碱性磷酸酶融合抗体及其制造方法、以及免疫测定用试剂及免疫测定方法
阅读说明:本技术 碱性磷酸酶融合抗体及其制造方法、以及免疫测定用试剂及免疫测定方法 (Alkaline phosphatase fusion antibody, method for producing same, reagent for immunoassay, and immunoassay method ) 是由 安保纮高 井出信幸 于 2021-05-27 设计创作,主要内容包括:本发明旨在解决因由化学修饰法的碱性磷酸酶(ALP)标记抗体的不一致性的问题。由来源于牛小肠或希瓦氏菌(Shewanella)属细菌的ALP和抗体相结合的ALP融合抗体解决上述的课题。(The present invention is intended to solve the problem of the inconsistency of an alkaline phosphatase (ALP) -labeled antibody due to a chemical modification method. The above object is achieved by an ALP fusion antibody in which ALP derived from a bacterium belonging to the genus Shewanella (Shewanella) or bovine small intestine is bound to an antibody.)
具体实施方式
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在本实施方式的ALP融合抗体的制造方法(以下,也称为“制造方法”)中,将包括含编码来源于牛小肠或希瓦氏菌(Shewanel la)属细菌的ALP的基因和编码抗体的基因的表达载体的细胞用含锌离子的培养基培养。
在本实施方式的制造方法中,取得ALP和抗体直接或经肽接头由肽键结合的多肽、即,ALP和抗体在氨基酸水平成为一体的多肽。与此相比,在上述的化学修饰法中,分别取得抗体和ALP,通过将这些蛋白质由交联剂结合,取得经交联剂而ALP与抗体连接的ALP标记抗体。
在本实施方式中,牛小肠来源ALP(BIAP)及希瓦氏菌(Shewanel la)属细菌来源ALP(S-AP)的种类不特别限定,可从公知的BIAP及S-AP适宜选择。在本实施方式的制造方法中,由于由基因重组制造ALP融合抗体,BIAP及S-AP优选确定氨基酸序列或编码其的碱基序列。BIAP及S-AP的氨基酸序列或碱基序列也可从公知的数据库取得。作为数据库,可举出例如GeneBank等。
作为BIAP,可举出例如BIAP I、BIAP II、BIAP III、BIAP IV、BIAP V、BIAP VI、BIAP VII等(参照Manes T.等,(1998)J.Biol.Chem.,vol.273,pp.23353-23360、美国专利第6,406,899号说明书等)。在它们之中,也特别优选BIAP II。BIAPII的氨基酸序列及编码其的碱基序列各自示于SEQ ID NO:1及2。Manes T.等,(1998)J.Biol.Chem.,vol.273,pp.23353-23360及美国专利第6,406,899号作为参照整合到本说明书中。
作为S-AP,可举出例如来源于选自希瓦氏菌属(Shewanella sp.)T3-3(参照美国专利第9,133,446号说明书)、腐败希瓦氏菌(Shewanel la putrefaciens)CN-32、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)、奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、冷海希瓦氏菌(Shewanel la frigidimarina)、北极希瓦氏菌(Shewanel la arctica sp.)、冷海希瓦氏菌(Shewanel la frigidimarina)·NCIMB400、利文斯顿希瓦氏菌(Shewanel lalivingstonensis)、希瓦氏菌属(Shewanel la sp.)R106(或者M2)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)ALD9、科尔韦尔希瓦氏菌(Shewanel la colwel liana)、希瓦氏菌属(Shewanel lasp.)CG18、水泡希瓦氏菌(Shewanel la vesiculosa)、水底希瓦氏菌(Shewanellabenthica)KT99、水底希瓦氏菌(Shewanel la benthica)及栖冷鱼希瓦氏菌(Shewanel laalgidipiscicola)的细菌的ALP。来源于这些细菌的ALP的氨基酸序列本身是公知的,例如,可从由NCBI(National Center for Biotechnology Information)提供的数据库等的公知的数据库取得。来源于希瓦氏菌属(Shewanel la sp.)T3-3以外的希瓦氏菌(Shewanel la)属细菌的ALP的氨基酸序列以后述的参考例中所示的登录编号注册到NCBI的数据库。美国专利第9,133,446号作为参照整合到本说明书中。
在本实施方式中,优选来源于选自希瓦氏菌属(Shewanella sp.)T3-3、腐败希瓦氏菌(Shewanel la putrefaciens)CN-32、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)、冷海希瓦氏菌(Shewanel la frigidimarina)、利文斯顿希瓦氏菌(Shewanel lalivingstonensis)及水泡希瓦氏菌(Shewanel la vesiculosa)的细菌的ALP。希瓦氏菌属(Shewanella sp.)T3-3来源的S-AP的氨基酸序列及编码其的碱基序列各自示于SEQ IDNO:3及4。
在本实施方式中,编码BIAP或S-AP的基因(以下,也称为“ALP基因”)可为从牛小肠或希瓦氏菌(Shewanella)属细菌的基因组DNA由常规方法克隆,也可为基于公知的氨基酸序列或碱基序列而合成。
在本说明书中,“抗体”的用语包含全长的抗体及其片段。全长的抗体可为IgG、IgA、IgM、IgD及IgE之任一者,优选为IgG。作为抗体的片段,可举出例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、轻链、重链抗体的重链可变区域(VHH)、还原型IgG(rIgG)、单链抗体(scFv)等。
在本实施方式中,抗体不特别限定,也可为识别任何抗原的抗体。抗体可为具有天然的氨基酸序列的抗体(野生型的抗体),也可为人工制出的抗体。人工制出的抗体是指人工变更氨基酸序列的抗体。作为这样的抗体,可举出例如,变更互补性决定区域(CDR)的氨基酸序列的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等。抗体也可为来源于任何动物的抗体。作为这样的动物,优选哺乳动物,可举出例如兔、小鼠、羊驼、骆驼、大鼠、猪、绵羊、山羊、牛、马、人等。
在本实施方式中,抗体优选确定氨基酸序列或编码其的碱基序列。作为这样的抗体,可举出例如,在公知的数据库中公开了抗体的氨基酸序列或编码其的碱基序列的抗体、产生该抗体的杂交瘤可得到的抗体等。作为数据库,可举出例如GeneBank、abYsis、IMGT等。编码抗体的基因(以下,也称为“抗体基因”)也可基于公知的氨基酸序列或碱基序列而合成。在有产生抗体的杂交瘤时,可使用从该杂交瘤提取的RNA由公知的方法取得抗体基因。
在无产生抗体的杂交瘤时,也可由例如Kohler及Milstein,Nature,vol.256,p.495-497,1975中记载的方法等的公知的方法制作产生抗体的杂交瘤。或者,也可使用从用指定的抗原免疫的小鼠或兔等的动物的末梢血或脾脏取得的RNA。在使用从末梢血或脾脏取得的RNA时,也可如后述的实施例1所示,从该RNA合成cDNA,从得到的cDNA制作Fab噬菌体库。可使用此库、由噬菌体展示法等,作为抗体基因,取得编码Fab的基因。
在本实施方式中,使用包括含ALP基因和抗体基因的表达载体的细胞。表达载体只要是具有使在宿主细胞中的蛋白质表达变得可能的启动子,能在该启动子的下游插入期望的基因,就不特别限定。表达载体可为质粒载体,也可为病毒载体。也可使用市售的表达载体。根据需要,表达载体也可含ALP基因及抗体基因以外的基因。作为这样的基因,可举出例如,编码后述的肽接头的基因、药剂抗性基因等。
在本实施方式中,细胞只要是能作为基因重组表达系利用,就不特别限定,可举出例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、大肠杆菌等。通过向细胞转化或转染含ALP基因和抗体基因的表达载体,可得到含该表达载体的细胞。转化及转染可用对应于表达载体的种类的公知的方法进行。作为这样的方法,可举出例如脂转染法、磷酸钙法、电穿孔法等。也可使用市售的转染试剂盒。
ALP基因及抗体基因优选以BIAP或S-AP和抗体的融合蛋白质可表达的方式整合到表达载体。在表达载体上,ALP基因也可整合到抗体基因的上游及下游之任一者。在ALP基因整合到抗体基因的上游时,表达BIAP或S-AP的C末端的氨基酸残基和抗体的N末端的氨基酸残基直接或经后述的肽接头结合的ALP融合抗体。在ALP基因整合到抗体基因的下游时,表达BIAP或S-AP的N末端的氨基酸残基和抗体的C末端的氨基酸残基直接或经后述的肽接头结合的ALP融合抗体。
