一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用
阅读说明：本技术 一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用 (Application of cyanogenic glycoside compound Menisdaurin F in preparation of anti-hepatitis B virus pharmaceutical composition ) 是由 易湘茜 高程海 候师师 米顺利 刘永宏 于 2021-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用,以HepG2.2.15细胞为模型,利用不同浓度的化合物进行抑制HBV复制实验。结果表明,不同浓度的化合物对细胞增殖无抑制作用,在0.809mM时细胞上清中HBV DNA抑制率达到50％,同时能够显著降低细胞中X基因的表达。本发明为开发新的抗乙肝病毒药物提供了先导化合物,在抗乙肝病毒方面及其肝癌转变方面提供了药用价值。(The invention discloses an application of a cyanogenic glycoside compound Menisdaurin F in preparing an anti-hepatitis B virus pharmaceutical composition, which takes HepG2.2.15 cells as a model and utilizes compounds with different concentrations to carry out an HBV replication inhibition experiment. The results show that the compounds with different concentrations have no inhibition effect on cell proliferation, the HBV DNA inhibition rate in the cell supernatant reaches 50% at 0.809mM, and the expression of X genes in the cells can be obviously reduced. The invention provides a lead compound for developing a new anti-hepatitis B virus medicament, and provides medicinal values in the aspect of anti-hepatitis B virus and liver cancer transformation.)
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技术领域
】本发明涉及抗乙肝病毒治疗药物技术领域，涉及一种氰苷类化合物MenisdaurinF在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用。
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背景技术
】乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Viru，HBV)感染引起，以肝脏炎性病变和肝肾功能的受损为主。HBV长期感染会发展为肝硬化、肝纤维化以及原发性肝细胞癌等与乙肝有关的疾病。全球每年死于HBV引发的肝癌患者超过100万，我国达到30万。治疗乙肝的根本目的是清除或永久抑制HBV病毒的复制，目前临床使用的抗病毒药物有核苷类似物和干扰素，然而二者都无法长久有效杀灭病毒，且引发的耐药性、药物副作用都成为临床不可忽视的问题。因此急需开发新型抗乙肝药物。
HBV长期感染及临床药物治愈率低源于病毒复制模板--cccDNA的稳定存在。HBV病毒时一种DNA病毒，遗传物质为双链松弛环状DNA，感染细胞后在细胞核中转化为游离共价闭合环状DNA(cccDNA)，其中HBV基因组编码的X蛋白(HBx)可与cccDNA结合，对于启动和维持cccDNA模板的转录至关重要。同时HBx还能作用于宿主细胞，介导细胞增殖凋亡、炎症侵袭和机体免疫调节过程，诱导肝癌的发生。因此，降低乙肝细胞中X基因的表达为抗乙肝药物的研发提供了新的方向。
