具体实施方式

实本实施例的内含子获取及鉴定方法如下：

1、内含子

在水稻基因组公共数据库(RGAP，http：//rice.plantbiology.msu.edu/)中获取日本晴基因组序列和注释信息，从植物开放染色质数据库PlamDHS(http：//plantdhs.org/)中获得开放染色质数据(DNase-seq)。分析LOC_Os04g57220基因，该基因编码泛素结合酶，在茎、叶、花序、胚、胚乳和种子中表达较强。研究该基因结构，发现其5’UTR存在一段长度为104bp的内含子序列。

设计序列特异性引物，制备如下引物：

正向F：5’-gtcggtacgcgtctctaggc-3’

反向R：5’-ccacaaaacaagaaaaaaa-3’。

用以上引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到104bp的扩增产物。经测序，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的自5’端第一位至104位所示，如图1所示。

SEQ ID NO.1：

gtcggtacgcgtctctaggcccccctctctctctcgatttgatcggtttgatctgtggtgccctaggtttgatctgtggatttattttttttcttgttttgtgg。

2、检测

为检测104bp内含子序列对基因表达的影响，构建如下三个载体：

1)为了检测LOC_Os04g57220自身的启动子的活性，首先克隆其启动子序列，用于驱动报告GFP基因的表达。使用的GFP载体由电子科技大学张勇课题组提供。LOC_Os04g57220基因自身的启动子序列(SEQ ID NO.2)，长度为144bp，使用所述引物扩增：

promoter-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’

promoter-R：5’-ctcttcttcttaggagccatctttcggtgctcttcgctttc-3’

SEQ ID NO.2：

cgctaagttaaaaatagatataaactctgtaaagatgcaggtgtccaggctaaacttccaagatcatccaataaaaggaacacttccttttacttttctccttaggaaaaaaaagaaaaaaaagaaagcgaagagcaccgaaag，

构建好的载体命名为Pro：：GFP(如图2所示)。

2)分析发现LOC_Os04g57220基因5’UTR区被104bp的内含子分隔，为检测包括内含子是否对基因表达的影响，扩增启动子及包括内含子的5’UTR区(SEQ ID NO.3)，使用所述引物：

intron-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’

intron-R：5’-ctcttcttcttaggagccatcgatcaaaccctaatcaccc-3’

SEQ ID NO.3：

cgctaagttaaaaatagatataaactctgtaaagatgcaggtgtccaggctaaacttccaagatcatccaataaaaggaacacttccttttacttttctccttaggaaaaaaaagaaaaaaaagaaagcgaagagcaccgaaaggcgaatctaagcgcgtccagcgtaagcatcacgcgagtcgtcggcgcgcgcggatccccgatcggacggtccacgttgccccgtcgccctataaattggtccccccgtctcccccacccaaatcctccccgactcctcgcagcttcctcttgtttttcttggccgaaccccccctcgacacgccgtcgccgccgaggggagagagagagaggccgccggccgccgctaccactgaccccccccctcgccggagcgccccgtcgccggtcggtacgcgtctctaggcccccctctctctctcgatttgatcggtttgatctgtggtgccctaggtttgatctgtggatttattttttttcttgttttgtgggggtgattagggtttgatcg

构建好的载体命名为Pro+Intron+UTR：：GFP(如图2所示)。

3)为检测单独5’UTR序列对基因表达的影响，扩增启动子和5’UTR序列(SEQ IDNO.4)，

UTR-F：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcgctaagttaaaaatagatat-3’

UTR-R：5’-ctcttcttcttaggagccatcggcgacggggcgctccggc-3’

SEQ ID NO.4：

cgctaagttaaaaatagatataaactctgtaaagatgcaggtgtccaggctaaacttccaagatcatccaataaaaggaacacttccttttacttttctccttaggaaaaaaaagaaaaaaaagaaagcgaagagcaccgaaaggcgaatctaagcgcgtccagcgtaagcatcacgcgagtcgtcggcgcgcgcggatccccgatcggacggtccacgttgccccgtcgccctataaattggtccccccgtctcccccacccaaatcctccccgactcctcgcagcttcctcttgtttttcttggccgaaccccccctcgacacgccgtcgccgccgaggggagagagagagaggccgccggccgccgctaccactgaccccccccctcgccggagcgccccgtcgccg，

构建好的载体命名为Pro+UTR：：GFP(如图2所示)。

3、水稻原生质体制备与转化

3.1水稻原生质体制备：

(1)叶片准备。取无菌培养14天左右生长良好的新鲜水稻植株40-60株，去掉根部，备用。

(2)酶解。将水稻叶片和茎段用锋利刀片切成宽度为0.5mm的条状，速度要快，防止叶片脱水，将切好的叶片放入盛有10mL酶解液的培养皿中，置于密闭容器中用真空泵抽真空30min，用封口膜封口，置于60rpm转速的摇床上25℃黑暗条件下过夜酶解。