在抗体如全长的抗体或Fab等的片段一样,具有重链的全部或一部分和轻链的全部或一部分时,抗体基因含编码重链的全部或一部分的基因(以下,也称为“重链基因”)和编码轻链的全部或一部分的基因(以下,也称为“轻链基因”)。重链基因及轻链基因可为以可各自独立地表达的方式整合到1个表达载体,也可为个别地整合到2个表达载体。ALP基因优选整合到重链基因及轻链基因之任一方的上游或下游。由此,表达ALP和重链的全部或一部分的融合蛋白质、或者,ALP和轻链的全部或一部分的融合蛋白质。
在本实施方式中,在表达载体上,ALP基因和抗体基因也可直接连接。此时,表达BIAP或S-AP和抗体直接结合的ALP融合抗体。在进一步的的实施方式中,在ALP基因和抗体基因之间,也可还含编码肽接头的基因(以下,也称为“接头基因”)。此时,表达BIAP或S-AP和抗体经肽接头结合的ALP融合抗体。肽接头的氨基酸序列只要是不影响抗体的抗原结合能及ALP活性,就不特别限定。肽接头的长度不特别限定,例如是3~20氨基酸残基。在本实施方式中,肽接头优选为选自具有下述的氨基酸序列的GS1、GS2、GS3、EK1、EK2及EK3的任何。
GS1:Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:5)
GS2:(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO:6)
GS3:(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO:7)
EK1:Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(SEQ ID NO:8)
EK2:(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)2(SEQ ID NO:9)
EK3:(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)3(SEQ ID NO:10)
参照图1A~C说明本实施方式中的含ALP基因和抗体基因的表达载体的构成例。在图1A~C中,表达载体作为质粒DNA例示,箭头表示启动子。图中,“Fd(HC)”表示编码Fd的基因。Fd是Fab的重链部分。图中,“LC”表示编码轻链的基因,“接头”表示接头基因,“ALP亚基”表示ALP基因。作为酶的ALP通常,在形成同源二聚体而存在时,作为蛋白质的“ALP亚基”是指单体的ALP。
图1A显示编码Fd或轻链的基因和ALP基因直接或经编码肽接头的基因连接的表达载体。图1B显示编码VHH的基因和ALP基因直接或经编码肽接头的基因连接的表达载体。图1C显示,在图1A中所示的各表达载体上,还含编码轻链或Fd的基因的表达载体。但是,在本发明中使用的表达载体不限定于这些例。例如,也可代替编码Fd的基因而使用编码全长的重链或Fd'的基因。另外,也可代替编码VHH的基因而使用编码scFv的基因。
构成例1-1的表达载体在启动子的下游以下列顺序含编码Fd的基因、接头基因及ALP基因。此表达载体表达Fd的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的融合蛋白质。通过使用构成例1-1的表达载体和含编码轻链的基因的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含上述的融合蛋白质及轻链的Fab。
构成例1-2的表达载体在启动子的下游以下列顺序含编码轻链的基因、接头基因及ALP基因。此表达载体表达轻链的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的融合蛋白质。通过使用构成例1-2的表达载体和含编码Fd的基因的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含上述的融合蛋白质及Fd的Fab。
构成例1-3的表达载体在启动子的下游以下列顺序含编码Fd的基因及ALP基因。此表达载体表达Fd的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的融合蛋白质。通过使用构成例1-3的表达载体和含编码轻链的基因的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含上述的融合蛋白质及轻链的Fab。
构成例1-4的表达载体在启动子的下游以下列顺序含编码轻链的基因及ALP基因。此表达载体表达轻链的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的融合蛋白质。通过使用构成例1-4的表达载体和含编码Fd的基因的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含上述的融合蛋白质及Fd的Fab。
构成例2-1的表达载体在启动子的下游以下列顺序含ALP基因、接头基因及编码Fd的基因。此表达载体表达Fd的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的融合蛋白质。通过使用构成例2-1的表达载体和含编码轻链的基因的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含上述的融合蛋白质和轻链的Fab。
构成例2-2的表达载体在启动子的下游以下列顺序含ALP基因、接头基因及编码轻链的基因。此表达载体表达轻链的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的融合蛋白质。通过使用构成例2-2的表达载体和含编码Fd的基因的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含上述的融合蛋白质和Fd的Fab。
构成例2-3的表达载体在启动子的下游以下列顺序含ALP基因及编码Fd的基因。此表达载体表达Fd的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的融合蛋白质。通过使用构成例2-3的表达载体和含编码轻链的基因的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含上述的融合蛋白质和轻链的Fab。
构成例2-4的表达载体在启动子的下游以下列顺序含ALP基因及编码轻链的基因。此表达载体表达轻链的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的融合蛋白质。通过使用构成例2-4的表达载体和含编码Fd的基因的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含上述的融合蛋白质和Fd的Fab。
构成例3-1的表达载体在启动子的下游以下列顺序含编码VHH的基因、接头基因及ALP基因。通过使用构成例3-1的表达载体转化或转染到细胞中,得到了VHH的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的ALP融合抗体。
构成例3-2的表达载体在启动子的下游以下列顺序含编码VHH的基因及ALP基因。通过使用构成例3-2的表达载体转化或转染到细胞中,得到了VHH的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的ALP融合抗体。
构成例3-3的表达载体在启动子的下游以下列顺序含ALP基因、接头基因及编码VHH的基因。通过使用构成例3-3的表达载体转化或转染到细胞中,得到了VHH的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的ALP融合抗体。
构成例3-4的表达载体在启动子的下游以下列顺序含ALP基因及编码VHH的基因。通过使用构成例3-4的表达载体转化或转染到细胞中,得到了VHH的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的ALP融合抗体。
构成例4-1的表达载体是含2个启动子的表达载体,在一方的启动子的下游以下列顺序含编码Fd的基因、接头基因及ALP基因,在另一方的启动子的下游,含编码轻链的基因。通过使用构成例4-1的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含Fd的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的融合蛋白质和轻链的Fab。
构成例4-2的表达载体是含2个启动子的表达载体,在一方的启动子的下游以下列顺序含编码轻链的基因、接头基因及ALP基因,在另一方的启动子的下游,含编码Fd的基因。通过使用构成例4-2的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含轻链的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的融合蛋白质和Fd的Fab。
构成例4-3的表达载体是含2个启动子的表达载体,在一方的启动子的下游以下列顺序含编码Fd的基因及ALP基因,在另一方的启动子的下游,含编码轻链的基因。通过使用构成例4-3的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含Fd的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的融合蛋白质和轻链的Fab。