西药主要以抗病毒治疗为主，中药采用的治疗方法有抗病毒、抗炎、保肝护肝和抗肝纤维化等。氰苷类为含腈基类化合物，其中非生氰苷类不易被酶解、水解或水解后无氰化氢生成，较为少见。现已有针对氰苷类的研究，例如，郭辉、张玲，垂盆草化学成分和药理作用的研究进展，食品与药品Food and Drug 2006年第8卷第01A期，19-22，介绍了从垂盆草中分得1个水溶性氰苷类成分，命名为垂盆草苷，并确定其结构为2-氰基-4-O-β-D-葡萄糖-反丁烯-2-醇，以及其抗肝炎活性，临床研究表明，垂盆草对病毒性肝炎、黄疸性肝炎等各型肝炎有一定的疗效。又例如中国专利申请CN201110150588一种从菱叶红景天中提取生氰苷的方法，工艺步骤为：取菱叶红景天根，粉碎，加入乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，合并萃取液，滤过，减压回收乙醇并浓缩，用乙酸乙酯进行4-8级逆流萃取，加入到大孔吸附树脂柱上吸附，40-60％乙醇洗脱，收集3-8倍量柱体积洗脱液，减压回收溶剂并浓缩，加入甲醇结晶，分离结晶，洗涤、干燥即得生氰苷(Heterodendrin)，分子式：C11H19NO6，分子量：261.274，CAS登录号：66465-22-3，主要存在于景天科、禾本科、豆科多种植物中，其中景天科植物菱叶红景天Rhodiola henryi(Diels)S.H.Fu中含量丰富，现代研究表明，生氰苷具有抗肿瘤作用，同时其也作为合成其它活性衍生物的原料。
从柴胡红景天分离得到的垂盆草苷属于氰苷类化合物，被证实对四氯化碳性肝损伤有明显保护作用，可使肝细胞内糖元和葡萄糖-6-磷酸酶、乳酸脱氢酶含量增加，肝细胞内琥珀酸脱氢酶和ATP酶的活性增强，可能通过该途径发挥保肝作用，进而研发抗乙肝病毒药物。
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发明内容
】针对现有技术中非生氰苷类不易被酶解、水解或水解后无氰化氢生成的问题，本发明一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用，研究表明：利用反转录技术和实时荧光定量PCR技术测定氰苷类化合物Menisdaurin F作用下X基因的表达。结果显示氰苷类化合物Menisdaurin F能显著降低HBx mRNA的表达水平。
为了实现上述目的，本发明所采用以下技术方案：
一种氰苷类化合物Menisdaurin F，其化学结构式如下：
上述一种氰苷类化合物Menisdaurin F的分离纯化与鉴定方法，包括如下步骤：
1)将新鲜的木榄胚轴切片，用体积浓度95％工业酒精按照1:3的物料比提取，每次7天，连续提取3次，合并提取液后减压浓缩得到粗提物，然后采用Agilent 1290-G6460ALC/MS直接定位氰苷类化合物存在的极性范围，其中色谱柱：ACQUITY UPLC BEH AMIDE 1.7μm2.1×100mm，A：超纯水，pH7.0，B:乙腈；梯度洗脱程序：0-4min，40％B；4-6min，45％B-85％B；6-14min，85％B；14-16min，100％B；18-20min，100％B；流速为0.30mL/min；柱温35℃；进样体积2μL；自动进样器温度为4℃；
MS/MS条件：
离子源电离方式：电喷雾电离；扫描方式：正离子模式扫描；毛细管电压：3.5Kv；雾化气压力40psi；脱溶剂气流速8L/min，350℃；干燥气流速8L/min，300℃；碰撞能量：20eV；破碎电压80V，在10-12分钟发现氰苷类化合物；
2)依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取上步骤得到的粗提物，得到不同极性萃取部位，正丁醇萃取部位经正向硅胶柱柱层析技术，以氯仿-甲醇(CHCl3-MeOH)系统(CHCl3:MeOH＝10:0，10:1,5:1,20:7,0:10，V:V)为洗脱溶剂进行洗脱，共收集到83个流份，按照TLC分析结果，将成分极性相近的流份进行合并，粗分为13个组分(Z1-Z13)；
3)组分Z10选用凝胶柱色谱分离(甲醇装柱，V有效＝1024cm3)，以甲醇为洗脱溶剂，流速为5-7s/d，8-10mL一个流分，总共接到256个流分，通过硅胶薄层板合并为11个组分(a1-a11)，组分a3使用半制备液相进行等梯度分离，液相分离条件为MeOH:H2O＝90:10(V:V)，获得该化合物(20.00mg，tR＝10.78min)，经高分辨质谱和核磁谱，鉴定为化合物Menisdaurin F。
上述一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用。
所述的抗乙肝病毒，包括：在乙肝病毒复制过程中的抑制作用，以及通过降低乙肝细胞中X基因发挥抗乙肝作用。
本发明通过利用实时荧光定量PCR技术，检测不同氰苷类化合物Menisdaurin F药物浓度作用下细胞上清中HBV DNA水平，实验结果证明氰苷类化合物Menisdaurin F抗乙肝病毒复制的作用。
本发明利用反转录技术和实时荧光定量PCR技术测定氰苷类化合物MenisdaurinF作用下X基因的表达，结果显示氰苷类化合物Menisdaurin F能显著降低HBx mRNA的表达水平，表明氰苷类化合物Menisdaurin F可通过降低乙肝细胞中X基因发挥抗乙肝作用。
