一种磁固相萃取结合碳点荧光探针检测电子烟中烟碱的方法
阅读说明：本技术 一种磁固相萃取结合碳点荧光探针检测电子烟中烟碱的方法 (Method for detecting nicotine in electronic cigarette by combining magnetic solid phase extraction with carbon dot fluorescent probe ) 是由 徐雪芹 陈志燕 蒋宏霖 孟冬玲 周芸 贾海江 刘会杰 王学杰 于 2021-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种磁固相萃取结合碳点荧光探针检测电子烟中烟碱的方法。本发明采用醋酸铜及邻苯二胺为前驱,以乙醇为溶剂,微波法合成铜/氮掺杂荧光碳点(Cu,N-CDs),在270nm激发波长下,Cu,N-CDs在294nm和580nm出现两个发射峰。基于烟碱与Cu,N-CDs荧光内滤效应,烟碱对两个发射峰均产生荧光猝灭,建立高灵敏、选择性强烟碱检测新方法,检出限为0.060μg/g。样品检测中,结合磁固相萃取吸附基体干扰物质。将本方法应用于电子烟中烟碱的检测分析,结果与色谱方法相符。方法具有灵敏度高、特异性强的特点、操作简单、快速。(The invention discloses a method for detecting nicotine in electronic cigarettes by combining magnetic solid-phase extraction with a carbon dot fluorescent probe. Copper acetate and o-phenylenediamine are used as precursors, ethanol is used as a solvent, a microwave method is used for synthesizing copper/nitrogen-doped fluorescent carbon dots (Cu, N-CDs), and under the excitation wavelength of 270nm, two emission peaks of the Cu and N-CDs appear at 294nm and 580 nm. Based on the fluorescent internal filtering effect of nicotine and Cu, N-CDs, the nicotine generates fluorescent quenching on two emission peaks, a novel high-sensitivity and selective strong nicotine detection method is established, and the detection limit is 0.060 mug/g. In the sample detection, the magnetic solid phase extraction is combined to adsorb matrix interfering substances. The method is applied to detection and analysis of nicotine in the electronic cigarette, and the result is consistent with a chromatographic method. The method has the characteristics of high sensitivity and strong specificity, and is simple and rapid to operate.)
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种磁固相萃取结合碳点荧光探针检测电子烟中烟碱的方法。
背景技术
烟碱，俗名尼古丁，是烟草的主要致瘾成分，是烟草中最主要的生物碱，它约占烟草质量的1.5％，几乎是香烟中总生物碱含量的95％。烟碱盐性质稳定，穿透力强，能在短时间内满足人们对烟碱的需求。烟碱能迅速溶于水及酒精中，通过口、鼻、支气管黏膜，很容易被人体吸收。粘在皮肤表面的尼古丁，可"渗"入人体内。香烟中的尼古丁对人的致死量是50～70毫克，相当于20～25支香烟尼古丁的含量。如果将一支雪茄或三支香烟的尼古丁一次注入人的静脉内，3～5分钟人即可死亡。对昆虫具有杀灭作用。烟碱的检测十分重要。国家烟草行业标准YC/T 468-2013中记载了，用连续流动(硫氰酸钾)法测定烟草及烟草制品的总植物碱。
碳点(CDs)是一种生物相容性好、毒性低或没有毒性的纳米材料，在化学分析、生物成像和光催化等研究领域得到了广泛应用。研究小组之前研究了碳点与金属量子点之间的共振能量转移,基于烟碱能加强金属量子点荧光而建立了烟碱的荧光测定方法,申请了发明专利(201810207247.9)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁固相萃取结合碳点荧光探针检测电子烟中烟碱的方法,利用烟碱对铜/氮掺杂荧光碳点选择性荧光猝灭，建立烟碱荧光检测新方法。本发明采用醋酸铜及邻苯二胺为前驱，以乙醇为溶剂，微波法合成铜/氮掺杂荧光碳点(Cu,N-CDs)，在270nm激发波长下，Cu,N-CDs在294nm和580nm出现两个发射峰。基于烟碱与Cu,N-CDs荧光内滤效应，烟碱对两个发射峰均产生荧光猝灭，建立高灵敏、选择性强烟碱检测新方法，检出限为0.060μg/g。样品检测中，结合磁固相萃取吸附基体干扰物质。将本方法应用于卷烟及电子烟中烟碱的检测分析，结果与色谱方法相符。方法具有灵敏度高、特异性强的特点、操作简单、快速等特点。