构成例4-4的表达载体是含2个启动子的表达载体,在一方的启动子的下游以下列顺序含编码轻链的基因及ALP基因,在另一方的启动子的下游,含编码Fd的基因。通过使用构成例4-4的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含轻链的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的融合蛋白质和Fd的Fab。
构成例5-1的表达载体是含2个启动子的表达载体,在一方的启动子的下游以下列顺序含ALP基因、接头基因及编码Fd的基因,在另一方的启动子的下游,含编码轻链的基因。通过使用构成例5-1的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含Fd的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的融合蛋白质和轻链的Fab。
构成例5-2的表达载体是含2个启动子的表达载体,在一方的启动子的下游以下列顺序含ALP基因、接头基因及编码轻链的基因,在另一方的启动子的下游,含编码Fd的基因。通过使用构成例5-2的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含轻链的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的融合蛋白质和Fd的Fab。
构成例5-3的表达载体是含2个启动子的表达载体,在一方的启动子的下游以下列顺序含ALP基因及编码Fd的基因,在另一方的启动子的下游,含编码轻链的基因。通过使用构成例5-3的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含Fd的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的融合蛋白质和轻链的Fab。
构成例5-4的表达载体是含2个启动子的表达载体,在一方的启动子的下游以下列顺序含ALP基因及编码轻链的基因,在另一方的启动子的下游,含编码Fd的基因。通过使用构成例5-4的表达载体转化或转染到细胞中,作为ALP融合抗体,得到了含轻链的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的融合蛋白质和Fd的Fab。
知晓ALP是锌酶的一种。在本实施方式中,优选将包括含ALP基因和抗体基因的表达载体的细胞用含锌离子的培养基培养。培养基中的锌离子浓度优选为0.01mM以上、更优选为0.05mM以上、再优选为0.07mM以上。由于培养基中的锌离子浓度过高则有影响细胞的培养的可能性,锌离子浓度优选为0.25mM以下,更优选为0.20mM以下,再优选为0.15mM以下。细胞的培养可由对应于使用的细胞的公知的培养法适宜进行。含锌离子的培养基可通过添加可向适宜于使用的细胞的培养基供给锌离子的化合物或其溶液来调制。这样的化合物优选锌和无机酸或有机酸的盐。作为这样的盐,可举出例如氯化锌、硫酸锌、醋酸锌等。在本实施方式中,在将锌和无机酸或有机酸的盐添加到培养基中时,在培养基中的锌离子的浓度也可以所述盐的终浓度表示。
如试验例2所示,即使在细胞中表达ALP融合抗体之后在使用含锌离子的培养基培养,得到的ALP融合抗体中的ALP也不显示活性。从而,在本实施方式中,优选在使用表达载体转化或转染到细胞中后,至在该细胞中表达ALP融合抗体之间,向培养基添加锌离子或更换为含锌离子的培养基。
在本实施方式的制造方法中,从上述的细胞回收ALP融合抗体。由此,得到了BIAP或S-AP和抗体直接或经肽接头结合的,本实施方式的ALP融合抗体。例如,也可向含适当的可溶化剂的溶液溶解表达ALP融合抗体的细胞,回收游离到该溶液中的ALP融合抗体。在上述的细胞将ALP融合抗体分泌到培养基中时,回收培养上清。游离的ALP融合抗体可由亲和性层析法等的公知的方法回收。根据需要,也可将回收的ALP融合抗体由凝胶过滤等的公知的方法纯化。
在本实施方式的ALP融合抗体中,ALP的C末端的氨基酸残基和抗体的N末端的氨基酸残基也可直接或经肽接头结合。或者,在本实施方式的ALP融合抗体中,ALP的N末端的氨基酸残基和抗体的氨基酸序列的C末端的氨基酸残基也可直接或经肽接头结合。
如上所述,作为酶的ALP通常形成同源二聚体而存在。从而,在本实施方式中,ALP融合抗体中所含的ALP也可含2个亚基。2个亚基也可形成二聚体。此时,ALP融合抗体中所含的抗体可与2个亚基的一方结合,也可与两方结合。即,本实施方式的ALP融合抗体含抗体结合的ALP亚基和抗体未结合的ALP亚基,或者,含2个抗体结合的ALP亚基。抗体未结合的ALP亚基可由含ALP基因的表达载体得到。
参照图2A~C说明本实施方式的ALP融合抗体的例。在图2A~C中,“Fd(HC)”表示Fd,“LC”表示轻链,“接头”表示肽接头,“ALP亚基”表示单体的ALP。图中,Fd(HC)和LC之间的线表示二硫键,ALP亚基间的线表示二聚体的形成。但是,本实施方式的ALP融合抗体不限定于这些例。例如,ALP融合抗体中的Fd也可为全长的重链或Fd'。另外,ALP融合抗体中的VHH也可为scFv。
在抗体例1-1的ALP融合抗体中,重链部分(Fd)的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的2分子的ALP融合Fab由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。在抗体例1-2的ALP融合抗体中,轻链的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的2分子的ALP融合Fab由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。
在抗体例1-3的ALP融合抗体中,重链部分(Fd)的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的2分子的ALP融合Fab由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。在抗体例1-4的ALP融合抗体中,轻链的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的2分子的ALP融合Fab由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。
在抗体例2-1的ALP融合抗体中,重链部分(Fd)的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的2分子的ALP融合Fab由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。在抗体例2-2的ALP融合抗体中,轻链的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的2分子的ALP融合Fab由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。
在抗体例2-3的ALP融合抗体中,重链部分(Fd)的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的2分子的ALP融合Fab由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。在抗体例2-4的ALP融合抗体中,轻链的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的2分子的ALP融合Fab由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。
在抗体例3-1的ALP融合抗体中,VHH的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的2分子的ALP融合VHH由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。在抗体例3-2的ALP融合抗体中,VHH的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的2分子的ALP融合VHH由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。
在抗体例3-3的ALP融合抗体中,VHH的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的2分子的ALP融合VHH由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。在抗体例3-4的ALP融合抗体中,VHH的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的2分子的ALP融合VHH由ALP亚基间的二聚体形成形成复合体。
