一种茶油饼粕益生菌猪饲料的制备方法
阅读说明：本技术 一种茶油饼粕益生菌猪饲料的制备方法 (Preparation method of tea oil cake meal probiotic pig feed ) 是由 张涛 李逢 陈勇 李艳 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种茶油饼粕益生菌猪饲料的制备方法,包括以下步骤：1)茶油饼粕预处理；2)黑曲霉、枯草芽孢杆菌的活化、扩大培养,制备菌悬液；3)制备含茶油饼粕的固态发酵培养基；4)混合固态发酵：将黑曲霉和枯草芽孢杆菌接种至含茶油饼粕的固态发酵培养基进行发酵降解茶皂素,得到发酵茶油饼粕；5)猪粪便中筛选益生菌；6)制备含发酵茶油饼粕的益生菌固态培养基；7)益生菌固态发酵：将筛选的益生菌接种至益生菌固体培养基发酵培养；8)真空冷冻干燥,得到益生菌猪饲料。利用黑曲霉和枯草芽孢杆菌固态发酵脱脂后的茶油饼粕,并用地衣芽孢杆菌作为益生菌固态发酵发酵茶油饼粕,降解茶油饼粕中的茶皂素,提高猪的生长性能。(The invention discloses a preparation method of tea oil cake meal probiotic pig feed, which comprises the following steps: 1) pretreating tea oil cake; 2) activating and carrying out amplification culture on aspergillus niger and bacillus subtilis to prepare bacterial suspension; 3) preparing a solid fermentation culture medium containing tea oil cake; 4) mixed solid state fermentation: inoculating aspergillus niger and bacillus subtilis to a solid-state fermentation culture medium containing tea oil cake meal to ferment and degrade tea saponin to obtain fermented tea oil cake meal; 5) screening probiotics from pig manure; 6) preparing a probiotic solid culture medium containing fermented tea oil cake meal; 7) solid-state fermentation of probiotics: inoculating the screened probiotics to a probiotic solid culture medium for fermentation culture; 8) and (5) carrying out vacuum freeze drying to obtain the probiotic pig feed. Aspergillus niger and bacillus subtilis are used for solid-state fermentation of the degreased tea oil cake, and bacillus licheniformis is used as probiotics for solid-state fermentation of the tea oil cake to degrade tea saponin in the tea oil cake and improve the growth performance of pigs.)
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，特别涉及一种茶油饼粕益生菌猪饲料的制备方法。
背景技术
茶油饼粕是油茶籽被提取茶油后剩下的饼粕，属于茶油产业的加工副产物。其含有多糖30%-55%，茶皂素10-15%，以及部分粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、氨基酸、微量元素，因此，充分及合理利用茶油饼粕，不仅能产生巨大的经济效益，也能促进茶油产业的发展。
茶油饼粕中的多糖，具有一定的活性，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化等作用，能够作为生物反应调节剂增加体内和体外免疫应答。茶油饼粕中的粗蛋白和粗纤维，直接丢弃是种浪费，此外，茶油饼粕中还含有丰富的钙、镁、铁等微量元素，均可作为饲料的原料，因此，可定向开发功能性饲料。
