具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。

作为本发明的一个优选实施例，本发明提供本发明提供了一种胆管癌术后生存预测方法，包括以下步骤：

获取患者术后切除病灶的胆管癌病例标本以及对应的三叶因子家族基因表达水平；其中，所述三叶因子家族基因表达水平为胆管癌术后生存预测预后指标；

将所述三叶因子家族基因表达水平输入至胆管癌预后预测模型中，得到所述胆管癌预后预测模型输出的生存风险评分；其中，所述胆管癌预后预测模型是基于正常样本对应的三叶因子家族基因表达水平和胆管癌样本对应的三叶因子家族基因表达水平训练得到的。

本发明还提供一种试剂盒，用于检测胆管癌测定标志物，所述试剂盒包括试剂盒一液和试剂盒二液，所述试剂盒一液内包含有三叶因子家族抗体，所述试剂盒二液内包含三叶因子家族抗-抗体。

本发明还提供一种试剂盒的应用方法，包括以下步骤：

胆管癌病例标本离体，并对离体的胆管癌病例样本进行低温保护；

石蜡包埋离体的胆管癌病例样本的组织；

组织切片，并将包含有完整组织的载玻片置于40°C水体中；

捞出载玻片并放入37C°C温箱中烘干；

依次将烘干后的载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精试剂中进行脱蜡；

脱蜡后的载玻片在清水中冲洗一段时间，加入3% H₂O₂溶液浸泡10min，然后倒掉3%H₂O₂溶液，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，蒸煮3min，刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，使抗原的位点暴露；

倒掉柠檬酸缓冲液，清水中水洗2次以及磷酸盐缓冲盐溶液中洗2次，擦干组织周围的磷酸盐缓冲盐溶液，马上加上血清，然后放入37°C温箱中30min；

将载玻片取出，用吸水纸擦干血清，加试剂盒一液，于4°C冰箱中保存过夜；

将载玻片从冰箱中取出，放入磷酸盐缓冲盐溶液中洗3次，每次5min，擦干组织周围的磷酸盐缓冲盐溶液后加上试剂盒二液，然后置于37°C温箱中30min；

将载玻片从温箱中取出, 放入磷酸盐缓冲盐溶液中洗3次，擦干组织周围的磷酸盐缓冲盐溶液后加上链霉亲和素-生物素复合物，然后置于37°C温箱中30min；

将片子从温箱中取出, 放入磷酸盐缓冲盐溶液中洗3次，擦干组织周围的磷酸盐缓冲盐溶液后加上显色剂。

将显色后载玻片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中进行复染染色；

将复染后的载玻片置于清水中水洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中；

用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，封好的载玻片后置于通风柜中晾干。

通过该胆管癌术后生存预测方法、试剂盒以及试剂盒的应用方法，通过将TFF作为预测胆管癌患者术后预后的指标，基于获得的TFF基因表达水平，将TFF基因表达水平输入至该方法构建的胆管癌预后预测模型中，得到对应的生存风险评分，可以有效地预测胆管癌患者的生存情况，从而做出对患者最为有利的临床决策。此外，TFF标志物在预测生存方面表现出良好的性能，并且可能是胆管癌患者生存预测的独立预后指标。

下面结合附图对本发明胆管癌术后生存预测方法、试剂盒以及试剂盒的应用方法，的较佳实施例进行说明。

请参阅图1，本发明提供了一种CCA术后生存预测方法，该方法包括以下步骤：

S100、获取患者术后切除病灶的CCA病例标本以及对应的TFF基因表达水平，该方法中TFF基因表达水平为CCA术后生存预测预后指标，即该方法中TFF作为CCA预后测定标志物。

S200、将TFF基因表达水平输入至CCA预后预测模型中，得到CCA预后预测模型输出的生存风险评分。该方法中CCA预后预测模型是基于正常样本对应的TFF基因表达水平和CCA样本对应的TFF基因表达水平训练得到的。

另外，该方法中还可以从肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库中下载多个CCA样本和正常样本的基因表达谱数据，构建CCA离体标本TFF基因差异表达谱，将CCA病例标本对应的TFF基因表达水平与CCA离体标本TFF基因差异表达谱进行比对，同样可以进行患者的生存风险评价，得到生存风险评分。

在该方法中，TFF基因表达水平通过试剂盒检测得到，试剂盒内包含有TFF抗体以及TFF抗-抗体。

因此，该方法中，通过将TFF作为预测CCA患者术后预后的指标，基于获得的TFF基因表达水平，将TFF基因表达水平输入至该方法构建的CCA预后预测模型中，得到对应的生存风险评分，可以有效地预测CCA患者的生存情况，从而做出对患者最为有利的临床决策。此外，TFF标志物在预测生存方面表现出良好的性能，并且可能是CCA患者生存预测的独立预后指标。