在抗体例3-5的ALP融合抗体中,VHH的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的ALP融合VHH和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例3-5的ALP融合抗体可通过使用构成例3-1的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例3-6的ALP融合抗体中,VHH的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的ALP融合VHH和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例3-6的ALP融合抗体可通过使用构成例3-2的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例3-7的ALP融合抗体中,VHH的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的ALP融合VHH和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例3-7的ALP融合抗体可通过使用构成例3-3的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例3-8的ALP融合抗体中,VHH的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的ALP融合VHH和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例3-8的ALP融合抗体可通过使用构成例3-4的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例4-1的ALP融合抗体中,重链部分(Fd)的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的ALP融合Fab和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例4-1的ALP融合抗体可通过使用例如构成例1-1的表达载体、含编码轻链的基因的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例4-2的ALP融合抗体中,轻链的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基经肽接头结合的ALP融合Fab和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例4-2的ALP融合抗体可通过使用例如构成例1-2的表达载体、含编码Fd的基因的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例4-3的ALP融合抗体中,重链部分(Fd)的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的ALP融合Fab和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例4-3的ALP融合抗体可通过使用例如构成例1-3的表达载体、含编码轻链的基因的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例4-4的ALP融合抗体中,轻链的C末端的氨基酸残基和ALP亚基的N末端的氨基酸残基直接结合的ALP融合Fab和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例4-4的ALP融合抗体可通过使用例如构成例1-4的表达载体、含编码Fd的基因的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例5-1的ALP融合抗体中,重链部分(Fd)的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的ALP融合Fab和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例5-1的ALP融合抗体可通过使用例如构成例2-1的表达载体、含编码轻链的基因的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例5-2的ALP融合抗体中,轻链的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基经肽接头结合的ALP融合Fab和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例5-2的ALP融合抗体可通过使用例如构成例2-2的表达载体、含编码Fd的基因的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例5-3的ALP融合抗体中,重链部分(Fd)的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的ALP融合Fab和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例5-3的ALP融合抗体可通过使用例如构成例2-3的表达载体、含编码轻链的基因的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
在抗体例5-4的ALP融合抗体中,轻链的N末端的氨基酸残基和ALP亚基的C末端的氨基酸残基直接结合的ALP融合Fab和抗体未结合的ALP亚基在ALP亚基间形成二聚体。抗体例5-4的ALP融合抗体可通过使用例如构成例2-4的表达载体、含编码Fd的基因的表达载体和含ALP基因的表达载体转化或转染到细胞中而得到。
本实施方式的ALP融合抗体可在免疫测定中用于检测受试物质。从而,本发明的一实施方式是含上述的ALP融合抗体的免疫测定用试剂。免疫测定的种类不特别限定,可从例如ELISA法、蛋白印迹法、免疫复合体转移法(参照特开平1-254868号公报)等的公知的免疫测定方法适宜选择。在它们之中,也优选ELISA法。ELISA法的种类也可为夹心法、竞争结合法、直接法、间接法等之任一者。
在本实施方式中,试剂的形态不特别限定,可为固体(例如粉末、结晶、冷冻干燥品等),也可为液体(例如溶液、悬浮液、乳浊液等)。在试剂是液体时,溶剂只要是可溶解本实施方式的ALP融合抗体而保存,就不特别限定。作为溶剂,可举出例如,水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲生理盐水(TBS)、Good的缓冲液等。作为Good的缓冲液,可举出例如MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS等。
本实施方式的免疫测定用试剂也可含公知的添加物。作为添加物,可举出例如牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质稳定化剂、叠氮化钠等的防腐剂、氯化钠等的无机盐类等。
在本实施方式中,也可将收容免疫测定用试剂的容器捆包到箱中的等,作为试剂盒提供于使用者。在箱中,也可同装附带文书。在附带文书中,也可对于免疫测定用试剂的组成、使用方法、保存方法等进行记载。试剂盒的一例示于图3。在图3中,11表示本实施方式的试剂盒,12表示收容含本实施方式的ALP融合抗体的免疫测定用试剂的第1容器,13表示捆包箱,14表示附带文书。
在免疫测定是由夹心ELISA法的测定时,本实施方式的ALP融合抗体之外,使用与受试物质特异性地结合的捕获物质。从而,本发明的进一步的的实施方式是包括含上述的ALP融合抗体的第1试剂和含与受试物质特异性地结合的捕获物质的第2试剂的免疫测定用试剂盒。第1试剂的详细与对于上述的本实施方式的免疫测定用试剂而所述的同样。
与受试物质特异性地结合的捕获物质是指用于通过自身固定于固相而在固相上捕获受试物质的物质。捕获物质的种类不特别限定,可由受试物质的种类适宜选择。作为捕获物质,可举出例如抗体、抗原、寡核苷酸探针、受体、与受体结合的配体、适体等。以下,作为捕获物质使用的抗体也称为“捕获抗体”。捕获抗体可为单克隆抗体及多克隆抗体之任一者,优选为单克隆抗体。在捕获抗体是单克隆抗体时,优选捕获抗体所识别的表位与本实施方式的ALP融合抗体所识别的表位不同。
在本实施方式的免疫测定用试剂盒中,第1试剂中所含的本实施方式的ALP融合抗体优选作为夹心ELISA法中的检测抗体使用。检测抗体是指与受试物质特异性地结合,并且具有标记物质的抗体,是指经该标记物质提供能检测的信号的抗体。检测抗体优选不固定于固相。
在本实施方式中,也可将各自收容第1试剂及第2试剂的容器捆包到箱中的等,作为试剂盒提供于使用者。在箱中,也可同装附带文书。在附带文书中,也可对于本实施方式的免疫测定用试剂盒的构成、各试剂的组成、使用方法、保存方法等进行记载。试剂盒的一例示于图4。在图4中,21表示本实施方式的试剂盒,22表示收容含本实施方式的ALP融合抗体的第1试剂的第1容器,23表示收容含与受试物质特异性地结合的捕获物质的第2试剂的第2容器,24表示捆包箱,25表示附带文书。
本实施方式的免疫测定用试剂盒也可还含用于使捕获物质固定化的固相。固相只要是能固定捕获物质的不溶性的载体即可。固相的原料不特别限定,可选自例如,有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等。作为有机高分子化合物,可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物,可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子,可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可将这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定,可举出例如微平板、微管、试管、粒子、膜等。在它们之中,也优选微平板及粒子(特别是磁性粒子)。