茶油饼粕中含有10%-15%的茶皂素，其为一种由苷元、糖和有机酸组成的五环三萜类皂苷化合物。茶皂素是一种性能良好的天然表面活性剂，具有抗菌消炎、抑制酒精、灭螺、刺激激素生成等作用。然而，茶皂素由于具有辛、辣、苦味可刺激鼻粘膜，且其含有单宁、植酸等抗生长因子，影响饲料适口性，且过量茶皂素具有溶血作用，但少量的茶皂素类饲料添加剂可调节血压、安定精神及增强免疫力。据研究表明，含1%的茶皂素饲料可直接用于动物生产，不仅不会影响动物的适口性，而且可改善畜禽产品品质，提高饲料消化率，增强动物机体免疫力和抗病力。所以，降解茶油饼粕中的茶皂素成为饲料生产的一大难点。
CN201110231794.9公开了一种采用低水分固态发酵制备油料饼粕蛋白饲料的方法，包括如下步骤：1)菌剂制备：按海藻酸钠溶液与CaCl2溶液的体积比=1∶2-1∶10，用注射器将混合液(菌液+海藻酸钠溶液)注入CaCl2溶液中，固化后用无菌生理盐水洗涤三次，得到微胶囊菌剂；2)饼粕基料混合、发酵：将微胶囊菌剂、油料饼粕和水搅拌混合均匀，在室温下静置发酵24~96h，得到发酵产物；3)采用下述2种方法之一：①烘干：发酵结束后，将发酵产物烘干，得到油料饼粕蛋白饲料；②将发酵结束后的发酵产物直接真空包装，得到油料饼粕蛋白饲料。采用该方法制备饲料时，其未涉及到如何有效降解饼粕中的茶皂素，也未涉及到制备的饲料中茶皂素的含量是多少，其制备的饲料中含有的茶皂素会影响饲料的口感，且不利于动物消化吸收；且该饲料在制备过程中，还需要添加海藻酸钠、氯化钙等试剂制备微胶囊菌剂，不仅操作繁琐，还提高了饲料制备成本，降低了饲料制备效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种制作成本低廉，可大幅度降低茶皂素含量的茶油饼粕益生菌猪饲料的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种茶油饼粕益生菌猪饲料的制备方法，包括以下步骤：1）茶油饼粕预处理；2）黑曲霉、枯草芽孢杆菌的活化、扩大培养，制备黑曲霉菌悬液和枯草芽孢杆菌菌悬液；3）制备含茶油饼粕的固态发酵培养基；4）混合固态发酵：将黑曲霉和枯草芽孢杆菌接种至含茶油饼粕的固态发酵培养基进行发酵降解茶皂素，得到发酵茶油饼粕；5）猪粪便中筛选益生菌，并制备益生菌的种子液和菌悬液；6）制备含发酵茶油饼粕的益生菌固态培养基；7）益生菌固态发酵：将筛选的益生菌接种至含发酵茶油饼粕的益生菌固体培养基发酵培养；8）真空冷冻干燥，得到益生菌猪饲料。
进一步，所述步骤1）的具体操作步骤为：将茶油饼粕烘干后粉碎，再用石油醚脱脂后，待用。
进一步，所述烘干的温度为65℃，烘干时间为24h，茶油饼粕粉碎后过40目筛。
进一步，所述步骤2）中黑曲霉扩大培养的具体操作步骤为：将活化好的黑曲霉菌种接种到黑曲霉液体种子培养基中，恒温摇床培养，备用；所述枯草芽孢杆菌扩大培养的具体操作步骤为：将活化好的枯草芽孢杆菌菌种接种到枯草芽孢杆菌液体种子培养基中，恒温摇床培养，备用。
进一步，所述黑曲霉液体种子培养基的成分为马铃薯培养基（PDA），其制备步骤为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L，在121℃下灭菌30min。
进一步，所述枯草芽孢杆菌液体种子培养基的制备步骤为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，蒸馏水1L，在121℃下灭菌30min。
进一步，所述步骤2）中黑曲霉扩大培养时，培养温度为30℃，培养时间为3d；所述枯草芽孢杆菌扩大培养时，培养温度为30℃，培养时间为2d。
进一步，所述步骤2) 中黑曲霉菌悬液和枯草芽孢杆菌菌悬液的制备步骤为：当扩大培养结束后，将黑曲霉扩大培养后的菌液和枯草芽孢杆菌扩大培养后的菌液分别在4000r/min条件下离心15min，去除上清液，加入10ml 0.9%的生理盐水，旋涡震荡混合均匀，将混合液在4000r/min条件下离心5min，去除上清液，加入0.9%的生理盐水，反复清洗4次，最后用生理盐水补充混匀，以生理盐水作为空白对照，在波长600nm处，以生理盐水调节菌液浓度的吸光度值，控制在0.8，制成黑曲霉菌悬液和枯草芽孢杆菌菌悬液。
进一步，所述步骤3）的具体操作步骤为：将步骤1）预处理后的茶油饼粕100g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、（NH4）2SO4 1g，搅拌均匀后于121℃灭菌30min，所述茶油饼粕的含水量为40%-60%。
优选地，所述茶油饼粕的含水量为50%。
进一步，所述步骤4）的具体操作步骤为：以黑曲霉和枯草芽孢杆菌总接种量为8%-14%，枯草芽孢杆菌菌悬液和黑曲霉菌悬液混合比为2：1-1：2接种至含茶油饼粕的固态发酵培养基中发酵培养。
优选地，所述黑曲霉和枯草芽孢杆菌总接种量为12%，枯草芽孢杆菌菌悬液和黑曲霉菌悬液混合比为1：1。
进一步，所述步骤4）中发酵培养的条件为：发酵时间为3.5-5.5天，发酵温度为28-35℃，每隔12h翻动一次。
优选地，所述步骤4）中发酵培养的条件为：发酵时间为4天，发酵温度为30℃。
