一种用于测定特立帕肽生物学活性的克隆化细胞株
阅读说明：本技术 一种用于测定特立帕肽生物学活性的克隆化细胞株 (Cloned cell strain for determining biological activity of teriparatide ) 是由 王盛 邵泓 陈钢 王灿 王自强 段徐华 郑璐侠 王鸣人 董闪闪 刘荔桢 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明构建了一种能够稳定表达cAMP反应元件-荧光素酶报告基因的大鼠骨肉瘤细胞株,上述细胞株在给予甲状旁腺素受体激动剂特立帕肽刺激的情况下可稳定表达荧光素酶,通过检测该细胞株所表达的荧光素酶的活性可以评估样品的生物学活性,本发明所提供的方法测定时间短、操作简单、重复性好。(The invention constructs a rat osteosarcoma cell strain capable of stably expressing cAMP response element-luciferase reporter gene, the cell strain can stably express luciferase under the condition of stimulation of a parathyroid hormone receptor agonist teriparatide, and the biological activity of a sample can be evaluated by detecting the activity of the luciferase expressed by the cell strain.)
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及一种用于测定特立帕肽生物学活性的克隆化细胞株。
背景技术
甲状旁腺素受体(PTHR)属于激活腺苷酸环化酶/cAMP信号传导途径的G蛋白偶联受体，在骨细胞和肾脏细胞中高表达。甲状旁腺激素(PTH)是其内源性激动剂，激活受体后可通过作用于骨骼和肾脏来调节血液中钙和无机磷酸盐水平的内分泌激素，促进骨形成。特立帕肽(PTH(1-34))是一种合成的多肽激素，为人甲状旁腺素PTH的1-34氨基酸片段。其与完整的含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素PTH具有相同的生物活性，通过激活甲状旁腺素受体，可增加血清中的钙浓度，伴随着钙浓度的增加，骨头对钙的吸收也有部分的增加，并激活成骨细胞，从而刺激骨形成和骨吸收，可用于治疗男人和绝经期妇女具有高度骨折风险的骨质疏松症。目前，对甲状旁腺素受体激动剂特立帕肽的体外生物学活性测定主要采用细胞因子测定法，使用酶联免疫吸附ELISA试剂盒，利用抗原与抗体特异性结合检测cAMP从而定量分析。这种方法存在操作繁琐，结果不稳定等缺点，需要新的检测方法克服上述缺陷，其中转录因子报告基因是一种稳定有效的检测技术。
转录因子报告基因法是在效应细胞内表达特定信号转录因子的DNA结合区，一般为启动子区，并在下游插入荧光素酶(luciferase)，上游受体的激活会刺激荧光素酶的表达，且其表达量与转录因子作用强度成正比。加入特定的底物，荧光素酶与底物反应产生荧光，检测荧光的强度可以对荧光素酶的活性定量，进而判断细胞内转录因子产生的相对量，间接判断配体与受体结合的相对生物学活性。
以特立帕肽为例，效应细胞选择高表达PTH受体的大鼠骨肉瘤UMR-106细胞，该细胞对PTH有很好的响应，无需外源导入受体。由于PTH受体激活产生cAMP第二信使，DNA结合区我们选择CRE(cAMP response element，即cAMP应答元件)反应元件。大体策略为采用慢病毒感染方式在UMR-106细胞中稳定表达CRE-luciferase元件质粒，并筛选出克隆化稳转株。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于测定特立帕肽生物学活性的克隆化细胞株。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种特立帕肽生物学活性的测定方法，步骤包括：
S1、复苏克隆化细胞株UMR-106-GFP-CRE-Puro后，传代并接种至96孔培养板中，过夜培养；
S2、制备特立帕肽标准溶液以及待检样品溶液，并分别加至所述96孔培养板中，培养一定的时间；
S3、将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液混匀后，加至所述96孔培养板中，并室温震荡；
S4、以所述特立帕肽标准溶液浓度的对数与其相对应的化学光强度值，作四参数逻辑回归并拟合标准曲线，即可评估所述待检样品溶液中特立帕肽的生物学活性。
优选地，所述克隆化细胞株UMR-106-GFP-CRE-Puro以100μL/孔接种至所述96孔培养板中。
优选地，所述克隆化细胞株UMR-106-GFP-CRE-Puro的细胞浓度为5×105个/mL。
优选地，所述特立帕肽标准溶液或所述待检样品溶液以100μL/孔加至所述96孔培养板中。
优选地，步骤S2中的培养时间为1-5小时。
本发明的第二方面是提供一种用于如上所述测定方法的克隆化细胞株，其特征在于，所述克隆化细胞株命名为UMR-106-GFP-CRE-Puro，其保藏编号为CGMCC 22358，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本发明的第三方面是提供一种如上所述克隆化细胞株的构建方法，其特征在于，步骤包括：
S1-1、采用慢病毒转染技术，将pLVX-GFP-CRE-Puro质粒转染入大鼠骨肉瘤UMR-106细胞；
S1-2、加入嘌呤霉素以加压筛选，富集阳性细胞并流式分选，即得所述克隆化细胞株UMR-106-GFP-CRE-Puro。
本发明的第四方面是提供一种用于如上所述构建方法的pLVX-GFP-CRE-Puro质粒，其特征在于，所述pLVX-GFP-CRE-Puro质粒的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第五方面是提供一种如上所述pLVX-GFP-CRE-Puro质粒的构建方法，其特征在于，步骤包括：
