一种黑曲霉菌株及其在赭曲霉毒素a降解中的应用
阅读说明：本技术 一种黑曲霉菌株及其在赭曲霉毒素a降解中的应用 (Aspergillus niger strain and application thereof in ochratoxin A degradation ) 是由 孙秀兰 邹东 纪剑 孙嘉笛 叶永丽 张银志 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种黑曲霉菌株及其在赭曲霉毒素A降解中的应用,属于基因工程领域。本发明提供了一株黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21,已于2020年11月9日保存于中国微生物菌种保藏中心,保藏编号为CGMCC No.20751。黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21对赭曲霉毒素A具有良好的降解效果,降解率达到74.49％,较原菌株提高了18.23％；达到最佳降解效果的时间提前,缩短了18h；黑曲霉属于食品级微生物,具有较高的食品安全性,可以实现真菌毒素的生物高效降解。(The invention discloses an aspergillus niger strain and application thereof in ochratoxin A degradation, belonging to the field of genetic engineering. The invention provides an Aspergillus niger FS-UV-21 strain which is preserved in China center for culture collection of microorganisms in 11 months and 9 days in 2020, and the preservation number is CGMCC No. 20751. Aspergillus niger FS-UV-21 has good degradation effect on ochratoxin A, the degradation rate reaches 74.49%, and is improved by 18.23% compared with the original strain; the time for achieving the optimal degradation effect is advanced, and 18h is shortened; aspergillus niger belongs to food-grade microorganisms, has high food safety, and can realize the high-efficiency biological degradation of mycotoxin.)
技术领域
本发明涉及一种黑曲霉菌株及其在赭曲霉毒素A降解中的应用，属于基因工程领域。
背景技术
真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，在农产品及其制品中广泛存在，由于其对人和动物产生严重危害，真菌毒素污染已经成为人类健康面临的主要全球食源性风险之一。目前已被科学家们发现的真菌毒素有400多种，虽然它们都表现出不同的生理生化性质，但是都有毒性，具有致癌、致突变等性质，据了解人和动物免疫系统的紊乱与真菌毒素有一定的关系。目前最常见的霉菌毒素包括赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯醇、呕吐毒素等，这几种真菌毒素是目前发现的对谷物、饲料、动物和人类危害最大的真菌毒素。赭曲霉毒素，尤其是赭曲霉毒素A(OTA)，被认为是污染食品和饲料的五种最重要的真菌毒素之一。OTA具有肾毒性、肝毒性、致畸性、免疫毒性以及遗传毒性等，并且已被国际癌症研究机构归类为2B类致癌物。OTA危害巨大，因此需要寻找一种有效且安全的技术将赭曲霉毒素的水平降低到阈值。
而微生物防治具有安全、高效、经济、应用性强、环境友好型等优势，成为近年来备受推崇的防治方法。研究表明多种微生物对OTA具有脱除作用，包括乳酸杆菌、不动杆菌、酵母、根霉和曲霉等。周育等研究表明，土壤中的苯基不动杆菌、乙酸钙不动杆菌具有降解OTA的能力(参见周育,吉小凤,李文均.2012.曲霉类真菌毒素污染、危害及生物脱毒技术研究进展[J].中国兽医学报,32(11):1741-1746)；刘长宇筛选的一株具有OTA和AFB1双降解功能的藤黄单胞菌，该降解菌株可以在低浓度的毒素污染条件下有效降解OTA和AFB1(参见刘长宇.藤黄单胞菌CW574对AFB_1和OTA降解特性及在生物脱毒中的应用[D].安徽农业大学,2019.)；熊科等研究发现黑曲霉M00988菌株具有降解OTA的作用(参见熊科,支慧伟,王小艺,等.黑曲霉M00988菌株来源的降解赭曲霉毒素A羧肽酶基因的原核表达及其固定化[J].中国食品学报,2019,019(005):66-75.)。可降解OTA的菌株种类繁多，但效果好、安全性高且可以有效应用于实际样品中毒素降解的菌株较少。另外，可降解多种真菌毒素的菌株比降解单种毒素的菌株更有应用价值。因此分离出一种对赭曲霉毒素等真菌毒素具有良好防治及降解效果的菌株具有十分重要的意义。
此前已有研究表明，黑曲霉对OTA毒素具有较好的降解作用。但是目前用于降解OTA的黑曲霉菌株降解效果较差且需要较长的时间。例如公开于专利CN 107312719 B中的黑曲霉W35，其发酵液在pH值为6.5时，48h降解率为56.0％，但其发酵液制取时间较长。并且现有的黑曲霉仅仅只能是具有单一的作用，即仅仅可以单一的作用于真菌毒素OTA，而实际应用环境当中，可能是多种真菌毒素的混合环境，比如：赭曲霉毒素A，黄曲霉毒素B1(AFB1)，玉米赤霉烯酮(ZEN)和呕吐毒素(DON)。另外，许多研究仅止步于培养基中的降解，缺少实际样品中的生物降解效果。因此，能够高效的降解多种真菌毒素的黑曲霉可在工业当中具有良好的应用前景。
发明内容
为了解决现有技术当中缺乏一种可同时降解多种真菌毒素且可应用于谷物当中赭曲霉毒素A降解的菌株，本发明提供了一株黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21，已于2020年11月9日保存于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.20751。