进一步，所述步骤5）中筛选的益生菌为地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、产气肠杆菌均有拮抗作用。
进一步，所述步骤6）的具体操作步骤为：将步骤4）制备的发酵茶油饼粕 20g，葡萄糖1-5g，硫酸铵0.5-0.7g，磷酸氢二钠0.15-0.25g，去离子水18ml，pH值7.0，在121℃灭菌20min。
优选地，所述葡萄糖为3g、硫酸铵为0.5g、磷酸氢二钠为0.25g。
进一步，所述步骤7）的具体操作步骤为：以地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的总接种量为3%-4%，地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液混合比为1：3-3：1接种至含发酵茶油饼粕的益生菌固态培养基中发酵培养。
优选地，所述地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的总接种量为3.5%，地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液混合比为1：1。
进一步，所述步骤7）中发酵培养的条件为：发酵时间为28-35℃，发酵时间为60-84h，每隔12h翻动一次。
优选地，所述步骤7）中发酵培养的条件为：发酵时间为30℃，发酵时间为70h。
进一步，所述地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液的制备步骤为：a)种子液制备：分别挑取地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1单菌落于NA液体培养基中，在培养温度为为35℃，转速180r/min，培养时间14h；b）将步骤a）制备的地衣芽孢杆菌CFC-11种子液和地衣芽孢杆菌MR-1种子液分别在4000r/min条件下离心15min，去除上清液，加入10ml 0.9%的生理盐水，旋涡震荡混合均匀，将混合液在4000r/min条件下离心5min，去除上清液，加入0.9%的生理盐水，反复清洗4次，最后用生理盐水补充混匀，以生理盐水作为空白对照，在波长600nm处，以生理盐水调节菌液浓度的吸光度值，控制在0.8，制成地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液。
进一步，所述步骤8）的具体操作步骤为：将步骤7）发酵培养后的发酵物进行真空干燥处理，即得益生菌饲料。
本发明一种茶油饼粕益生菌猪饲料的制备方法的有益效果：
（1）本发明通过利用黑曲霉和枯草芽孢杆菌固态发酵脱脂后的茶油饼粕，可大幅度降解茶油饼粕中的茶皂素，使茶皂素的含量控制在0.5%以内，可直接用于饲料的使用，提高了猪饲料的适口性，有助于饲料的消化吸收，提高猪的生长性能；
（2）本发明采用猪粪便中分离的地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1作为益生菌固态发酵经过黑曲霉和枯草芽孢杆菌发酵后得到的发酵茶油饼粕，其具有抑菌的功能，并且能够调节宿主体内的微生态失调，保持微生物菌落的平衡；在益生菌固态发酵过程中，可产生蛋白酶和纤维素酶等酶类，将大分子营养物质分解成小分子营养物质，增加了饲料的可吸收性；
（3）本发明的制备方法简单、可操作性强、经济和环保性，有效提高了茶油饼粕的利用价值，促进了茶油产业的快速发展。
附图说明
图1—为本发明一种茶油饼粕益生菌猪饲料的制备工艺流程图；
图2—为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的不同总接种量对脱皂率的影响；
图3—为枯草芽孢杆菌和黑曲霉的不同混合比对脱皂率的影响；
图4—为地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的不同总接种量对益生菌的影响；
图5—为地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的不同混合比对益生菌的影响；
图6—为益生菌固态培养基中不同发酵茶油饼粕含量对益生菌的影响。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1
一种茶油饼粕益生菌猪饲料的制备方法，包括以下步骤：
1）茶油饼粕预处理：茶籽饼粕于65℃烘干24h，粉碎过40目筛，利用石油醚脱脂后，待用；
2）黑曲霉扩大培养：将活化好的黑曲霉菌种接种到装有100ml黑曲霉液体种子培养基的250ml三角瓶中在温度为30℃下恒温摇床培养3d；黑曲霉液体种子培养基的成分为马铃薯培养基（PDA），其制备步骤为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L，在121℃灭菌30min；