一种磁固相萃取结合碳点荧光探针检测烟碱的方法，包括以下步骤：
(1)烟碱工作曲线制作：在10mL具塞比色管中加入50-100μL水溶性铜/氮掺杂荧光碳点，0～100mg/L烟碱标准溶液，用pH 6.5-7.0缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置5-10min，以270nm为激发波长，测定294nm的荧光强度F，F0为烟碱浓度为0的荧光强度，以烟碱浓度为横坐标，(F0-F)/F0为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。
(2)样品处理
①电子烟烟液：将电子烟液与异丙醇水溶液按重量比1：100-150混合，涡旋1-2min，离心分离，上清液定容，得烟碱提取液，其中，异丙醇水溶液重量体积百分浓度为10-15％。
②磁固相萃取：取上述步骤中的烟碱提取液1mL，加入5mL去离子水，加入Fe3O4磁性纳米粒子0.1-0.2mg，涡旋混合30-60秒，通过外加磁铁进行相分离，上清液为烟碱萃取液。
(3)样品测定：在10mL具塞比色管中加入50-100μL水溶性铜/氮掺杂荧光碳点，加入步骤(2)制备烟碱萃取液，用pH 6.5-7.0缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置5-10min，以270nm为激发波长，测定294nm的荧光强度F，计算(F0-F)/F0，代入步骤(1)回归方程，计算样品烟碱含量。
进一步的，所述的铜/氮掺杂荧光碳点由以下方法制备得到：将相同重量的醋酸铜和邻苯二胺溶解于无水乙醇中，待完全溶解后于300℃，2000W条件下微波消解1h，冷却至室温，10000r/min下离心20-25min，上清液0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24-48h，得到铜/氮掺杂荧光碳点；其中醋酸铜、邻苯二胺与无水乙醇重量体积比为1:40-50。
进一步的，所述Fe3O4磁性纳米粒子由以下方法制备得到：首先将1份FeCl2·4H2O和2.5份FeCl3·6H2O分散在10-15份去离子水中。然后在80℃时，N2保护下加入2份2mol/LNaOH。为了使材料粒度均匀，随后加入0.05份十二烷基硫酸钠，搅拌0.5h。用磁铁分离制备的产品，并用去离子水洗涤3～5次，最后在60℃的真空烘箱中干燥。
进一步的，所述的pH 6.5-7.0缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液。
本发明的优点在于：
1.本发明利用烟碱与氮铜掺杂荧光碳点间的荧光内滤效应，烟碱对发射峰产生荧光猝灭，建立高灵敏、选择性强烟碱检测新方法，方法具有灵敏度高、操作简便、特异性强特点。
2、用本发明用到铜氮掺杂碳点合成方法简单、荧光产率高，在270nm激发波长下，铜氮掺杂碳点在294nm和580nm出现两个发射峰，且烟碱对两个发射峰都有荧光猝灭作用，在一定浓度范围都呈线性关系，根据实际样品干扰情况不同，可采用相应发射波长进行测定。
3、样品测定中，利用Fe3O4磁性纳米粒子进行基体干扰的消除，起到了很好的净化作用，提高了检测准确性。
附图说明
图1为实施例1中烟碱对Cu,N-CDs双发射线性荧光猝灭，用于烟碱荧光探针检测。
图2、图3及图4为共存离子及糖类(葡萄糖、麦芽糖及蔗糖)氨基酸(甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸及谷氨酰胺)、有机酸(草酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、没食子酸、均苯三酚酸)及酚类物质对烟碱的影响结果。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
图1为实施例1中烟碱对Cu,N-CDs双发射线性荧光猝灭，用于烟碱荧光探针检测。
图2、图3及图4为共存离子及糖类(葡萄糖、麦芽糖及蔗糖)氨基酸(甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸及谷氨酰胺)、有机酸(草酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、没食子酸、均苯三酚酸)及酚类物质对烟碱的影响结果，从图中可以看出，烟碱对Cu,N-CDs模拟荧光猝灭有较好的选择特异性。
实施例1：
碳量子点的制备
1、铜/氮掺杂荧光碳点的制备：0.5g醋酸铜和0.5g邻苯二胺溶解于20mL无水乙醇，完全溶解后于微波消解仪300℃，2000W条件下，消解1h，冷却至室温，10000r/min下离心20-25min，上清液0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24-48h，得到铜/氮掺杂荧光碳点；
2、Fe3O4磁性纳米粒子制备：首先将3.5g FeCl2·4H2O和8.75g FeCl3·6H2O分散在35mL去离子水中。然后在80℃时，N2保护下加入7.5mL NaOH(2mol/L)。为了使材料粒度均匀，随后加入0.175g十二烷基硫酸钠，搅拌0.5h。用磁铁分离制备的产品，并用去离子水洗涤3～5次，最后在60℃的真空烘箱中干燥。