本实施方式的免疫测定用试剂盒也可还含ALP的基质。作为基质,可举出例如CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。
本实施方式的免疫测定用试剂盒也可还含受试物质的校准物。作为校准物的一例,可举出受试物质的定量用校准物。此校准物也可例如,具备不含受试物质的缓冲液(阴性对照)和以已知浓度含受试物质的缓冲液。在受试物质是蛋白质时,校准物中所含的受试物质可为重组蛋白质,也可为基于受试物质的氨基酸序列而合成的多肽。
本发明的进一步的的实施方式是使用上述的ALP融合抗体的免疫测定方法。此测定方法包括例如,使用本实施方式的ALP融合抗体,对试样中的受试物质进行测定。受试物质只要是本实施方式的ALP融合抗体可特异性地结合的物质,就不特别限定。作为受试物质,可举出例如蛋白质、核酸、多糖类、脂质、半抗原、化合物、细菌、病毒等。试样只要是含受试物质,就不特别限定。作为试样,可举出例如,血液、淋巴液等的生物体试样、尿、便等的排泄物、河川水、海水、土壤等的环境样品等。
作为一例,接下来对于由夹心ELISA法测定的情况而进行说明。在此例中,本实施方式的ALP融合抗体作为检测抗体使用。首先,使含受试物质、与受试物质特异性地结合的捕获物质和本实施方式的ALP融合抗体(检测抗体)的复合体在固相上形成。该复合体可通过将可含受试物质的试样、捕获物质和检测抗体混合来形成。进而,通过使含复合体的溶液与可固定捕获物质的固相接触,可使上述的复合体在固相上形成。或者,也可使用预先固定捕获物质的固相。即,通过使固定捕获物质的固相、可含受试物质的试样和检测抗体接触,可使上述的复合体在固相上形成。进而,通过将在固相上形成的复合体用现有技术中公知的方法检测,可对试样中所含的受试物质进行测定。在本实施方式中,通过检测由检测抗体中所含的ALP发生的信号,可对试样中的受试物质进行测定。
向捕获物质的固相的固定的实施方式不特别限定。例如,可使捕获物质和固相直接结合,也可使捕获物质和固相经别的物质间接结合。作为直接的结合,可举出例如,物理的吸附等。作为间接的结合,可举出例如,经生物素类和亲和素类的组合的结合。此时,通过将捕获物质预先用生物素类修饰,使固相预先结合亲和素类,可经生物素类和亲和素类的结合,使捕获物质和固相间接结合。生物素类含生物素、及脱硫生物素等的生物素类似物。亲和素类含亲和素、以及链霉亲和素及Tamavidin(注册商标)等的亲和素类似物。
在本实施方式中,也可在复合体的形成和复合体的检测之间,进行除去未形成复合体的未反应的游离成分的B/F(Bound/Free)分离。未反应的游离成分是指不构成复合体的成分。例如,可举出不与受试物质结合的捕获物质及检测抗体等。B/F分离的手段不特别限定,当固相是粒子时,通过由离心分离,仅回收捕获复合体的固相,可进行B/F分离。当固相是微平板或微管等的容器时,通过除去含未反应的游离成分的液,可进行B/F分离。另外,在固相是磁性粒子时,通过在用磁铁磁约束磁性粒子的状态下由管嘴吸除含未反应的游离成分的液,可进行B/F分离,在自动化的观点优选。也可在除去未反应的游离成分之后,将捕获复合体的固相用PBS等的适合的水性介质清洗。
在本说明书中,“检测信号”含定性检测信号的有无,对信号强度进行定量,及半定量检测信号的强度。半定量的检测是指将信号的强度如“信号不发生”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中,优选定量或半定量检测信号的强度。
检测信号的方法本身是在现有技术中公知的。在本实施方式中,可通过使用分光光度计等的公知的装置测定通过使固相上的复合体和ALP的基质反应而发生的光、色等的信号来进行。ALP的基质如上述。
信号的检测结果可作为受试物质的测定结果使用。例如,在对信号的强度进行定量时可以信号强度的测定值本身或从该测定值取得的值作为受试物质的测定结果使用。作为从信号强度的测定值取得的值,可举出例如,从该测定值减去阴性对照试样的测定值或背景的值的值等。另外,也可将信号强度的测定值适用于校准曲线,确定受试物质的量或浓度的值。阴性对照试样可适宜选择,可举出例如,已知不含受试物质的试样等。
在本实施方式中,优选由使用固定于磁性粒子的捕获抗体和本实施方式的ALP融合抗体(检测抗体)的夹心ELISA法测定试样中的受试物质。此时,测定也可使用HISCL系列(Sysmex株式会社制)等的市售的全自动免疫测定装置进行。
接下来,将本发明由实施例详细地说明,本发明不限定于这些实施例。
【实施例】
[实施例1:牛小肠来源ALP融合抗体的制作]
制作兔抗体的Fab和牛小肠来源ALP亚基相结合的融合蛋白质。该融合蛋白质通过ALP亚基形成二聚体,成为具有2分子的Fab的ALP融合抗体。这相当于上述的抗体例1-1中所示的结构的ALP融合抗体。
(1)表达载体的调制
(1.1)兔抗体的基因的取得
从用CD80免疫的兔的末梢血取得淋巴细胞,从该淋巴细胞提取mRNA而合成cDNA。使用用于克隆抗体基因的公知的引物扩增得到的cDNA,制作Fab噬菌体库。使用得到的库,由公知的Fab噬菌体展示法及生物淘选(参照Lang IM,Barbas CF 3rd,Schleef RR.,Recombinant rabbit Fab with binding activity to type-1plasminogen activatorinhibitor derived from a phage-display library against humanα-granules,(1996)Gene 172(2):295-8及Philippa M.O'Brien,Robert Aitken,Antibody Phage Display,(2002)Methods in Molecular Biology Volume No.178)得到兔抗CD80抗体的Fab克隆。使取得的兔抗CD80抗体的Fab克隆的基因与含编码兔抗体的Fc区域的基因的质粒DNA整合,取得含兔抗CD80抗体的基因的质粒DNA。兔抗CD80抗体的Fd(Fab的重链部分)及轻链的氨基酸序列各自示于SEQ ID NO:11及12。另外,编码它们的氨基酸序列的碱基序列各自示于SEQID NO:13及14。
(1.2)牛小肠来源ALP的基因的取得
基于记载在美国专利第6,406,899号说明书的BIAPII的氨基酸序列,向GenScript公司委托基因合成,取得含BIAPII基因的质粒DNA。BIAPII的氨基酸序列及编码其的碱基序列各自示于SEQ ID NO:1及2。
(1.3)Fd-接头-BIAPII表达载体的制作
(i)BIAPII表达载体的制作
将含BIAPII基因的质粒DNA用于模板,由PCR法取得编码BIAPII的DNA片段(BIAPII插入子)。将pcDNA3.4载体用于模板,由反向PCR法得到线状化载体DNA。PCR使用KOD Plusneo(东洋纺株式会社),根据附带文书的记载而进行。在PCR中使用的引物的碱基序列如下所述。
·载体用引物组
正向:5'-TGATAAAAGG GTTCGATCCC TACC-3'(SEQ ID NO:15)
反向:5'-GCAGTGCACG GTGGCGCAGT ACACC-3'(SEQ ID NO:16)
·BIAPII插入子用引物组
正向:5'-GCCACCGTGC ACTGCTTAAT TCCGGCAGAA GAAGAAAACC-3'(SEQ ID NO:17)
反向:5'-CGAACCCTTT TATCACGCAG GTGCAGGCAA GTTACAATC-3'(SEQ ID NO:18)
使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit(宝生物株式会社),向pcDNA3.4的线状化载体DNA连接BIAPII插入子而得到BIAPII表达载体。In-Fusion反应根据试剂盒的附带文书的记载而进行。
(ii)向BIAPII表达载体插入Fd基因
将含上述的兔抗CD80抗体的基因的质粒DNA用于模板,由PCR法取得编码Fd及肽接头的DNA片段(Fd-接头插入子)。在得到的Fd插入子中,在编码兔抗CD80抗体的Fd的基因的下游连接有编码肽接头的基因。肽接头的种类是上述的GS1、GS2、GS3、EK1、EK2及EK3。将上述的BIAPII表达载体用于模板,由反向PCR法得到含BIAPII基因的线状化载体DNA。PCR使用KOD Plus neo(东洋纺株式会社),根据附带文书的记载而进行。在PCR中使用的引物的碱基序列如下所述。
·载体用引物组
正向GS1:5'-GGTGGCGGTG GATCCTTAAT TCCGGCAGAA GAAGAAAACC-3'(SEQ ID NO:19)
正向GS2:5'-GTGGATCCGG AGGGGGCGGA AGTTTAATTC CGGCAGAAGA AGAAAACC-3'(SEQ ID NO:20)
正向GS3:5'-GGAGGGGGCG GAAGTGGCGG GGGAGGTTCA TTAATTCCGG CAGAAGAAGAAAACC-3'(SEQ ID NO:21)
正向EK1:5'-GAAGCCGCTG CTAAGTTAAT TCCGGCAGAA GAAGAAAACC-3'(SEQ ID NO:22)