3）枯草芽孢杆菌扩大培养：将活化好的枯草芽孢杆菌菌种接种到装有100ml枯草芽孢杆菌液体种子培养基的250ml三角瓶中在温度为30℃下恒温摇床培养2d；枯草芽孢杆菌液体种子培养基的制备步骤为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，蒸馏水1L，在121℃灭菌30min；
4）黑曲霉菌悬液制备：当黑曲霉扩大培养结束后，将菌液在4000r/min条件下离心15min，去除上清液，加入10ml 0.9%的生理盐水，旋涡震荡混合均匀，将混合液在4000r/min条件下离心5min，去除上清液，加入0.9%的生理盐水，反复清洗4次，最后用生理盐水补充混匀，以生理盐水作为空白对照，在波长600nm处，以生理盐水调节菌液浓度的吸光度值，控制在0.8，制成黑曲霉菌悬液；
5）枯草芽孢杆菌悬液制备：当枯草芽孢杆菌扩大培养结束后，将菌液在4000r/min条件下离心15min，去除上清液，加入10ml 0.9%的生理盐水，旋涡震荡混合均匀，将混合液在4000r/min条件下离心5min，去除上清液，加入0.9%的生理盐水，反复清洗4次，最后用生理盐水补充混匀，以生理盐水作为空白对照，在波长600nm处，以生理盐水调节菌液浓度的吸光度值，控制在0.8，制成枯草芽孢杆菌菌悬液；；
6）制备含茶油饼粕的固态发酵培养基：将步骤1）预处理后的茶油饼粕100g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、（NH4）2SO4 1g，搅拌均匀后于121℃灭菌30min，控制茶油饼粕的含水量为50%；
7）混合固态发酵：以黑曲霉和枯草芽孢杆菌总接种量为12%，黑曲霉菌悬液和枯草芽孢杆菌菌悬液混合比为1：1：接种至含茶油饼粕的固态发酵培养基中发酵培养，发酵时间4d，发酵温度30℃，每12h翻动一次，得到发酵茶油饼粕；
8）猪粪便中筛选益生菌：从猪粪便中分离出地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、产气肠杆菌均有拮抗作用；
9）地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1种子液制备：分别挑取地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的单菌落装入含有100ml的NA液体培养基中，培养温度为35℃，转速180r/min，培养时间14h；NA液体培养基的制备步骤为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂2g，去离子水1L，调pH至6.8-7.0，在121℃灭菌20min；
10）地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1菌悬液制备：将步骤9）制备的地衣芽孢杆菌CFC-11种子液和地衣芽孢杆菌MR-1种子液分别在4000r/min条件下离心15min，去除上清液，加入10ml 0.9%的生理盐水，旋涡震荡混合均匀，将混合液在4000r/min条件下离心5min，去除上清液，加入0.9%的生理盐水，反复清洗4次，最后用生理盐水补充混匀，以生理盐水作为空白对照，在波长600nm处，以生理盐水调节菌液浓度的吸光度值，控制在0.8，制成地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液；
11）制备含发酵茶油饼粕的益生菌固态培养基：发酵茶油饼粕20g，葡萄糖3g，硫酸铵0.5g，磷酸氢二钠0.25g，去离子水18ml，pH值7.0，在121℃灭菌20min；
12）益生菌固态发酵：以地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的总接种量为3.5%，地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液混合比为1：1接种至含发酵茶油饼粕的益生菌固态培养基中发酵培养，培养条件为：菌悬液1:1，接种量3.5%，培养温度30℃，培养时间70h；任泽文等对油茶饼中茶皂素的降解及饲用益生菌的筛选与发酵条件优化做相关研究时，通过从新鲜幼猪粪中分离鉴定得到了地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1，同时对其生物学特性做了相关实验，发现此两种均对NaCl和胆盐均具有一定的耐受性，均可产蛋白酶和纤维素酶，对高温具有一定的耐受性；
13）真空冷冻干燥：将步骤12）发酵培养后的发酵物真空干燥即得益生菌猪饲料。