3、烟碱工作曲线的制作：在10mL具塞比色管中加入50-100μL水溶性铜/氮掺杂荧光碳点，加入0、1、20、40、60、80、100mg/L的烟碱标准溶液0.5mL，用pH 6.5-7.0缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置5-10min，以270nm为激发波长，测定294nm的荧光强度F，F0为烟碱浓度为0的荧光强度，以烟碱浓度为横坐标，(F0-F)/F0为纵坐标，绘制标准曲线，见图1，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1。
4、方法特异性考察：图2、图3是烟碱浓度为20mg/L，K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2 +、Ni2+、Pb2+、Fe2+、Fe3+、Al3+；糖类(葡萄糖、麦芽糖及蔗糖)氨基酸(甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸及谷氨酰胺)、有机酸(草酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、没食子酸、均苯三酚酸)及酚类物质，以上干扰物质浓度为200mg/L，分别加入铜/氮掺杂荧光碳点，仅有烟碱有明显的猝灭作用，其他物质几乎没有猝灭作用，方法具有好的选择特异性。
5、电子烟烟液烟碱含量测定
(1)将电子烟液与异丙醇水溶液按重量比1：100-150混合，涡旋1-2min，离心分离，上清液定容，得烟碱提取液，其中，异丙醇水溶液重量体积百分浓度为10-15％。
(2)电子烟烟液样品处理：称取电子烟烟液0.1g试样，精确至0.0001g，加入10mL体积比为15％的异丙醇水溶液，涡旋混合1min，离心分离，并取离心后的异丙醇水溶液层清液，用去离子水定容于250mL容量瓶中，得烟碱提取液。
(3)磁固相萃取：取上述步骤中的烟碱提取液1mL，加入5mL去离子水，加入Fe3O4磁性纳米粒子0.1-0.2mg，涡旋混合30-60秒，通过外加磁铁进行相分离，上清液为烟碱萃取液。
(4)烟碱测定：在10mL具塞比色管中加入50-100μL水溶性铜/氮掺杂荧光碳点，加入步骤(1)制备烟碱萃取液，用pH 6.5-7.0缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置5-10min，以270nm为激发波长，测定294nm的荧光强度F，计算(F0-F)/F0，代入步骤3回归方程，计算样品烟碱含量为15.3mg/g。
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
实施例2：水果类烟油电子烟烟液中烟碱的测定
1、铜/氮掺杂荧光碳点的制备：同实施例1；
2、Fe3O4磁性纳米粒子制备：同实施例1；
3、烟碱工作曲线的制作：同实施例1；
4、方法特异性考察：同实施例1；
5、电子烟烟液烟碱含量测定将电子烟液与异丙醇水溶液按重量比1：100-150混合，涡旋1-2min，离心分离，上清液定容，得烟碱提取液，其中，异丙醇水溶液重量体积百分浓度为10-15％。
6、电子烟烟液烟碱含量测定
将电子烟液与异丙醇水溶液按重量比1：100-150混合，涡旋1-2min，离心分离，上清液定容，得烟碱提取液，其中，异丙醇水溶液重量体积百分浓度为10-15％。
(1)电子烟烟液样品处理：称取电子烟烟液0.1g试样，精确至0.0001g，加入10mL体积比为15％的异丙醇水溶液，涡旋混合1min，离心分离，并取离心后的异丙醇水溶液层清液，用去离子水定容于250mL容量瓶中，得烟碱提取液。
(2)磁固相萃取：取上述步骤中的烟碱提取液1mL，加入5mL去离子水，加入Fe3O4磁性纳米粒子0.1-0.2mg，涡旋混合30-60秒，通过外加磁铁进行相分离，上清液为烟碱萃取液。
(3)烟碱测定：在10mL具塞比色管中加入50-100μL水溶性铜/氮掺杂荧光碳点，加入步骤(1)制备烟碱萃取液，用pH 6.5-7.0缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置5-10min，以270nm为激发波长，测定294nm的荧光强度F，计算(F0-F)/F0，代入步骤3回归方程，计算样品烟碱含量为11.6mg/g。
实施例3：烟草提取液类烟油电子烟烟碱的测定
1、铜/氮掺杂荧光碳点的制备：同实施例1；
2、Fe3O4磁性纳米粒子制备：同实施例1；
3、烟碱工作曲线的制作：同实施例1；
4、方法特异性考察：同实施例1；
5、样品中烟碱含量测定：同实施例1，测定结果为10.2mg/g。
实施例4：中草药类烟油电子烟烟液中烟碱的测定
1、铜/氮掺杂荧光碳点的制备：同实施例1；
2、Fe3O4磁性纳米粒子制备：同实施例1；
3、烟碱工作曲线的制作：同实施例1；
4、方法特异性考察：同实施例1；
5、电子烟烟液中烟碱含量测定：同实施例1，测定结果为18.1mg/g。
将实施例1-4进行加标回收率及相对标准偏差试验，并将本发明方法与烟草行业标准YC/T 468-2013烟草及烟草制品烟碱的测定方法进行比对，结果见表2。
表2加标回收率及相对标准偏差(n＝5)
由表2结果可知：用本发明磁固相萃取结合碳点荧光探针检测烟碱的方法与YC/T246-2008测定方法相比，结果一致，但因处理步骤少，所用时间短，处理成本低，操作简便，不需要大型仪器设备，更具优势，从高中低加标回收率可以看出，回收高，相对标准偏差2.1-3.6％之间，说明方法具有好的准确度及精密度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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