正向EK2:5'-CTGCTAAGGA GGCAGCCGCG AAATTAATTC CGGCAGAAGA AGAAAACC-3'(SEQ ID NO:23)
正向EK3:5'-GAGGCAGCCG CGAAAGAAGC AGCGGCTAAA TTAATTCCGG CAGAAGAAGAAAACC-3'(SEQ ID NO:24)
反向:5'-GCAGTGCACG GTGGCGCAGT ACACC-3'(SEQ ID NO:25)
·Fd插入子用引物组
正向:5'-GCCACCGTGC ACTGCCAGTC GGTGGAGGAG TCCGG-3'(SEQ ID NO:26)
反向GS1:5'-GGATCCACCG CCACCCGTGG GCTTGCTGCA TGTCGAGGG-3'(SEQ ID NO:27)
反向GS2:5'-CCCCCTCCGG ATCCACCGCC ACCCGTGGGC TTGCTGCATG TCGAGGG-3'(SEQID NO:28)
反向GS3:5'-ACTTCCGCCC CCTCCGGATC CACCGCCACC CGTGGGCTTG CTGCATGTCGAGGG-3'(SEQ ID NO:29)
反向EK1:5'-CTTAGCAGCG GCTTCCGTGG GCTTGCTGCA TGTCGAGGG-3'(SEQ ID NO:30)
反向EK2:5'-GCTGCCTCCT TAGCAGCGGC TTCCGTGGGC TTGCTGCATG TCGAGGG-3'(SEQID NO:31)
反向EK3:5'-TTTCGCGGCT GCCTCCTTAG CAGCGGCTTC CGTGGGCTTG CTGCATGTCGAGGG-3'(SEQ ID NO:32)
使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit(宝生物株式会社),向含BIAPII基因的线状化载体DNA连接Fd插入子而得到Fd-接头-BIAPII表达载体。In-Fusion反应根据试剂盒的附带文书的记载而进行。在此表达载体中,在编码兔抗CD80抗体的Fd的基因的下游连接有编码肽接头的基因及BIAPII基因。这些表达载体相当于上述的构成例1-1中所示的结构的表达载体。
(1.4)轻链表达载体的制作
将含上述的兔抗CD80抗体的基因的质粒DNA用于模板,由PCR法取得编码轻链的DNA片段(LC插入子)。将pcDNA3.4载体用于模板,由反向PCR法得到线状化载体DNA。PCR使用KOD Plus neo(东洋纺株式会社),根据附带文书的记载而进行。在PCR中使用的引物的碱基序列如下所述。
·载体用引物组
正向:5'-TAATCTAGAT AATTAAAGGG TTCG-3'(SEQ ID NO:33)
反向:5'-GCTGCGATAG CCCGGAAACA GTACC-3'(SEQ ID NO:34)
·LC插入子用引物组
正向:5'-CCGGGCTATC GCAGCGAGCT CGTGATGACC CAGAC-3'(SEQ ID NO:35)
反向:5'-TAATTATCTA GATTATCAAC AGTCACCCCT ATTGAAGC-3'(SEQ ID NO:36)
使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit(宝生物株式会社),向pcDNA3.4的线状化载体DNA连接LC插入子而得到轻链表达载体。In-Fusion反应根据试剂盒的附带文书的记载而进行。
(2)产生抗体的细胞的制作及培养
(2.1)向宿主细胞的转染
在以成为终浓度0.1mM的方式添加氯化锌(岸田化学)的溶液的培养基中,5%CO2气氛下、于37℃振荡培养(125rpm)Expi293F(商标)细胞。准备对应于样品数的数的25.5mL的细胞培养物(3.0×106个细胞/mL)。向Fd-接头-BIAPII表达载体(约15μg)及轻链表达载体(约15μg)的混合物添加适量的Opti-MEMI(商标)而设为1.5mL,稳搅拌而调制DNA溶液。稳搅拌ExpiFectamine 293试剂(80μL)和Opti-MEMI(1.5mL),于室温静置5分钟而调制转染试剂。稳搅拌DNA溶液和转染试剂,于室温静置20分钟。将得到的混合液(3mL)添加到细胞培养物(25.5mL)中,5%CO2气氛下、于37℃振荡培养20小时(125rpm)。20小时后,向各培养物添加ExpiFectamine(商标)转染增强子1及2各自150μL及1.5mL,5%CO2气氛下、于37℃振荡培养5天(125rpm)。
(2.2)抗体的回收及纯化
在自转染起5天后回收培养上清。在培养上清中,含从转染的Expi293F(商标)细胞分泌的各ALP融合抗体。向离心沉降管移回收的培养上清而离心分离(1000g、5分钟、4℃),向新的离心沉降管移上清。将上清再次离心分离(10000g、10分钟、4℃),向新的离心沉降管移上清。将上清使用Amicon Ultra-4,30k(Merck公司)浓缩。将浓缩的上清由使用AKTAavant 25(GE Healthcare公司)及Superdex 200Increase 10/300GL(GE Healthcare公司)的凝胶过滤纯化。在凝胶过滤中,注射量设为500μL,在电泳缓冲液中使用ALP用缓冲液(100mM三乙醇胺(TEA)、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH 7.0),以1mL/min的流速分离。使用nanodrop-1000(Thermo Fisher公司)、从280nm的吸光度测定凝胶过滤纯化的ALP融合抗体的浓度。
[试验例1:ALP融合抗体的抗原检测能]
以实施例1的ALP融合抗体作为检测抗体使用而进行ELISA法,探讨抗原检测能。
(1)由化学发光ELISA的测定
将兔抗CD80抗体(IgG)用PBS稀释为1μg/mL。向96孔黑板以100μL/孔添加得到的抗体溶液,于4℃一晚静置而将抗体固定化于孔。从板除去抗体溶液之后,以300μL/孔添加BufferI'(100mM HEPES、1%BSA、0.05%ProClin(商标)、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH 8.0),于4℃静置一晚而封闭。从板除去溶液之后,作为抗原溶液,以100μL/孔添加人CD80/B7-1蛋白(His标签)溶液(0.005、0.020、0.078、0.313、1.25、5.0或20ng/mL)。将板于室温以500rpm振荡1小时而进行抗原抗体反应。将板用HISCL清洗液(Sysmex株式会社)清洗3次之后,以100μL/孔添加被BufferI'稀释的实施例1的各ALP融合抗体(200ng/mL)。将板于室温以500rpm振荡1小时而进行抗原抗体反应。将板用HISCL清洗液清洗3次之后,以100μL/孔添加作为ALP的化学发光底物的溶液的HISCL R5试剂(Sysmex株式会社),立即用FLUOstarOPTIMA(BMG LABTECH公司)测定发光强度。
(2)结果
测定结果示于图5。图中,GS1、GS2、GS3、EK1、EK2及EK3是ALP融合抗体中的肽接头的种类。如图所示,即使使用任何ALP融合抗体,对应于抗原浓度而发光强度增大。从而表明,任何ALP融合抗体均保持同程度的抗原检测能。
[试验例2:锌离子的影响的探讨]
将含实施例1中得到的表达载体的细胞在各种条件下用添加锌的培养基或未添加锌的培养基培养,对ALP融合抗体的ALP活性进行测定。
(1)产生抗体的细胞的培养及抗体的回收
(1.1)使用未添加锌的培养基的细胞培养
除了使用在未添加锌的通常的培养基中培养的Expi293F(商标)细胞之外,与实施例1同样地,向该细胞转染Fd-接头-BIAPII表达载体及轻链表达载体。20小时后,将培养基替换为添加未添加锌的培养基或氯化锌溶液的培养基(终浓度0.1mM)。进而,添加ExpiFectamine(商标)转染增强子1及2,5%CO2气氛下、于37℃振荡培养5天(125rpm)。培养后,与实施例1同样地,从培养上清回收及纯化ALP融合抗体(GS1接头)。
(1.2)在ALP融合抗体的表达后使用锌添加培养基的细胞培养
与上述(1.1)同样地,进行转染、20小时后的培养基更换及5天的培养。5天后,将培养基更换为添加未添加锌的培养基或氯化锌溶液的培养基(终浓度0.1mM),再培养1小时。培养后,与实施例1同样地,从培养上清回收及纯化ALP融合抗体。
(1.3)使用高浓度的锌添加培养基的细胞培养
除了使用氯化锌的浓度是0.25mM或0.5mM的培养基之外,与实施例1同样地,进行转染、20小时后的培养基更换及5天的培养。培养后,与实施例1同样地,从培养上清回收及纯化ALP融合抗体(GS1接头)。为了比较,使用氯化锌的浓度是0.1mM的培养基,与实施例1同样地回收及纯化ALP融合抗体(GS1接头)。
(2)ALP活性的测定
将ALP融合抗体用ALP用缓冲液稀释。向96孔黑板以10μL/孔添加得到的抗体溶液。以100μL/孔添加HISCL R5试剂(Sysmex株式会社),立即用FLUOstar OPTIMA(BMG Labtech公司)测定发光强度。测定结果示于图6A~C。在图6A及B显示将从转染后用锌添加培养基培养的细胞得到的ALP融合抗体的ALP活性设为100%时的从用未添加锌的培养基培养的细胞及ALP融合抗体的表达后用锌添加培养基培养的细胞得到的ALP融合抗体的ALP活性。在图6C显示将从用氯化锌的浓度是0.1mM的培养基培养的细胞得到的ALP融合抗体的ALP活性设为100%时的从用氯化锌的浓度是0.25mM或0.5mM的培养基培养的细胞得到的ALP融合抗体的ALP活性。
