体积混合的15mL乙醇与 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中，1,3,5-BTC的终浓度为0.15862M；
(b)将三水合硝酸铜固体溶解于超纯水中配置成0.5M的硝酸铜溶液；
(c)将30mL步骤(a)获得的溶液与15mL步骤(b)获得的溶液混合并加入容量为100mL的反应釜中，反应釜放入烘箱，100℃下反应10h；
(d)待步骤(c)中的反应结束后，移去该反应的上清液，得到的固体分别与30mL的DMF、二氯甲烷进行24h的溶剂交换，最后的产物为HKUST-1，又记作HK-0；
(e)取0.1g HKUST-1，放在搭建在容量为100mL的反应釜中的一个平台上，并在反应釜底部加入10mL甲醇溶液，反应釜中的甲醇溶液与搭建的平台不接触，与HKUST-1不接触，将装有反应物的反应釜放入烘箱于180℃下反应7h；
(f)待步骤(e)中的反应结束后，取出反应釜并快速冷却至室温，快速移出反应平台上的产物并收集，记为HK-7，其平均孔径为2.0～3.0nm。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的用于GTX1/4检测的配体DNA- 荧光探针传感器。
本发明还提供了所述的用于GTX1/4检测的配体DNA-荧光探针传感器在定量检测GTX1/4浓度中的应用。
本发明还提供了一种GTX1/4的定量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
A、重复上述制备方法中的步骤(1)～(4)；
B、将DNA apt溶液加热后冷却，再与等体积等浓度的DNA Inducer溶液混合后稀释，得到部分配对的双链apt-In溶液；
所述DNA apt、DNA Inducer的基因序列分别为：
DNA apt：
DNA apt中的五个碱基可与DNA Inducer中的五个碱基进行配对形成部分配对的双链apt-In。
DNA Inducer：3’-TCCAATCCATTAAGG-5’；DNA apt的基因序列可与DNA Inducer的基因序列部分配对形成部分配对的双链apt-In；
C、将部分配对的双链apt-In溶液与不同浓度的GTX 1/4溶液混合，孵育，然后加入到装载有S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液中，静置反应；
D、在475nm的激发波长下测试各反应体系的荧光强度，以GTX1/4溶液的浓度C为横坐标，520nm处的荧光强度I为纵坐标构建线性曲线，进而得出线性方程，根据线性方程即可得到任意荧光强度I下所对应的待测GTX1/4溶液的浓度。
所述检测方法具体包括以下步骤：
A、重复上述制备方法中的步骤(1)～(4)；
B、将DNA apt溶液95℃加热5min后冷却至室温，再与等体积等浓度的 DNAInducer溶液混合后稀释至两者浓度均为4μM，室温下静置1h，得到部分配对的双链apt-In溶液；
C、分别将5μL部分配对的双链apt-In溶液与不同浓度的GTX 1/4溶液混合， 37℃下反应1h，然后分别加入到200μL装载有S1-Spc双链与S2单链的HK-7 溶液中，静置15min；
D、在475nm的激发波长下测试各反应体系的荧光强度，以GTX1/4溶液的浓度C为横坐标，520nm处的荧光强度I为纵坐标构建线性曲线，进而得出线性方程，根据线性方程即可得到任意荧光强度I下所对应的待测GTX1/4溶液的浓度。
GTX 1/4在反应体系中的终浓度分别为100nM、75nM、50nM、25nM、20nM、 15nM、10nM、5nM。
所述线性方程为：I＝31.206×C+1769.323，其线性相关系数为R2＝0.99766，其中C的单位为nM。
所述DNA apt溶液、DNA Inducer溶液、GTX 1/4溶液是通过分别将DNA apt、 DNAInducer、GTX1/4白色粉末溶解在PH＝8.0的含有40mM Tris、1mM EDTA、 12.5mM乙酸镁的TAE/Mg2+缓冲溶液中得到。
所述DNA apt溶液、DNA Inducer溶液的浓度均为10μM。
所述步骤B中，稀释所用的溶液均为PH＝8.0的含有40mM Tris、1mM EDTA、 12.5mM乙酸镁的TAE/Mg2+缓冲溶液。
本发明通过甲醇蒸汽对金属框架化合物HKUST-1的孔径进行调节得到对 DNA装载率较高的载体HK-7材料，载体HK-7与适配体DNA-荧光探针的适配性较好。本发明首先将等体积等摩尔浓度的DNA S1溶液、DNA Spc溶液混合并稀释加热冷却后得到部分配对双链S1-Spc溶液，再将双链S1-Spc、与DNA Spc 序列部分重合的DNA S2修饰到孔径适配的载体HK-7上，进而制备得到DNA apt-荧光探针传感器S1-Spc/S2/HK-7。