本实施例1中猪饲料制备工艺流程图如图1所示，且本实施例1原料茶油饼粕中茶皂素的含量为13.8%，采用本发明制备的猪饲料中茶皂素的含量为0.49%，地衣芽孢杆菌数为2.0×109CFU/g，表明，采用本发明制备猪饲料的方法，可有效降低茶皂素的含量，使猪饲料中茶皂素的含量保持在较低水平，且制备的猪饲料中含有大量益生菌（地衣芽孢杆菌）可有效促进猪饲料的消化吸收，提高猪的生长性能。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于：不包括步骤8）-12），即采用黑曲霉和枯草芽孢杆菌对茶油饼粕进行混合固态发酵后直接将发酵物进行真空冷冻干燥成猪饲料，并研究了该饲料含有的茶皂素含量、益生菌含量及其对小猪生长性能、存活率等生长指标的影响，结果如表1所示。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于：不包括步骤2）-5）和步骤7），即采用地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1对茶油饼粕进行益生菌固态发酵后直接将发酵物进行真空冷冻干燥成猪饲料，并研究了该饲料含有的茶皂素含量、益生菌含量及其对小猪生长性能、存活率等生长指标的影响，结果如表1所示。
对比例3
本对比例与实施例1的不同之处在于：只采用黑曲霉对茶油饼粕进行单独固态发酵，然后再采用地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1对经黑曲霉发酵后的发酵茶油饼粕进行益生菌固态发酵，并研究了该饲料含有的茶皂素含量、益生菌含量及其对小猪生长性能、存活率等生长指标的影响，结果如表1所示。
对比例4
本对比例与实施例1的不同之处在于：只采用枯草芽孢杆菌对茶油饼粕进行单独固态发酵，然后再采用地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1对经枯草芽孢杆菌发酵后的发酵茶油饼粕进行益生菌固态发酵，并研究了该饲料含有的茶皂素含量、益生菌含量及其对小猪生长性能、存活率等生长指标的影响，结果如表1所示。
表1 实施例1及对比例1-4中的饲料含有的茶皂素含量、益生菌含量及其对小猪生长指标的影响
从上表可看出，实施例1方法制备的饲料，喂养的小猪其平均体重要高于对比例1和2，对比例2制备的饲料，虽日采食量与实施例1无明显差异，但每日增重量明显少于实施例1，这是因为对比例2的饲料茶皂素含量增加，适口性差，说明脱皂是必要的工序；对比例1的益生菌含量明显少于实施例1，且对比例1的小猪增重量低于实施例1，说明此发明的益生菌饲料有助于小猪的生长。由此突出本发明采用黑曲霉和枯草芽孢杆菌发酵后的茶油籽粕作为固体培养基，并采用地衣芽孢杆菌发酵制备猪饲料的优点。与实施例1相比，对比例3和4的小猪的日采食量、日均增重、益生菌和茶皂素的含量均低于实施例1，尤其是茶皂素的含量显著低于实施例1，比例3和4分部采用单独的黑曲霉、枯草芽孢杆菌发酵茶油籽粕制备猪饲料，而实施例1是采用黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合发酵茶油籽粕，表明，与单独采用黑曲霉或者枯草芽孢杆菌中的任何一种菌种发酵茶油籽粕制备猪饲料相比，本发明采用黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌种发酵制备的猪饲料可显著提高小猪的生长性能。
实验例1
本实验例主要研究地衣芽孢杆菌的产酶效果，包括以下步骤：
1)将地衣芽孢杆菌的菌悬液接种至产蛋白酶和产纤维素酶的培养基中，发酵条件为：
地衣芽孢杆菌CFC-11:MR-1为1:1，接种量为2%，发酵温度35℃，转速180r/min，培养时间为48h。
2)产蛋白酶培养基：蛋白胨5g，酵母膏7g，氯化钠5g，去离子水1L，pH 7.0-7.2,121℃灭菌20min。
3)产纤维素酶培养基：麸皮10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母浸粉5g，去离子水1L，121℃灭菌20min。
4)蛋白酶的测定：将发酵结束后的产物，在5000r/min的冷冻离心机中离心8min，上清液即为所需的粗酶液。利用福林-酚法测定蛋白酶的活力。
5)纤维素酶的测定：将发酵结束后的产物，在5000r/min的冷冻离心机中离心8min，上清液即为所需的粗酶液。利用DNS试剂法测定纤维素酶的活力。
本实验结果表明，当菌种在此条件下时，蛋白酶活性可达到63.2U/mL，纤维素酶活性为18U/mL。
实验例2
本实验案例主要研究益生菌固态培养基的成分，包括以下步骤：
a.最佳碳源的确定：将地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液（吸光度值0.8）以接种量2%，菌液比例1:1，发酵温度35℃，发酵时间48h，期间每12h摇匀，分别添加2g葡萄糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖、甘油，研究不同碳源培养基发酵结束后的芽孢数量。从实验结果可发现，当利用葡萄糖作为碳源时，对芽孢数量影响最大，可达到5.8ⅹ108CFU/g。