进一步的，所述的一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用，所述药物组合物是以氰苷类化合物Menisdaurin F为主要成分，加上药学中可接受的辅料或辅助性成分制备成临床上可接受的药物制剂，所述的氰苷类化合物Menisdaurin F在药物组合物中的含量通常为0.1-95.0％(w/w)。
进一步的，所述的一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用，所述药物制剂包括口服制剂和注射制剂两种剂型。
进一步的，所述的一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用，所述口服制剂为口服胶囊，所述注射制剂为静脉注射液。
通常而言，作为药物，均是在制备成制剂后才临床应用。本发明所述的药物组合物，作为药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明药物组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明药物组合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明药物组合物可以制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。为了将本发明药物组合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明药物组合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明药物组合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明药物组合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明药物组合物的胶囊剂。
为将本发明药物组合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。
和现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明所述的一种氰苷类化合物Menisdaurin F的分离纯化与鉴定方法，相比于现有的常规提取方法，更加简洁，首先运用高分辨质谱进行氰苷类化合物进行定位，然后再用高效液相色谱定向获得，属于直接定向提取获得氰苷类化合物，获得氰苷类化合物Menisdaurin F属于新化合物，还未有文献进行报道。
2、本发明所述的的氰苷类化合物Menisdaurin F具有强的抗乙肝病毒复制活性，也是首次报道了该类化合物具有此种活性。
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附图说明
】图1是本发明实施例1得到的氰苷类化合物Menisdaurin F的化学结构式的图。
图2是本发明实施例1得到的氰苷类化合物Menisdaurin F对HepG2.2.15细胞中HBx基因表达的影响的图。
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具体实施方式
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以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
实施例1：
一种氰苷类化合物Menisdaurin F的分离纯化与鉴定方法，包括如下步骤：
1)将新鲜的木榄胚轴切片，用体积浓度95％工业酒精按照1:3的物料比提取，每次7天，连续提取3次，合并提取液后减压浓缩得到粗提物，然后采用高效液相色谱和高分辨质谱连用技术直接定位氰苷类化合物存在的极性范围为高极性部位，其中色谱柱：ACQUITYUPLC BEH AMIDE 1.7μm 2.1×100mm，A：超纯水，pH7.0，B:乙腈；梯度洗脱程序：0-4min，40％B；4-6min，45％B-85％B；6-14min，85％B；14-16min，100％B；18-20min，100％B；流速为0.30mL/min；柱温35℃；进样体积2μL；自动进样器温度为4℃；
MS/MS条件：
离子源电离方式：电喷雾电离；扫描方式：正离子模式扫描；毛细管电压：3.5Kv；雾化气压力40psi；脱溶剂气流速8L/min，350℃；干燥气流速8L/min，300℃；碰撞能量：20eV；破碎电压80V，在10-12分钟发现氰苷类化合物；
2)依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取上步骤得到的粗提物，得到不同极性萃取部位，正丁醇萃取部位经正向硅胶柱柱层析技术，以氯仿-甲醇(CHCl3-MeOH)系统(CHCl3:MeOH＝10:0，10:1,5:1,20:7,0:10，V:V)为洗脱溶剂进行洗脱，共收集到83个流份，按照TLC分析结果，将成分极性相近的流份进行合并，粗分为13个组分(Z1-Z13)；