所述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21是采用紫外照射的方式对黑曲霉FS-Z1进行诱变，并重复5次，挑选出40株经过照射后的菌株，比较各株菌对OTA的降解率，选取降解率最高的菌株进行保存鉴定，结合菌株的形态特征和分子生物学鉴定，可确定菌株为黑曲霉。以其18S rDNA全序列(序列如SEQ NO.ID 1所示)为基础的系统发育树，故将其命名为黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21并送至保藏中心保藏。
所述黑曲霉FS-Z1记载于公开号为CN103937681B的中国发明专利申请文本中。
所述黑曲霉保藏条件如下：从生长良好的固态平板培养基PDA上接取3环诱变黑曲霉到发酵培养基中，28℃摇床(180rpm)培养36h，取0.45mL移入含有0.45mL无菌甘油的甘油管中，放入-80℃超低温冰箱保存。
所述固态平板培养基PDA为(w/v)：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、氯霉素0.1g、蒸馏水1L、自然pH、121℃高压灭菌15min。
所述液体发酵培养基PDB为(w/v)：马铃薯300g、葡萄糖20g、蒸馏水1L，自然pH，121℃高压灭菌15min。所述诱变黑曲霉的培养条件为：将已保藏甘油管的诱变黑曲霉接入液体培养基，28℃，180rpm，摇床培养48h。
本发明还提供了含有上述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中，黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的浓度至少为1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂为固态、液态菌剂或冻干粉。
本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21，或含有上述微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的浓度至少为1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为饲料添加剂或化学品。
本发明还提供了上述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21，或上述微生物制剂，或上述产品在降解霉菌霉素中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述霉菌毒素包括赭曲霉毒素A、黄曲霉素毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素中的一种或多种。
本发明还提供了一种可同时降解赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉素毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)的方法，所述方法为，将上述黑曲霉(Aspergillusniger)FS-UV-21，或上述微生物制剂或上述产品添加至同时含有黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素的环境当中，进行降解。
在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的添加量至少为：1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21是以菌悬液的形式添加至反应体系中，所述菌悬液的是按照2％(v/v)的接种量接种至反应体系中。
在本发明的一种实施方式中，所述降解的条件为：黑曲霉孢子浓度为1×106CFU/mL，添加量为2％(v/v)，于PDB液体培养基中，所述PDB液体培养基中OTA、AFB1、ZEN、DON含量分别为1ppm，反应条件为：28℃，180rpm，摇床培养48h。
本发明还提供了一种降解赭曲霉毒素A的方法，所述方法为，将上述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21，或上述微生物制剂，或上述产品添加至含有赭曲霉毒素A的环境中，进行降解。
在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的添加量至少为：2％(v/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述降解的条件为：黑曲霉孢子浓度为1×106CFU/mL，添加量为2％(v/v)，于PDB液体培养基中，所述PDB液体培养基中OTA含量为1ppm，反应条件为：28℃，180rpm，摇床培养48h。
本发明还提供了上述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21，或上述微生物制剂在制备可降解霉菌毒素产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品或饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述霉菌毒素为赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉素毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的添加量至少为：1×106CFU/mL。
有益效果
(1)黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21对赭曲霉毒素A具有良好的降解效果，降解率达到74.49％，较原菌株提高了18.23％；达到最佳降解效果的时间提前，缩短了18h。
(2)黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的传代稳定性良好。
(3)黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21对同时含有赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的环境中，降解效果良好，降解率分别为66.09％、74.61％、88.29％、37.76％。