(3)过滤。将过夜酶解的粗酶液通过预先用2mL W5 washing Buffer润洗过的孔径40,μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。

(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15mL离心管中，每管6mL细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16mL 0.55M蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8mL 0.55M蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。

(5)清洗。取50mL离心管一个，加入10mL Washing buffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8mL Washing buffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10mL Washing buffer的50mL离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。

(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10mL Washing buffer，轻弹混匀，100g离心2min。

(7)重悬。去掉上清，加入5mL Washing buffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。

(8)计数。吸取100μL细胞用于计数，取6-7μL细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用MGG稀释后再进行计数。

(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用MGG Buffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×10⁶个/mL，用于原生质体转化。

3.2水稻原生质体的转化：

(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat#DP-106)提取以下质粒：Pro：：GFP，Pro+Intron+UTR：：GFP和Pro+UTR：：GFP。确保其浓度尽量在500ng/μL以上，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。处理好的质粒用MGG Buffer稀释到实验所需质粒浓度，稀释后充分混匀备用。

(2)PEG介导的转化。将上述准备好的质粒(Pro：：GFP，Pro+Intron+UTR：：GFP和Pro+UTR：：GFP)中加入200μL按照2.2.6制备过程制备的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入210-230μL 40％PEG(PEG加入量与质粒体积相关，确保等体积加入)，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于PEG当中，从第一管加入PEG开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。

(3)清洗。加入PEG反应20min后，每管加入1mL W5 Washing Buffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。

(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μL Washing Buffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。

(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2mL W5 Buffer，再取培养皿中的W5Buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养，两天后在显微镜下观察荧光。

4、荧光显微镜观察

使用高内涵细胞成像系统进行观察。GFP使用的激发波长为488nm，吸收波长为490-540nm。所有的荧光实验至少重复三次。Pro：：GFP，Pro+Intron+UTR：：GFP和Pro+UTR：：GFP质粒分别转化原生质体后，在转化子中观察，结果如图2所示。LOC_Os04g57220基因转录起始位点上游序列且位于开放染色质区域的定义为启动子，当启动子调控GFP表达时，观察到微弱荧光信号；当包括内含子的5’UTR区和启动子一同调控GFP表达时，在原生质体中观察到明显的荧光信号；当仅有5’UTR区和启动子调控GFP表达时，依然是微弱的荧光信号。实验结果表明，LOC_Os04g57220基因启动子启动GFP本底水平的表达，呈现微弱荧光。5’UTR区对GFP的表达没有影响。在内含子存在的情况下，GFP表达明显增强，故观察到强荧光信号。说明该内含子能够增强基因的表达。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种水稻内含子及其活性鉴定方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcggtacgc gtctctaggc ccccctctct ctctcgattt gatcggtttg atctgtggtg 60

ccctaggttt gatctgtgga tttatttttt ttcttgtttt gtgg 104

<210> 2

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgctaagtta aaaatagata taaactctgt aaagatgcag gtgtccaggc taaacttcca 60

agatcatcca ataaaaggaa cacttccttt tacttttctc cttaggaaaa aaaagaaaaa 120

aaagaaagcg aagagcaccg aaag 144

<210> 3

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgctaagtta aaaatagata taaactctgt aaagatgcag gtgtccaggc taaacttcca 60

agatcatcca ataaaaggaa cacttccttt tacttttctc cttaggaaaa aaaagaaaaa 120

aaagaaagcg aagagcaccg aaaggcgaat ctaagcgcgt ccagcgtaag catcacgcga 180

gtcgtcggcg cgcgcggatc cccgatcgga cggtccacgt tgccccgtcg ccctataaat 240

tggtcccccc gtctccccca cccaaatcct ccccgactcc tcgcagcttc ctcttgtttt 300

tcttggccga accccccctc gacacgccgt cgccgccgag gggagagaga gagaggccgc 360

cggccgccgc taccactgac cccccccctc gccggagcgc cccgtcgccg gtcggtacgc 420

gtctctaggc ccccctctct ctctcgattt gatcggtttg atctgtggtg ccctaggttt 480

gatctgtgga tttatttttt ttcttgtttt gtgggggtga ttagggtttg atcg 534

<210> 4

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgctaagtta aaaatagata taaactctgt aaagatgcag gtgtccaggc taaacttcca 60

agatcatcca ataaaaggaa cacttccttt tacttttctc cttaggaaaa aaaagaaaaa 120

aaagaaagcg aagagcaccg aaaggcgaat ctaagcgcgt ccagcgtaag catcacgcga 180

gtcgtcggcg cgcgcggatc cccgatcgga cggtccacgt tgccccgtcg ccctataaat 240

tggtcccccc gtctccccca cccaaatcct ccccgactcc tcgcagcttc ctcttgtttt 300

tcttggccga accccccctc gacacgccgt cgccgccgag gggagagaga gagaggccgc 360

cggccgccgc taccactgac cccccccctc gccggagcgc cccgtcgccg 410