3)组分Z10选用凝胶柱色谱分离(甲醇装柱，V有效＝1024cm3)，以甲醇为洗脱溶剂，流速为5-7s/d，8-10mL一个流分，总共接到256个流分，通过硅胶薄层板合并为11个组分(a1-a11)，组分a3使用半制备液相进行等梯度分离，液相分离条件为MeOH:H2O＝90:10(V:V)，获得该化合物(20.00mg，tR＝10.78min)，淡黄色结晶，
ESI-MS m/z:314.1[M-H]ˉ，分子式C14H21NO7；1H NMR(DMSO-d6，700MHz):δ(ppm)5.56(1H,d,J＝1.48Hz,H-2)，4.92(1H d,J＝4.57Hz,2'-OH)，4.93(2H,dd,J＝9.41,4.72Hz,3'-OH,4'-OH)，4.76(1H,d,J＝5.08Hz,5-OH)，4.48(1H,ddd,J＝9.00,4.57,1.37Hz,H-1')，4.34(1H,t,6'-OH)，4.31(1H,d,H-5)，3.72(1H,tq,J＝8.43,4.14Hz,H-6')，
3.65(1H,ddt,J＝11.67,5.86,2.98Hz,H-6')，3.43(1H,dt,J＝11.38,5.49,5.49Hz,H-3')，3.16(1H,td,J＝8.79,3.02Hz,H-8)，3.11(2H,ddt,J＝12.04,6.17,3.05,3.05Hz,H-2',H-5')，3.04(1H,td,J＝9.14,9.10,3.97Hz,H-4')，2.48(1H,ddd,H-4)，
2.11(2H,tdd,J＝10.30,10.30,4.79,2.59Hz,H-7,H-4)，1.78(1H,ddtd,J＝12.31,6.05,4.34,4.30,1.49Hz,H-5)，1.60(1H,dt,J＝12.91,8.64,8.64Hz,H-7)，1.38(1H,m,H-5),13CNMR(176MHz,DMSO-d6)δ116.6(C-1)，96.1(C-2)，172.1(C-3)，39.5(C-4)，70.5(C-5)，30.2(C-6)，27.3(C-7)，75.1(C-8)，110.2(C-1')，74.2(C-2')，78.0(C-3')，71.5(C-4')，81.5(C-5')，61.2(C-6')，经高分辨质谱和核磁谱，鉴定为化合物MenisdaurinF。
实施例2：
一种氰苷类化合物Menisdaurin F在制备抗乙肝病毒药物组合物中的应用：
实验方法
1一种氰苷类化合物Menisdaurin F，其化学结构式参见图1(以下简称氰苷类化合物)。
2氰苷类化合物对乙肝病毒复制的抑制作用
2.1主要试验材料
2.1.1 HepG2.2.15细胞：广西医科大学艾滋病防治研究重点实验室叶力教授惠赠。
2.1.2主要试剂
DMEM培养基，胎牛血清，青链霉素，生物级二甲基亚砜(DMSO)购于美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司，遗传霉素(G418)，拉米夫定(3TC)购于上海麦克林生化科技有限公司，HBV DNA定量测定试剂盒购于湖南圣湘生物科技有限公司。
2.2氰苷类化合物对细胞的毒性实验
利用MTT比色法检测氰苷类化合物对细胞的毒性作用。具体为：生长状态良好的HepG2.2.15细胞覆盖度为80-90％时，加入0.25％胰酶消化，待细胞脱落后立即终止消化，加入新鲜培养基制成单细胞悬液。利用细胞计数板计数，稀释成为5×104个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100μL，置37℃、5％CO2培养箱内孵育24h，待细胞贴壁生长加不同药物浓度的含药培养液(2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.0625μM)、阳性药物(3TCμg100/mL)和阴性培养液。培养72h后，每孔加5mg/mL MTT溶液20μL，37℃孵育4h。终止培养，吸去孔内溶液，加入DMSO 150μL溶剂结晶物。将细胞培养板置于震荡器上震荡10min，选择490nm波长，使用酶标仪上测量各孔光吸收值(OD值)，计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(实验组OD值/阴性对照孔OD值)×100
2.3氰苷类化合物对HBV DNA复制的抑制实验
HBV DNA的检测指标是判断乙型肝炎传染性和考核抗病毒疗效的重事指标。生长状态良好的HepG2.2.15细胞稀释成单细胞悬浮液，调整细胞密度为为5×104个/mL，每种接种100μL至96孔板。培养24h贴壁，置换不同药物浓度的含药培养液(1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.0625μM)、阳性药物(3TCμg100/mL)和阴性培养液。每隔3天换一次药液，6天后收集细胞上清液。按照试剂盒操作说明，依次加入核酸释放剂5μL，5μL细胞上清反应10min，再加入PCR-mix 40μL(反应液38μL/人份+酶混合液2μL/人+HBV-内标2μL/人份)，离心后进行实时荧光PCR扩增。反应结束后利用LightCycler480软件分析数据得到HBV DNA拷贝数，计算HBV DNA抑制率：