(4)通过生物发酵方式将黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21用于麦麸OTA毒素脱除，脱除率最高为59.74％。
(5)黑曲霉属于食品级微生物，具有较高的食品安全性，可以实现真菌毒素的生物高效降解。
生物材料保藏
一株黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21，分类命名为黑曲霉Aspergillusniger，已于2020年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20751，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1：诱变黑曲霉菌株对OTA的降解效果。
图2：黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的系统发育树。
图3：原始菌株黑曲霉(Aspergillus niger)FS-Z1与黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21对OTA的降解效果动态变化。
图4：黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV21的传代稳定性。
图5：黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV21同时降解多种毒素的效果。
图6：黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV21脱除麦麸中OTA的效果。
具体实施方式
下述实施例中的出发菌株黑曲霉FS-Z1记载于公开号为CN103937681B的中国发明专利中。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
PDA固体培养基：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、氯霉素0.1g、蒸馏水1L、自然pH、121℃高压灭菌15min。
PDB液体发酵培养基：马铃薯300g、葡萄糖20g、蒸馏水1L，自然pH，121℃高压灭菌15min。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
液体培养基中赭曲霉毒素A(OTA)的提取：
取1mL待测液体加入3mL三氯甲烷，充分振荡，5000rpm离心10min，取下层三氯甲烷层，转移至新的离心管中。重复抽提两次，抽提液真空离心冷冻挥干，加入1mL乙腈-2％乙酸水溶溶解，过滤后4℃储存，用于高效液相色谱检测。
麦麸中赭曲霉毒素A(OTA)的提取：
取1g麦麸加入10mL 60％乙腈水溶液，涡旋震荡30s，超声30min,8000rpm离心10min，取上清液，真空离心冷冻挥干，加入1mL乙腈-2％乙酸水溶溶解，过滤后4℃储存，用于高效液相色谱检测。
高效液相色谱法检测赭曲霉毒素A(OTA)条件：高效液相色谱种类：AgilentTechnologies 1260infinity；色谱柱：C18柱，柱长：150mm，内径：4.6mm，黏度：3μm；流动相：乙腈：水：乙酸＝96:102:2；流速：1.0mL/min；检测波长：激发光波长：333nm，发射波长：460nm。
液体培养基中黄曲霉素毒素B1(AFB1)的提取及检测：
从待测溶液中吸取1ml并加入3ml三氯甲烷，萃取两次，真空离心冷冻挥干，20％乙腈复溶，加入三氟乙酸100ul，正己烷200ul，衍生化30min，应用高效液相色谱法进行检测。色谱条件为C18柱6mm×150mm×5um；流动相乙腈：水＝20:80检测温度：30℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：360nm；发射波长：440nm。
液体培养基中玉米赤霉烯酮(ZEN)的提取及检测：
从待测溶液中吸取1ml并加入3ml三氯甲烷，萃取两次，真空离心冷冻挥干，50％乙腈复溶，高效液相色谱法进行含量检测。色谱条件为色谱柱：C18柱6mm×150mm×5um；流动相：乙腈：水＝50:50；检测温度：25℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：240nm；发射波长：440nm。
液体培养基中呕吐毒素(DON)的提取及检测：
再从中吸取1ml加入3ml三氯甲烷进行萃取两次，真空离心冷冻挥干，20％甲醇复溶，高效液相色谱法进行含量检测。色谱条件：色谱条件为色谱柱：C18柱6mm×150mm×5um；流动相：甲醇：水＝20:80；检测温度：30℃；流速：0.8ml/min；检测波长：218nm。
赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉素毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)降解率的计算方法：(1000-残余浓度)/1000×100％。
实施例1：黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21的制备
具体步骤如下：
采用紫外照射的方式对黑曲霉FS-Z1进行诱变，并重复5次，挑选出40株经过照射后的菌株，比较各株菌对OTA的降解率，选取降解率最高的菌株进行保存鉴定。
具体诱变步骤为：
1、将从酱醅中筛选出来的黑曲霉亲代接种到PDA固体培养基中，28℃培养120h，取50mL生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液，制成1×106CFU/mL的菌悬液。
2、取上述孢子悬液5mL，经200W紫外照射30min，重复5次。
3、挑取诱变后的40株菌株，分别编号为1～40，将这40株菌株接种于PDB固体培养基，从菌落中挑取适当孢子，按上述方式制成106CFU/mL菌悬液，并将菌悬液按照2％(v/v)的接种量接种到含1ppm OTA的50mL培养基中，28℃180rpm，摇床培养48h。
4、比较原菌株及新型诱变菌株对OTA的降解效果(结果如图1所示)，挑选出降解效率最高的菌株FS-UV-21并保存。
通过菌落特征观察，个体形态观察，并将菌株FS-UV-21的18S rDNA(序列如SEQNO.ID 1所示)与GenBank数据库中已知序列对比，发现其与黑曲霉(Aspergillus niger)同源性达99％。