S1-1-1、采用分子克隆技术，将pNL3.2.NF-κB-RE质粒上的NF-κB-RE序列替换为CRE序列，即得中间质粒；
S1-1-2、将绿色荧光蛋白TurboGFP序列插入至慢病毒载体pLVX-Puro中，即得pLVX-GFP-Puro载体；
S1-1-3、将所述中间质粒中的所述CRE序列以及荧光素酶基因序列插入至所述pLVX-GFP-Puro载体中，即得所述pLVX-GFP-CRE-Puro质粒。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
(1)与细胞因子ELISA检测法相比：检测方式简单，重复性较好，利于保证测定结果的稳定性；
(2)本发明以cAMP通路的激活情况为研究对象，设计一种能够稳定整合cAMP反应元件-荧光素酶报告基因的细胞株，其更接近样品在体内的生物学活性作用实际情况，测定结果更为准确；
综上所述，本发明构建的一种能够稳定整合cAMP反应元件-荧光素酶报告基因的UMR-106细胞株在特立帕肽刺激下可稳定表达荧光素酶；本发明利用上述细胞株建立一种更加简单、快速的特立帕肽体外生物学活性测定方法，可有利于生物学活性药物的质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。
附图说明
本发明使用的克隆化细胞株UMR-106-GFP-CRE-Puro为携带有受cAMP调控的荧光素酶基因且能稳定表达荧光素酶的体外培养的大鼠骨肉瘤细胞UMR-106，其已进行保藏，保藏编号为CGMCC 22358，保藏日期为2021年7月7日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
图1为本发明实施例1中不同克隆化细胞株UMR-106-GFP-CRE-Puro的荧光素酶活性鉴定结果；其中，No.1-No.10为不同克隆细胞的编号；PTH(1-34)为特立帕肽样品刺激物；Forskolin(即Fosk)为PTH受体下游腺苷酸环化酶激动剂，作为阳性对照；
图2为不同细胞密度的3号克隆对不同浓度的特立帕肽样品刺激的荧光素酶活性鉴定结果；
图3为不同代次的3号克隆对不同浓度的特立帕肽样品刺激的荧光素酶活性鉴定结果；
图4为3号克隆对不同浓度的特立帕肽样品和标准品刺激的荧光素酶活性鉴定结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1：构建克隆化细胞株UMR-106-GFP-CRE-Puro
(1)确定嘌呤霉素最佳筛选浓度：将大鼠骨肉瘤细胞UMR-106接种至24孔细胞培养板中，加入不同筛选浓度的嘌呤霉素(浓度范围：0.1μg/mL～10μg/mL)，培养2～3天，观察细胞生长形态，确定嘌呤霉素最佳筛选浓度为2μg/mL；
(2)构建质粒：将pNL3.2.NF-κB-RE[NlucP NF-κB-RE Hygro]质粒上的NF-κB-RE元件替换为cAMP-RE(即CRE)元件，再将TurboGFP元件和CRE-NlucP元件插入至pLVX-Puro载体上，即得pLVX-GFP-CRE-Puro质粒；
(3)收集慢病毒：HEK-293T细胞种板过夜；使用Lipofectamine 3000试剂将pLVX-GFP-CRE-Puro质粒、pCMV-dR8.2 dvpr质粒和pCMV-VSV-G质粒转染入HEK-293T细胞，并置于二氧化碳培养箱中培养6小时后换液，继续培养48小时后收集上清，过滤浓缩即得高滴度慢病毒；
(4)转染细胞并扩增：UMR-106细胞种板过夜；加入不同滴度的慢病毒以及辅助感染试剂聚凝胺，并置于二氧化碳培养箱培养24小时后换液，继续培养48小时，加入嘌呤霉素筛选2～3天，流式GFP信号分选耐药克隆，扩大培养即可；
(5)鉴定克隆细胞荧光素酶活性：检测前一天取耐药克隆细胞种于96孔培养板，于二氧化碳培养箱培养过夜；检测当天，将培养上清吸除，无血清培养基梯度稀释特立帕肽样品加入板内，浓度分别为0nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1000nM，同时加入10μM Fosk阳性对照，二氧化碳培养箱培养3小时，加入发光底物(Promega，Nano-Glo)孵育5min发光；
计算方法为：0浓度的阴性对照组标准化为1左右，其它相对活性亦随之标准化；相对发光强度＝实验组发光强度/对照组发光强度；结果如图1所示，10个克隆细胞均具有显著的荧光素酶活性。
实施例2：验证3号克隆化细胞株UMR-106-GFP-CRE-Puro的活性以及稳定性
(I)验证细胞密度与报告基因信号检测：
(1)细胞传代培养和铺板：稳转细胞株使用完全培养液传代培养于5％，37℃二氧化碳培养箱内，每3天换液一次，收集入无菌离心管中，1000rpm离心2分钟，弃去上清液，将细胞沉淀用新鲜的完全培养液重悬，转入细胞培养瓶，继续培养；取生长状态良好的P2代次细胞进行铺板，1000rpm离心2min，弃上清，加入维持培养液重悬细胞，调节细胞浓度分别为2×105个/mL、5×105个/mL及1×106个/mL，以100μL/孔加入至96孔培养板中，过夜培养；
(2)加样：吸除培养上清，无血清培养基梯度稀释特立帕肽样品加入板内，浓度分别为0nM、0.01nM、0.03nM、0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM；取样品溶液各100μL，分别加入不同细胞密度的96孔培养板内，37℃，5％二氧化碳条件下培养3小时。
(3)显色和结果计算：每孔吸取50μL上清，并加入50μL Nano-Glo发光底物，室温震荡5分钟，在酶标仪上读数；以样品溶液浓度的对数对其相应的化学光强度(RFU)值作四参数逻辑回归，拟合标准曲线；5×104个/mL细胞密度的阴性对照组相对荧光素酶活性标准化为1左右，其它相对活性亦随之标准化；结果如图2所示，细胞浓度与RFU值呈现很好的正相关量效关系。
(II)验证细胞代次与报告基因信号检测：
(1)细胞传代培养和铺板：稳转细胞株使用完全培养液传代培养于5％，37℃二氧化碳培养箱内，每3天传代一次，收集入无菌离心管中，1000rpm离心2分钟，弃去上清液，将细胞沉淀用新鲜的完全培养液重悬，转入细胞培养瓶，继续培养；取生长状态良好的P2、P6和P10代次细胞进行铺板，1000rpm离心2min，弃上清，加入维持培养液重悬细胞，调节细胞浓度为5×105个/mL，以100μL/孔加入到96孔培养板中，过夜培养。