HBV DNA抑制率(％)＝(阴性对照孔HBV DNA拷贝数－实验孔HBV DNA拷贝数)/阴性对照孔HBV DNA拷贝数×100％
2.4试验结果
结果表明，化合物对细胞毒副作用较小，在0-2mM浓度范围内，对细胞增殖为无抑制作用，其IC50值>2μM。在浓度范围内0-0.125mM，化合物对细胞分泌HBV DNA未表现出抑制作用，随着浓度升高，细胞上清中HBV DNA浓度下降，其EC50值为0.809mM，TI值>2，为有效低毒化合物。
表1化合物对HepG2.2.15细胞增殖和分泌HBV DNA的抑制作用(n＝3)
3氰苷类化合物对乙肝细胞X基因表达的抑制作用
3.1主要试剂
AxyPrep总RNA小量制备试剂盒购于美国Corning公司；ReverTraqPCR RT Kit和SYBRGreen Realtime RCPMaster Mix购于日本Toyobo公司，PCR引物由上海上海金斯瑞生物科技有限公司合成。
3.1细胞收集
将HepG2.2.15细胞接种于24孔板，细胞密度为5×104个/mL，置37℃、5％CO2培养箱内培养24h待细胞贴壁。设置阴性对照孔、阳性对照孔和样品孔，置换相应含药培养液培养，每隔3天换一次药液，6天后弃去细胞上清液，收集细胞备用。
3.2总RNA的提取
(1)收集细胞后，尽量弃去培养基，每孔加300μl Buffer R-I，用移液枪上下吹打8-10次，转移上述细胞悬浮液到1.5ml离心管(试剂盒内提供)。加110μl Buffer R-II，漩涡振荡15-30s，12000rpm离心5min(在4℃下离心)。将制备管置于2mI离心管(试剂盒内提供)中，转移混合液到制备管中，6000rpm离心1min；
(2)弃滤液，将制备管置回到2mI离心管中，制备管中加500μl BufferW1A，12000rpm离心1min；
(3)弃滤液，将制备管置回到2mI离心管中，制备管中加700μl BufferW2A，12000rpm离心1min，以同样方法再用700μl BufferW2A洗涤一次。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12000rpm离心1min；
(4)制备管放入一干净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加70-100μl Buffer TE。室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱得RNA。
3.3 cDNA的合成
3.3.1反转录反应体系
3.3.2反转录反应条件
42℃60min，70℃5min
3.4 Real-time PCR分析
3.4.1引物
引物
序列
β-actin F
CTCCATCCTGGCCTCGCTGT
β-actin R
GCTGTCACCTTCACCGTTCC
HBx F
TCTCAGCAATGTCAACGAC
HBx R
TTTATGCCTACAGCCTCCT
3.4.2 Real-time PCR反应体系
试剂
体积
2×Real-time PCR Master Mix
10μL
F/R Primer(10μM)
1μL each
cDNA Template(1:100dilution)
1μL
ddH<sub>2</sub>O
To 20μL
3.4.3 Real-time PCR反应条件
反应结束后，记录各组Ct值，根据△Ct(n)＝Ct目的基因(n)-Ct内参基因(n)；△△Ct(n)＝△Ct(n)-△Ct(1)并计算2-△△Ct(n)值。
3.5试验结果
如图2，阴性对照组细胞中HBx mRNA的表达量赋值为1，与阴性对照相比，3TC和化合物均能明显抑制乙肝细胞X基因的表达(P<0.05)。其中3TC作用下HBx mRNA表达量为0.83(P<0.05)，化合物作用下HBx mRNA表达量为0.72(P<0.01)，能明显抑制乙肝细胞X基因的表达量。
结论：
1、本发明得到的氰苷类化合物Menisdaurin F，通过利用实时荧光定量PCR技术，检测不同氰苷类化合物Menisdaurin F药物浓度作用下细胞上清中HBV DNA水平，实验结果证明氰苷类化合物Menisdaurin F抗乙肝病毒复制的作用。
2、本发明得到的氰苷类化合物Menisdaurin F，利用反转录技术和实时荧光定量PCR技术测定氰苷类化合物Menisdaurin F作用下X基因的表达，结果显示氰苷类化合物Menisdaurin F能显著降低HBx mRNA的表达水平，表明氰苷类化合物Menisdaurin F可通过降低乙肝细胞中X基因发挥抗乙肝作用。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
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