(3)结果
如图6A所示,在从用未添加锌的培养基培养的细胞得到的ALP融合抗体中,ALP活性显著地低。结果表明,为了发挥ALP融合抗体的ALP活性,向培养基添加锌是必要的。如图6B所示,即使从ALP融合抗体的表达后用锌添加培养基培养的细胞得到的ALP融合抗体,ALP活性也显著地低。结果,即使在被认为ALP融合抗体表达的时期将锌添加到培养基中,ALP融合抗体的ALP活性也不增大,表明转染时起锌的添加是必要的。
如图6C所示,即使在使用含0.25mM的氯化锌的培养基时,也充分地确认到ALP活性。在使用含0.5mM的氯化锌的培养基时,由于细胞被杀灭,无法测定到ALP活性。
[试验例3:实施例1的ALP融合抗体的一致性]
对于实施例1的ALP融合抗体及用化学修饰法得到的ALP标记抗体而比较抗体分子的一致性。
(1)ALP标记抗体的制作
使用含在实施例1中得到的兔抗CD80抗体的基因的质粒DNA,得到兔抗CD80抗体。从得到的抗体由常规方法得到Fab。使得到的Fab和牛小肠来源ALP(ALP55、ORIENTAL酵母株式会社)或重组型ALP(rALP、Roche公司)使用交联剂结合而得到ALP标记抗体。
(2)尺寸排除柱层析法(SEC)及SDS-PAGE
将实施例1的ALP融合抗体(GS1接头)及ALP标记抗体的各自由使用KTA avant25(GE Healthcare公司)及Superdex 200Increase 10/300GL(GE Healthcare公司)的凝胶过滤分离。凝胶过滤与实施例1同样地进行。另外,将由凝胶过滤分离的ALP融合抗体及ALP标记抗体的各级分由非还原条件的SDS-PAGE分析。
(3)结果
凝胶过滤的溶出曲线示于图7A及B。另外,SDS-PAGE的结果示于图8A及B。图中,“Fab+”是指1分子的ALP和1分子的Fab相结合的标记抗体,“Fab++”是指1分子的ALP和2分子的Fab相结合的标记抗体,“Fab+++”是指1分子的ALP和3分子的Fab相结合的标记抗体。参照图7A,在凝胶过滤中,Fab+++溶出到10mL~10.5mL的级分,Fab++溶出到11mL~11.5mL的级分,Fab+溶出到12mL~12.5mL的级分。参照图7B,在凝胶过滤中,ALP融合抗体溶出到12mL~12.5mL的级分。如图7A所示得知,在用化学修饰法得到的ALP标记抗体中,各种各样的分子量的标记抗体、未修饰的ALP及Fab'混在。图8A也表明,用化学修饰法得到的ALP标记抗体不均一。一方面,如图7B及图8B所示,在ALP融合抗体的溶出曲线中确认到锐利的单峰。从而得知,本实施方式的ALP融合抗体是均一的分子的集团。
[试验例4:含实施例1的ALP融合抗体的试剂的性能]
使用实施例1的ALP融合抗体调制用于全自动免疫测定装置的试剂,探讨此试剂的性能。为了比较,还探讨对于使用在试验例3中分离的ALP标记抗体的各级分的试剂。
(1)试剂的调制
将兔抗CD80抗体(半IgG)由惯用的方法用生物素标记,溶解于R1试剂用缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCl、1%BSA、pH 7.4)而调制R1试剂(捕获抗体试剂)。作为R2试剂(固相),使用含链霉亲和素结合磁性粒子的HISCL R2试剂(Sysmex株式会社)。向R3试剂用缓冲液(50mM HEPES、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、1%BSA、pH 7.3)溶解实施例1的ALP融合抗体(GS1接头)而调制R3试剂(检测抗体试剂)。R3试剂中的ALP融合抗体的浓度是200ng/mL。为了比较,同样地调制含ALP标记抗体的各级分(Fab+、Fab++或Fab+++)的R3试剂。R3试剂中的ALP标记抗体的浓度以与含ALP融合抗体的R3试剂的ALP活性变得同程度的方式调整。作为R4试剂(测定用缓冲液),使用HISCL R4试剂(Sysmex株式会社)。作为R5试剂(底物溶液),使用HISCL R5试剂(Sysmex株式会社)。将人CD80/B7-1蛋白(His标签)用BufferI'阶段稀释而调制抗原溶液。作为磁性粒子的清洗液,使用HISCL清洗液(Sysmex株式会社)。
(2)测定
使用上述的试剂、由全自动免疫测定装置HISCL-800(Sysmex株式会社制)进行测定。此测定基于磁性粒子上的夹心ELISA。具体性的操作如以下。向R1试剂(50μL)加抗原溶液(20μL)而混合之后,加R2试剂(30μL)而混合。对得到的混合液中的磁性粒子进行集磁而除去上清,加HISCL清洗液(300μL)而清洗磁性粒子。除去上清,向磁性粒子添加R3试剂(100μL)而混合。对得到的混合液中的磁性粒子进行集磁而除去上清,加HISCL清洗液(300μL)而清洗磁性粒子。除去上清,向磁性粒子添加R4试剂(50μL)及R5试剂(100μL),充分混合,对化学发光强度进行测定。另外,为了探讨测定的背景,除了代替抗原溶液而使用不含抗原的BufferI'以外,与上述同样地进行测定。从各抗原溶液的测定值及背景算出测定的SN比。
(3)结果
测定结果示于图9A及B。如图9A所示,背景是,作为检测抗体而使用ALP融合抗体时的方与使用ALP标记抗体时相比显著地低。如图9B所示,SN比是,作为检测抗体而使用ALP融合抗体时的方与使用ALP标记抗体时相比显著地高。从这些结果得知,与使用含用化学修饰法得到的ALP标记抗体的检测抗体试剂相比,使用含ALP融合抗体的检测抗体试剂的方可高灵敏度检测抗原。
[实施例2:牛小肠来源ALP融合抗体的制作(2)]
作为抗体部分与实施例1的ALP融合抗体不同的ALP融合抗体,制作小鼠抗人IgG抗体的Fab和ALP亚基相结合的融合蛋白质。这相当于上述的抗体例1-1中所示的结构的ALP融合抗体。
(1)表达载体的制作
从用人IgG免疫的小鼠的末梢血取得淋巴细胞,从该淋巴细胞提取mRNA而合成cDNA。使用得到的cDNA,与实施例1同样地,取得含小鼠抗人IgG抗体的基因的质粒DNA。使用含此抗体基因的质粒DNA和实施例1的BIAPII表达载体,与实施例1同样地得到Fd-接头-BIAPII表达载体。在得到的表达载体中,在编码小鼠抗人IgG抗体的Fd的基因的下游连接有编码肽接头GS1、GS3、EK1或EK3的基因及BIAPII基因。另外,使用含上述的小鼠抗人IgG抗体的基因的质粒DNA,与实施例1同样地得到轻链表达载体。
(2)产生抗体的细胞的制作及培养
与实施例1同样地向用添加氯化锌溶液的培养基培养的Expi293F(商标)细胞转染上述的表达载体。在自转染起5天后回收培养上清,与实施例1同样地浓缩及纯化ALP融合抗体。
[试验例5:含实施例2的ALP融合抗体的试剂的品质]
对在实施例2中得到的ALP融合抗体和由化学修饰法得到的ALP标记抗体的分子的一致性进行比较。另外,使用在实施例2中得到的ALP融合抗体而调制用于全自动免疫测定装置的试剂,探讨此试剂的性能及保存稳定性。为了比较,还探讨对于使用ALP标记抗体的试剂。
(1)ALP标记抗体的制作及抗体分子的一致性的确认
与试验例3同样地,使小鼠抗人IgG抗体的Fab和ALP55(ORIENTAL酵母株式会社)或rALP(Roche公司)结合,得到ALP标记抗体。将实施例2中得到的ALP融合抗体及ALP标记抗体的各自与试验例3同样地由凝胶过滤分离。另外,将由凝胶过滤分离的ALP融合抗体及ALP标记抗体的各级分由非还原条件的SDS-PAGE分析。凝胶过滤及SDS-PAGE的结果与试验例3的结果同样,在用化学修饰法得到的ALP标记抗体中,各种各样的分子量的标记抗体、未修饰的ALP及Fab'混在。一方面,ALP融合抗体是均一的分子的集团。
(2)试剂的调制及测定
与试验例4同样地,调制含生物素标记的小鼠抗人IgG抗体(半IgG)的R1试剂、及含在实施例2中得到的ALP融合抗体的R3试剂。为了比较,同样地调制含用凝胶过滤得到的级分的ALP标记抗体的R3试剂。作为ALP标记抗体的级分,使用含1分子的ALP和2分子的Fab相结合的标记抗体的级分(rALP-2Fab Fr.B4、rALP-2Fab Fr.B5及ALP55-2Fab Fr.B4)和含1分子的ALP和1分子的Fab结合的标记抗体的级分(ALP55-1Fab Fr.B6)。各R3试剂中的抗体浓度基于各抗体的ALP活性而调整。将人IgG抗体用BufferI'稀释而调制抗原溶液。R2试剂、R4试剂、R5试剂及清洗液与试验例4相同。使用这些试剂、由HISCL-800(Sysmex株式会社制)进行测定,算出测定的背景和SN比。测定结果示于图10。图10中,以◆表示的点表示背景的值,坐标图的条表示SN比。
(3)试剂的保存稳定性的探讨
使用于4℃保存的R3试剂和于40℃保存1周的R3试剂,由HISCL-800(Sysmex株式会社制)测定不含抗原溶液及抗原的BufferI',对测定值进行比较。结果示于表1。表中,“NC”表示不含抗原的BufferI',PC表示抗原溶液,“计数”表示测定值,“vs.4℃”表示使用于40℃保存1周的R3试剂得到的测定值相对于使用于4℃保存的R3试剂得到的测定值的比例。
【表1】
(4)结果
如图10所示,背景是,使用ALP融合抗体时的方与使用ALP标记抗体时相比显著地低。SN比是,使用ALP融合抗体时的方与使用ALP标记抗体时相比显著地高。如表1所示得知,在将各R3试剂于40℃保存1周时,由含ALP融合抗体的R3试剂的PC的测定值与由含ALP标记抗体的R3试剂得出的PC的测定值相比,不怎么降低。从而表明,含ALP融合抗体的试剂的方与含ALP标记抗体的试剂相比,保存稳定性高。