可以理解的是，将TFF作为CCA预后测定标志物还可以应用在CCA发生和进展的分子机制中。CCA在其发生发展过程中存在复杂的通路和机制，研究发现的相关基因越来越多，并且其相互间存在交叉网络作用。而目前暂缺乏对TFF在CCA分子机制的研究，因此，TFF作为CCA预后测定标志物可以为后续CCA发生和进展的分子机制研究提供帮助。

可以理解的是，将TFF作为CCA预后测定标志物还可以应用在肿瘤标志物中。肿瘤标志物是能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。现有可用于临床检测的CCA标志物种类有限，且特异度不够，常常不能单独用于CCA疾病的早期诊断、预后判断、治疗监测等作用。因此，TFF作为CCA预后测定标志物可以为临床提供一种新的肿瘤标志物，用于CCA疾病的预后判断等方面。

可以理解的是，将TFF作为CCA预后测定标志物还可以应用在药物靶标中。生物靶向治疗是针对特定的致癌位点（基因片段、抗原/受体或肿瘤微环境），通过设计相关的治疗药物进入特定的致癌位点，使肿瘤细胞特异性死亡，而不伤及正常组织或细胞的干预治疗策略。目前对CCA的靶向治疗大多仍处于实验研究阶段，临床应用较少。因此，TFF作为CCA预后测定标志物可以为CCA的靶向治疗提供新的药物靶标，为后续研究提供方向。

CCA预后预测模型通过以下步骤训练得到：

A100、获取正常样本和CCA样本。

A200、获取正常样本对应的TFF基因表达水平和CCA样本对应的TFF基因表达水平。

A300、将TFF基因表达水平作为训练使用的输入数据，得到用于生成CCA病例标本的生存风险评分的CCA预后预测模型。

本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括用于检测CCA测定标志物，即用于检测TFF基因水平，该试剂盒包括试剂盒一液和试剂盒二液，试剂盒一液内包含有TFF抗体即TFF第一抗体，试剂盒二液内包含TFF抗-抗体即TFF第二二抗，TFF包括TFF1、TFF2和TFF3。

免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是基于抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色来对组织内抗原进行定位、定性、定量的一项技术。根据抗原抗体反应和化学显色原理。从待测组织或细胞中提取蛋白作为抗原，先与一抗结合形成抗原抗体反应物，再与生物素或荧光素标记的二抗反应，通过化学显色可以在显微镜下清晰观察到抗原抗体反应物，从而能在组织切片上确定抗原的分布和含量。该试剂盒是基于现有的成熟的免疫组化技术的基础上，加入了特异性的抗体，即试剂盒一液和试剂盒二液。

请参阅图2，本发明还提供该试剂盒的应用方法，该应用方法包括以下步骤：

A10、标本离体：CCA病例标本离体，并对离体的CCA病例样本进行低温保护。

A20、石蜡包埋：石蜡包埋离体的CCA病例样本的组织。

A30、切片：组织切片，并将包含有完整组织的载玻片置于40°C水体中。在本实施例中，切片的厚度为5µm。

A40、烘干：捞出载玻片并放入37C°C温箱中烘干。

A50、脱蜡：依次将烘干后的载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精试剂中进行脱蜡。步骤A50中，每种试剂中均放入10min。

A60、抗原修复：脱蜡后的载玻片在清水中冲洗一段时间，加入3% H₂O₂溶液浸泡10min，然后倒掉3% H₂O₂溶液，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，蒸煮3min，刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，使抗原的位点暴露。

A70、血清封闭：倒掉柠檬酸缓冲液，清水中水洗2次以及PBS中洗2次，擦干组织周围的PBS，马上加上血清，然后放入37°C温箱中30min。

A80、加第一抗体：将载玻片取出，用吸水纸擦干血清，加试剂盒一液，于4°C冰箱中保存过夜。

A90、加第二抗体：将载玻片从冰箱中取出，放入磷酸盐缓冲盐溶液（PhosphateBuffered Saline，PBS）中洗3次，擦干组织周围的PBS后加上试剂盒二液，然后置于37°C温箱中30min。

A100、加SABC：将载玻片从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，擦干组织周围的PBS后加上链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC），然后置于37°C温箱中30min。

A110、加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。

A120、复染：将显色后载玻片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中进行复染染色。

A130、脱水：将复染后的载玻片置于清水中水洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。步骤A130中，每种试剂中均放入2min。

A140、封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，封好的载玻片后置于通风柜中晾干。再基于IHC，得到CCA病例标本对应的TFF基因表达水平。

在本实施例中，每次清水中水洗以及每次PBS中洗均为5min。

请参阅图3至图10，本发明中收集了121例行肝胆手术治疗，并且术后病理诊断为“CCA”的患者样本。按照本发明提供的试剂盒的应用方法进行了TFF3的免疫组化试验，阳性分布如图3所述。根据结果，绘制了CCA区别表达TFF3的生存曲线图，如图4所示。具体来说通过分别对比不同位置CCA结论，得出TFF3用于ICC疾病预后更加有意义。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围（包括权利要求）被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。