再将等体积等摩尔浓度的DNA apt溶液与DNA Inducer溶液混合形成部分配对的双链apt-In溶液，apt-In会识别目标物膝沟藻毒素GTX 1/4，进而apt-In 中的apt会与目标物结合形成G-四联体稳定结构，导致双链被迫解体进而释放出DNA Inducer。由于DNAInducer与DNA S1部分配对且竞争力强于DNA Spc，会先将载体HK-7上修饰的双链S1-Spc拉出，后取代带有猝灭基团的DNA Spc 形成双链S1-In，由于DNA Spc的特殊结构，单链DNASpc会自发形成发夹结构，不再参与与DNA Inducer的竞争。此后，S1-In会将DNA S2从载体中拉出，由于DNA S2的竞争力强于DNA Inducer，于是形成S1-S2结构，释放出的DNAInducer会继续拉出新的双链S1-Spc，以此往复，从而形成循环放大系统。由于 DNA S1上有荧光基团，与猝灭基团分开后会有强烈的荧光产生，且DNA Inducer 的浓度与目标物的浓度为1:1的关系，进而使用荧光分光光度计即可实现对于膝沟藻毒素GTX 1/4浓度的定量检测，该检测方法的灵敏度高，检测限低，且操作方便。
附图说明
图1为本发明构建的适配体DNA-荧光探针传感器检测膝沟藻毒素GTX 1/4 浓度的方法示意图；
图2为HK-0、HK-5、HK-5.5、HK-6、HK-6.5、HK-7.5、HK-8、HK-8.5、 HK-9的粒径分布图；
图3为HK-5、HK-5.5、HK-6、HK-6.5、HK-7.5、HK-8、HK-8.5、HK-9负载DNA S2后的荧光光谱图；
图4为HK-5、HK-5.5、HK-6、HK-6.5、HK-7.5、HK-8、HK-8.5、HK-9负载S1-Spc后的荧光光谱图；
图5为HK-5、HK-5.5、HK-6、HK-6.5、HK-7.5、HK-8、HK-8.5、HK-9对 DNA S2、S1-Spc的装载量图；
图6为实施例2中环境检测传感器a、环境检测传感器b和空白对照c的荧光光谱图；
图7为以膝沟藻毒素GTX 1/4溶液的浓度为横坐标，520nm处荧光强度为纵坐标构建的点阵图。
具体实施方式
实施例1
HK-7的制备方法，包括以下步骤：
(a)将1,3,5-苯三甲酸(1,3,5-BTC)溶解于等体积混合的15mL乙醇与 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中，1,3,5-BTC的终浓度为0.15862M；
(b)将三水合硝酸铜固体溶解于超纯水中配置成0.5M的硝酸铜溶液；
(c)将30mL步骤(a)获得的溶液与15mL步骤(b)获得的溶液混合并加入容量为100mL的反应釜中，反应釜放入烘箱，100℃下反应10h；
(d)待步骤(c)中的反应结束后，移去该反应的上清液，得到的固体分别与30mL的DMF、二氯甲烷进行24h的溶剂交换，最后的产物为HKUST-1，又记作HK-0；
(e)取0.1g HKUST-1，放在搭建在容量为100mL的反应釜中的一个平台上，并在反应釜底部加入10mL甲醇溶液，反应釜中的甲醇溶液与搭建的平台不接触，与HKUST-1不接触，将装有反应物的反应釜放入烘箱于180℃下反应7h；
(f)待步骤(e)中的反应结束后，取出反应釜并快速冷却至室温，快速移出反应平台上的产物并收集，记为HK-7，其平均孔径为2.0～3.0nm。
分别将步骤(e)中的反应时间替换为5.0、5.5、6.0、6.5、7.5、8.0、8.5、 9.0h，分别制备得到HK-0、HK-5、HK-5.5、HK-6、HK-6.5、HK-7.5、HK-8、 HK-8.5、HK-9。
然后分别测试上述HK-5、HK-5.5、HK-6、HK-6.5、HK-7、HK-7.5、HK-8、 HK-8.5、HK-9的BET、装载DNA S2后的荧光光谱图、装载S1-Spc后的荧光光谱图，对DNA S2、S1-Spc的装载量，如图2-5所示。从图中可以看出，HK-7 与DNAS2、S1-Spc的适配性最好，且DNAS2、S1-Spc在HK-7上的装载量最高。
装载DNA S2的方法为：10μL 4μM DNA S2溶液与10μL 20mg/mL的HK-n 的分散液混合后稀释至总体积200μL，37℃震荡培养3h；
装载S1-Spc的方法为：20μL 3μM双链S1-Spc溶液与10μL 20mg/mL的 HK-n的分散液混合后稀释至总体积200μL，37℃震荡培养3h
对DNA S2、S1-Spc的装载量测试方法为：用如下公式计算DNA S2和S1-Spc 在HK-n中的装载率:
ημ是DNA S2或者S1-Spc的装载率，I0是在装载前(与HK-n分散液混合前)DNA S2或S1-Spc溶液的荧光强度，In是在装载后，溶液上清液的荧光强度。
实施例2
一种用于GTX1/4检测的适配体DNA-荧光探针传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将等体积等浓度的DNA S1溶液、DNA Spc溶液混合后稀释至DNA S1 的浓度为3μM，95℃加热反应5min，冷却后得到双链S1-Spc溶液；
(2)将20μL双链S1-Spc溶液与10μL 20mg/mL的HK-7的分散液混合后稀释至总体积200μL，37℃震荡培养3h；
(3)向200μL步骤(2)得到的溶液中加入10μL 4μM DNA S2溶液，37℃震荡培养2h，得到装载有S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液，即为用于GTX1/4 检测的适配体DNA-荧光探针传感器S1-Spc/S2/HK-7。
未验证本实施例制备得到的适配体DNA-荧光探针传感器S1-Spc/S2/HK-7 可用于检测GTX1/4，进行了如下实验：
将DNA apt溶液95℃加热5min后冷却至室温，再与等体积等浓度的DNA Inducer溶液混合后稀释至两者浓度均为4μM，室温下静置1h，得到部分配对的双链apt-In溶液；
所述DNA apt、DNA Inducer的基因序列分别为：
DNA apt：
DNA Inducer：3’-TCCAATCCATTAAGG-5’；
将5μL部分配对的双链apt-In溶液与5μL GTX 1/4溶液混合，GTX 1/4在体系中的终浓度为100nM，37℃下反应1h，然后加入到200μL装载有S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液中，静置15min，记为环境检测传感器a。
反应结束后，移取100μL反应液至微量荧光比色皿中，用荧光分光光度计检测反应液在475nm激发波长下的荧光光谱图，并以步骤(3)得到的装载有 S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液，记为环境检测传感器b、步骤(2)中使用的HK-7的分散液记为空白对照c为对照，结果如图6所示。从图中可以看出，在没有加入目标物GTX1/4溶液之前，装载有S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液在520nm处有很微弱的荧光，该荧光产生于未完全装载在载体HK-7中的S1 所产生，为背景噪音；HK-7的分散液则无荧光产生。
说明，本实施案例构建的用于GTX1/4检测的适配体DNA-荧光探针传感器，在加入目标物GTX1/4后，GTX1/4会与适配体DNA apt结合形成稳定结构，将部分连接的DNAInducer链释放下来，游离的DNA Inducer链会将载体中带有荧光基团的DNA S1不断从载体的束缚中挣脱出来，从而产生荧光，荧光基团FAM 的特征荧光则是在520nm处。
实施例3
GTX1/4的定量检测方法，包括以下步骤：
A、重复实施例2中的步骤(1)～(3)，制备得到装载有S1-Spc双链与S2 单链的HK-7溶液；
B、将DNA apt溶液95℃加热5min后冷却至室温，再与等体积等浓度的 DNAInducer溶液混合后稀释至两者浓度均为4μM，室温下静置1h，到部分配对的双链apt-In溶液；
C、分别将5μL部分配对的双链apt-In溶液与45μL不同浓度的GTX 1/4溶液混合，37℃下反应1h，然后分别加入到200μL装载有S1-Spc双链与S2单链的HK-7溶液中，静置15min；GTX 1/4在反应体系中的终浓度分别为100nM、 75nM、50nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM；
D、在475nm的激发波长下测试各反应体系的荧光强度，以GTX1/4溶液的浓度C为横坐标，520nm处的荧光强度I为纵坐标构建线性曲线，如图7所示，进而得出线性方程，根据线性方程即可得到任意荧光强度I下所对应的待测 GTX1/4溶液的浓度。所述线性方程为：I＝31.206×C+1769.323，其线性相关系数为R2＝0.99766，其中C的单位为nM。
上述参照实施例对一种适配体DNA-荧光探针传感器及其制备方法和利用其定量检测GTX1/4的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。