结合菌株的形态特征和分子生物学鉴定，可确定菌株为黑曲霉。以其18S rDNA全序列为基础的系统发育树如说明书附图2所示。由图1可知，菌株FS-UV-21对OTA的降解率最高74.49％，故将其命名为黑曲霉FS-UV-21，并送至保藏中心保藏。
实施例2：黑曲霉(Aspergillus niger)FS-UV-21降解OTA的动态变化
具体步骤如下：
1、分别将黑曲霉FS-UV-21和黑曲霉FS-Z1接种至PDA固体培养基中，28℃培养120h后，取50mL含0.02％(v/v)吐温80的生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液，此时孢子悬液的浓度为：1×106CFU/mL。
2、分别取上述孢子悬液，按照2％(v/v)的接种量接种到含1ppm OTA的50mL PDB培养基中，28℃180rpm，摇床培养72h，每过6h提取相应的样品检测OTA浓度的变化，结果如表1和图3所示。
表1：不同反应时间OTA的降解率(％)
由图3可知，相对于原始菌株降解效率有明显的提高；达到最佳降解效果的时间由60h提前至42h，缩短了18h，可以更快更高效的降解真菌毒素。
实施例3：黑曲霉FS-UV-21的传代稳定性
具体步骤如下：
1、将黑曲霉FS-UV-21接种至PDA固体培养基中，传代5代，方法：28℃培养7d后为第一代，将第一代菌株转移至新的PDA固体培养基中，28℃培养7d后为第二代，重复操作至第五代，分别检测降解效果。
2、按照实施例2中方法(菌浓为106CFU/mL，OTA浓度为1ppm)，利用黑曲霉FS-UV-21处理含OTA的溶液48h，分别检测每次传代之后黑曲霉FS-UV-21对OTA的测定反应后的降解率。
由图4可知，该诱变黑曲霉在传代5代后，降解率可以稳定在75％左右，遗传稳定性较好。
实施例4：黑曲霉FS-UV-21同时降解赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素
具体步骤如下：
1、将黑曲霉FS-UV-21接种至PDA固体培养基中，28℃培养120h，取50mL含0.02％(v/v)吐温80的生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液，此时孢子悬液的浓度为：1×106CFU/mL。
2、分别取上述孢子悬液，按照2％(v/v)的接种量接种到含1ppm OTA、1ppm AFB1、1ppm ZEN和1ppm DON的50mL PDB培养基中，28℃180rpm，摇床培养42h，测定反应结束后的不同毒素的降解率。
由图5可知，赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的降解率分别为66.09％、74.61％、88.29％、37.76％，黑曲霉FS-UV-21可同时降解多种真菌毒素，且降解效果良好。
实施例5：黑曲霉FS-UV-21对麦麸的降解
具体步骤如下：
1、将黑曲霉FS-UV-21接种至PDA固体培养基中，28℃培养120h，取50mL含0.02％(v/v)吐温80的生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液，此时孢子悬液的浓度为：1×106CFU/mL。
2、处理麦麸：将麦麸粉碎，过40目筛后混合均匀收集，并加入OTA标准品使麦麸中OTA含量为1μg/g。
3、称取10g步骤2中经处理后的麦麸，并分装于50mL三角锥形瓶，四层纱布报纸封口，进行121℃、20min灭菌处理。
4、将步骤3得到的灭菌处理过的麦麸转移至发酵容器中，加入无菌水至料水比1:3(麦麸质量与无菌水体积的比值，g/mL)后，按照菌液体积与麦麸质量的百分比为15％的接种量加入步骤1所制备的FS-UV-21孢子悬液，搅拌均匀后于28℃下进行恒温发酵，分别在发酵1d、2d、3d、4d、5d后取样，检测OTA残留量并计算降解率，结果如表2和图6所示。
表2：不同发酵时间的黑曲霉对麦麸中的OTA的降解率
由图6可知，不同发酵时间对于黑曲霉脱除麦麸中的OTA有着重要影响，随着发酵时间的增加，OTA的降解率也随之增加。在发酵第5d的时候，降解率最高为59.74％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种黑曲霉菌株及其在赭曲霉毒素A降解中的应用
<130> BAA211120A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 619
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcggccggt tcctccgcct tttgatatgc ttaagttcag cgggtatccc tacctgatcc 60
gaggtcaacc tggaaagaat ggttggaaaa cgtcggcagg cgccggccaa tcctacagag 120
catgtgacaa agccccatac gctcgaggat cggacgcggt gccgccgctg cctttcgggc 180
ccgtcccccc ggagaggggg acggcgaccc aacacacaag ccgggcttga gggcagcaat 240
gacgctcgga caggcatgcc ccccggaata ccagggggcg caatgtgcgt tcaaagactc 300
gatgattcac tgaattctgc aattcacatt agttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg 360
atgccggaac caagagatcc attgttgaaa gttttaactg attgcattca atcaactcag 420
actgcacgct ttcagacagt gttcgtgttg gggtctccgg cgggcacggg cccggggggc 480
agaggcgccc ccccggcggc cgacaagcgg cgggcccgcc gaagcaacag ggtacaatag 540
acacggatgg gaggttgggc ccaaaggacc cgcactcggt aatgatcctt ccgcaggtcc 600
ccctaacgga agggcggta 619
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