(2)加样：吸除培养上清，无血清培养基梯度稀释特立帕肽样品加入板内，浓度分别为0nM、0.01nM、0.03nM、0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM；取样品溶液各100μL，分别加入不同细胞密度的96孔培养板内，37℃，5％二氧化碳条件下培养3小时。
(3)显色和结果计算：每孔吸取50μL上清，并加入50μL Nano-Glo发光底物，室温震荡5分钟，在酶标仪上读数；以样品溶液浓度的对数对其相应的化学光强度(RFU)值作四参数逻辑回归，拟合标准曲线；P2代细胞阴性对照组相对荧光素酶活性标准化为1左右，其它相对活性亦随之标准化；结果如图3所示，不同的细胞代次均保持相对稳定的RFU值。
实施例3
本实施例提供一种特立帕肽生物学活性的测定方法，步骤包括：
细胞用完全培养液(取热灭活胎牛血清FBS 10mL，加DMEM培养液90mL，20mg/mL嘌呤霉素10μL，混匀，4℃保存)于37℃，5％二氧化碳条件下培养，取生长状态良好的细胞用于试验；无菌条件下，胰酶消化细胞，完全培养基中和胰酶并重悬细胞，1000rpm离心2分钟，弃去上清液，用完全培养液重悬并调整细胞浓度至5×105个/mL，每孔100μL接种于96孔板，过夜培养；第二天吸取上清，加入DMEM稀释的不同浓度标准品溶液、样品溶液，每孔100μL，37℃，5％CO2条件下培养3小时；吸取上清50μL，加入发光底物50μL；以标准品溶液浓度的对数对其相应的化学光强度(RFU)值作四参数逻辑回归，拟合标准曲线；标准品组细胞阴性对照组相对荧光素酶活性标准化为1左右，其它相对活性亦随之标准化；结果如图4所示，样品与标准品具有相似的量效曲线，样品EC50/标准品EC50为101.4％，符合模型参数要求。
综上所述，本发明构建了一种能够稳定表达cAMP反应元件-荧光素酶报告基因的大鼠骨肉瘤细胞株，上述细胞株在给予甲状旁腺素受体激动剂特立帕肽刺激的情况下可稳定表达荧光素酶，通过检测该细胞株所表达的荧光素酶的活性可以评估样品的生物学活性，本发明提供的方法测定时间短、操作简单、重复性好。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海市食品药品检验研究院
<120> 一种用于测定特立帕肽生物学活性的克隆化细胞株
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10081
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2220
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2640
acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700
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atgaccaaca agatgaagag caccaaaggc gccctgacct tcagccccta cctgctgagc 3000
cacgtgatgg gctacggctt ctaccacttc ggcacctacc ccagcggcta cgagaacccc 3060
ttcctgcacg ccatcaacaa cggcggctac accaacaccc gcatcgagaa gtacgaggac 3120
ggcggcgtgc tgcacgtgag cttcagctac cgctacgagg ccggccgcgt gatcggcgac 3180
ttcaaggtga tgggcaccgg cttccccgag gacagcgtga tcttcaccga caagatcatc 3240
cgcagcaacg ccaccgtgga gcacctgcac cccatgggcg ataacgatct ggatggcagc 3300
ttcacccgca ccttcagcct gcgcgacggc ggctactaca gctccgtggt ggacagccac 3360
atgcacttca agagcgccat ccaccccagc atcctgcaga acgggggccc catgttcgcc 3420
ttccgccgcg tggaggagga tcacagcaac accgagctgg gcatcgtgga gtaccagcac 3480
gccttcaaga ccccggatgc agatgccggt gaagaataat cggaattctg cgcggccgca 3540
tattaaggta cgggaggtat tggacaggcc gcaataaaat atctttattt tcattacatc 3600
tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatcgatag tactaacata cgctctccat caaaacaaaa 3660
cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg tccccagtgc aagtgcaggt gccagaacat 3720
ttctctggcc taactggccg gtacctgagc tcgctagcgc accagacagt gacgtcagct 3780
gccagatccc atggccgtca tactgtgacg tctttcagac accccattga cgtcaatggg 3840
agaacagatc tggcctcggc ggccaagctt agacactaga gggtatataa tggaagctcg 3900
acttccagct tggcaatccg gtactgttgg taaagccacc atggtcttca cactcgaaga 3960
tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg gaccaagtcc ttgaacaggg 4020
aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta actccgatcc aaaggattgt 4080
cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc atcatcccgt atgaaggtct 4140
gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag gtggtgtacc ctgtggatga 4200
tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta atcgacgggg ttacgccgaa 4260
catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc gtgttcgacg gcaaaaagat 4320
cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc gacgagcgcc tgatcaaccc 4380
cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg accggctggc ggctgtgcga 4440
acgcattctg gcgaattctc acggctttcc gcctgaggtt gaagagcaag ccgccggtac 4500
attgcctatg tcctgcgcac aagaaagcgg tatggaccgg cacccagccg cttgtgcttc 4560
agctcgcatc aacgtctaag gccgcgactc tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca 4620
gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa 4680
tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat 4740
aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg 4800
gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta ggatcccgcg actctagata 4860
attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc 4920
cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac 4980
cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc 5040
cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga 5100
agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt 5160
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gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg 5280
aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt 5340
ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac ctgcagccca agcttaccat gaccgagtac 5400
aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc 5460
gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag 5520
cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg 5580
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ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc 5700
gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc 5760
ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg 5820
ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg 5880
ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg 5940
cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgacc gcgtctggaa 6000
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6060
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6120
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6180
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tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 6300
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 6360
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