b. 最佳氮源的确定：将地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液（吸光度值0.8）以接种量2%，菌液比例1:1，发酵温度35℃，发酵时间48h，期间每12h摇匀，分别添加0.5g蛋白胨、酵母膏、玉米粉、硝酸铵、硫酸铵、尿素，研究不同氮源培养基发酵结束后的芽孢数量。从实验结果可发现，以上6种氮源均能促进芽孢的生成，但是硫酸铵的促进作用最大，可达到6.2ⅹ108CFU/g。
c. 最佳无机盐的确定：将地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的菌悬液（吸光度值0.8）以接种量2%，菌液比例1:1，发酵温度35℃，发酵时间48h，期间每12h摇匀，分别添加0.15g氯化钙、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁，研究不同无机盐培养基发酵结束后的芽孢数量。从实验结果可发现，添加磷酸氢二钠作为无机盐时，可促进固态发酵的芽孢数达到实验中的最大值，其为5.1ⅹ108CFU/g
通过本实验可发现，混菌发酵时，最合适的碳源为葡萄糖，最合适的氮源为硫酸铵，最合适的无机盐为磷酸氢二钠。
实验例3
本实验例主要研究不同黑曲霉和枯草芽孢杆菌的总接种量对脱皂率的影响的研究，脱皂率=原茶油饼粕中茶皂素的含量/猪饲料中茶皂素的含量×100%，包括以下步骤：以菌悬液混合比例为1:1，茶粕含水量50%，发酵时间4d，发酵温度30℃，每12h翻动一次，研究不同总接种量4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%对脱皂率的影响。
从实验结果图2可看出，在接种量较少时，菌种浓度过低导致发酵不完全，使猪饲料中茶皂素含量高，脱皂率不理想；当接种量增大到8%时，脱皂率可达到92.68%，此后随着接种量的增加，脱皂率持续上升。当接种量达到14%时，脱皂率呈现下降趋势。因此，在优化试验中，接种量在8%-14%为最佳。
实验例4
本实验例主要研究枯草芽孢杆菌菌悬液与黑曲霉菌悬液的混合比脱皂率的影响的研究，包括以下步骤：茶粕含水量50%，发酵时间4d，发酵温度30℃，总接种量12%，每12h翻动一次，研究枯草芽孢杆菌菌悬液与黑曲霉菌悬液的混合比4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4对茶油饼粕中茶皂素含量的影响。
从实验结果图3可看出，随着混合比例的增加，脱皂率先增加后降低，当混合比例在4:1、3:1时，脱皂率低于90%，当混合比例在2:1—1：2时脱皂率可达到93-94%，当混合比例在1:3、1:4时，脱皂率分别为90.31%、89.3%。说明混合比例在2:1-1:2时，两者之间的协同脱皂作用达到最佳状态，其生长、分泌酶系的能力最强，因此表现出较强的脱皂能力。
实验例5
本实验例主要研究不同地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1的总接种量对猪饲料中益生菌的影响的研究，包括以下步骤：将地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1菌悬液按混合比为1:1，培养温度30℃，培养时间70h，期间每隔12h翻动一次，研究总接种量为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%时对猪饲料中益生菌的影响。
从图4可看出，随着总接种量的增加，芽孢数先增加后减少；当接种量在3.5%时，芽孢数达到最大。结合数据可知，选用3%-4%为最佳条件。
实验例6
本实验例主要研究不同地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1菌悬液混合比对猪饲料中益生菌的的影响的研究，包括以下步骤：
将地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1总接种量为3.5%，培养温度30℃，培养时间70h，期间每隔12h翻动一次，研究不同混合比为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4时对固态发酵产益生菌的影响。
从图5可看出，随着比例的增加，芽孢数呈现先增加后降低的趋势，且地衣芽孢杆菌CFC-11和MR-1菌悬液混合比在1:3—3:1时芽孢数较多，所以选择此比例作为实验条件。
实验例7
本实验例主要研究益生菌固态培养基中发酵茶油饼粕含量对猪饲料中益生菌的影响的研究，包括以下步骤：益生菌固态培养基组成成分：葡萄糖3g，硫酸铵0.5g，磷酸氢二钠0.25g，去离子水18ml，pH值7.0,121℃霉菌20min，混菌接种量3.5%，比例为1:1进行培养。研究不同茶油饼粕含量对猪饲料中益生菌的影响。从图6可以看出，当茶油饼粕含量为20g时，芽孢数值最大。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
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