[实施例3:牛小肠来源ALP融合抗体的制作(3)]
使用含在实施例2中得到的抗体基因的质粒DNA及BIAPII表达载体,由与实施例1同样的方法制作上述的构成例1-2、1-3、2-1及2-2中所示的结构的表达载体。使用这些表达载体而制作上述的抗体例1-2、1-3、2-1及2-2中所示的ALP融合抗体。
(1)表达载体的制作及抗体的取得
(1.1)抗体例1-2的ALP融合抗体
将含在实施例2中得到的抗体基因的质粒DNA用于模板,取得编码轻链及肽接头的DNA片段。将得到的DNA片段与线状化的BIAPII表达载体DNA连接,制作LC-接头-BIAPII表达载体。在此表达载体中,在编码轻链的基因的下游连接有编码肽接头的基因及BIAPII基因。另外,将含上述的抗体基因的质粒DNA用于模板而取得编码Fd的DNA片段,与实施例1同样地制作含编码Fd的基因的表达载体(Fd表达载体)。向Expi293F(商标)细胞转染这些表达载体而得到抗体例1-2的ALP融合抗体。
(1.2)抗体例1-3的ALP融合抗体
将含在实施例2中得到的抗体基因的质粒DNA用于模板,取得编码Fd的DNA片段。将得到的DNA片段与线状化的BIAPII表达载体DNA连接而制作Fd-BIAPII表达载体。在此表达载体中,在编码Fd的基因的下游连接有BIAPII基因。向Expi293F(商标)细胞转染此表达载体和在实施例2中得到的轻链表达载体而得到抗体例1-3的ALP融合抗体。
(1.3)抗体例2-1的ALP融合抗体
将含在实施例2中得到的抗体基因的质粒DNA用于模板而取得编码肽接头及Fd的DNA片段。将得到的DNA片段与线状化的BIAPII表达载体DNA连接而制作BIAPII-接头-Fd表达载体。在此表达载体中,在BIAPII基因的下游连接有编码肽接头的基因及编码Fd的基因。向Expi293F(商标)细胞转染此表达载体和在实施例2中得到的轻链表达载体,得到抗体例2-1的ALP融合抗体。
(1.4)抗体例2-2的ALP融合抗体
将含在实施例2中得到的抗体基因的质粒DNA用于模板而取得编码肽接头及轻链的DNA片段。将得到的DNA片段与线状化的BIAPII表达载体DNA连接,制作BIAPII-接头-LC表达载体。在此表达载体中,在BIAPII基因的下游连接有编码肽接头的基因及编码轻链的基因。向Expi293F(商标)细胞转染此表达载体和上述的Fd表达载体而得到抗体例2-2的ALP融合抗体。
(2)抗体分子的一致性及试剂的性能的探讨
使用制作的各ALP融合抗体,与试验例3同样地探讨抗体分子的一致性。凝胶过滤的结果示于图11A~D。与试验例2同样地对各ALP融合抗体的ALP活性进行测定。为了比较,还进行使用实施例1的ALP融合抗体(抗体例1-1)的测定。结果示于图11E。代替实施例1的ALP融合抗体而使用上述(1)中得到的抗体例1-2、1-3及2-1的各ALP融合抗体作为检测抗体以外与试验例1同样地进行ELISA法。为了比较,还进行使用实施例1的ALP融合抗体(抗体例1-1)的测定。结果示于图11F。
参照图11A~D,在凝胶过滤中,抗体例1-2、1-3、2-1及2-2的ALP融合抗体均溶出到11mL~11.5mL的级分。如图11A~D所示,得到的ALP融合抗体是均一的分子的集合体。另外,如图11E所示,得到的ALP融合抗体具有ALP活性。如图11F所示,与抗体例1-1的ALP融合抗体同样地,抗体例1-2、1-3及2-1的各ALP融合抗体对应于抗原浓度而发光强度增大。从而,抗体例1-2、1-3及2-1的ALP融合抗体均具有抗原检测能。
[实施例4:牛小肠来源ALP融合抗体的制作(4)]
制作羊驼抗CTLA-4抗体的VHH和ALP亚基相结合的融合蛋白质,得到ALP融合抗体。这相当于上述的抗体例3-1中所示的结构的ALP融合抗体。
(1)表达载体的调制及抗体的取得
将含编码羊驼抗CTLA-4抗体的VHH的基因的质粒DNA用于模板而取得编码VHH及肽接头(GS1接头)的DNA片段。将得到的DNA片段与线状化的BIAPII表达载体DNA连接,制作VHH-接头-BIAPII表达载体。在此表达载体中,在编码VHH的基因的下游连接有编码肽接头的基因及BIAPII基因。向Expi293F(商标)细胞转染VHH-接头-BIAPII表达载体而得到抗体例3-1的ALP融合抗体。
(2)ALP活性的测定及抗体分子的一致性的探讨
与试验例2同样地,对ALP融合抗体的ALP活性进行测定。为了比较,还测定向Expi293F(商标)细胞转染实施例1的BIAPII表达载体而得到的BIAPII的ALP的活性。结果示于图12A。另外,与试验例3同样地,将抗体分子的一致性由凝胶过滤探讨。溶出曲线示于图12B。在凝胶过滤中,抗体例3-1的ALP融合抗CTLA4抗体溶出到12mL~12.5mL的级分。如图12A所示,得到的ALP融合抗体具有ALP活性。另外,如图12B所示,得到的ALP融合抗体是均一的分子的集合体。
[实施例5:牛小肠来源ALP融合抗体的制作(5)]
作为抗体部分与实施例1的ALP融合抗体不同的ALP融合抗体,制作兔抗PD-1抗体、兔抗PD-L1抗体或小鼠抗VEGF抗体的Fab和ALP亚基相结合的融合蛋白质。这相当于上述的抗体例1-1中所示的结构的ALP融合抗体。
(1)表达载体的制作
除了作为免疫原使用PD-1或PD-L1之外,与实施例1同样地,得到含编码兔抗PD-1抗体或兔抗PD-L1抗体的Fd的基因的Fd-接头-BIAPII表达载体、及含编码该抗体的轻链的基因的轻链表达载体。由于对于抗PD-1抗体的抗体基因,得到多个克隆,制作各克隆的ALP融合抗体。另外,除了作为免疫原使用VEGF之外,与实施例2同样地,得到含编码小鼠抗VEGF抗体的Fd的基因的Fd-接头-BIAPII表达载体、及含编码该抗体的轻链的基因的轻链表达载体。肽接头是GS1接头。
(2)抗体分子的一致性的探讨及ALP活性的测定
与试验例3同样地,将各ALP融合抗体的分子的一致性由凝胶过滤探讨。溶出曲线示于图13A~C。另外,使用ALP融合抗PD-1抗体或ALP融合抗PD-L1抗体,与试验例2同样地对ALP活性进行测定。结果示于图14A及B。参照图13A~C,在凝胶过滤中,ALP融合抗PD1抗体、ALP融合抗PD-L1抗体及ALP融合抗VEGF抗体均溶出到11.5mL~12mL的级分。如图13A~C所示,得到的ALP融合抗体是均一的分子的集合体。另外,如图14A及B所示,得到的ALP融合抗体具有ALP活性。
[实施例6:希瓦氏菌(Shewanella)属细菌来源ALP融合抗体的制作]
作为ALP部分与实施例1的ALP融合抗体不同的ALP融合抗体,制作兔抗体的Fab和来源于希瓦氏菌(Shewanel la)属细菌的ALP相结合的融合蛋白质。这相当于上述的抗体例1-1中所示的结构的ALP融合抗体。
(1)表达载体的制作及抗体的取得
作为兔抗体的表达载体,使用含实施例1的兔抗CD80抗体的基因的质粒DNA。作为T3-3AP表达载体,基于记载在美国专利第9,133,446号说明书的T3-3株来源ALP(T3-3AP)的氨基酸序列,向GenScript公司委托基因合成而取得含T3-3AP基因的质粒DNA。T3-3AP的氨基酸序列及编码其的碱基序列各自示于SEQ ID NO:3及4。除了代替BIAPII表达载体而使用T3-3AP表达载体之外,与实施例1同样地得到Fd-接头-T33AP表达载体。肽接头是GS1、EK1及EK3接头。向Expi293F(商标)细胞转染此表达载体和在实施例1中得到的轻链表达载体而得到ALP融合抗体。
(2)抗体分子的一致性的探讨及ALP活性的测定
与试验例3同样地将各ALP融合抗体的分子的一致性由凝胶过滤探讨。溶出曲线示于图15A~C。在凝胶过滤中,各ALP融合抗CD80抗体溶出到11.5mL~12mL的级分。另外,使用各ALP融合抗体,与试验例2同样而对ALP活性进行测定。为了比较,还测定实施例1的ALP融合抗体(Fab-GS1-BIAPII)的ALP活性。结果示于图16。如图15A~C所示,得到的ALP融合抗体是均一的分子的集合体。另外,如图16所示,与具有BIAPII的ALP融合抗体同样地,具有T3-3AP的ALP融合抗体也显示高的ALP活性。
(3)使用ALP融合抗体的免疫测定
(3.1)ELISA法
代替实施例1的ALP融合抗体而使用上述(1)中得到的ALP融合抗体作为检测抗体以外与试验例1同样地进行ELISA法。为了比较,还进行使用实施例1的ALP融合抗体的测定。结果示于图17。如图17所示,与具有BIAPII的ALP融合抗体同样地,具有T3-3AP的ALP融合抗体对应于抗原浓度而发光强度增大。从而,具有3-3AP的ALP融合抗体均具有抗原检测能。
(3.2)使用自动测定装置的免疫测定
除了代替实施例1的ALP融合抗体而使用含上述(1)中得到的ALP融合抗体的R3试剂以外,与试验例4同样地进行测定。为了比较,还进行使用含实施例1的ALP融合抗体的R3试剂的测定。结果示于图18A及B。如图18A所示,在使用含具有T3-3AP的ALP融合抗体的R3试剂的测定中,对应于抗原浓度而发光强度增大。另外,如图18B所示,使用该R3试剂的测定显示高的SN比。
[参考例:T3-3AP以外的希瓦氏菌(Shewanel la)属细菌来源ALP的探索]
除了T3-3AP之外,如以下一样探索对于ALP融合抗体有用的希瓦氏菌(Shewanella)属细菌来源ALP。由相同性检索程序BLAST(NCBI)检索与T3-3AP的氨基酸序列(除信号序列外)具有69%以上的相同性的希瓦氏菌(Shewanel la)属来源ALP。结果,作为T3-3AP以外的希瓦氏菌(Shewanel la)属细菌来源ALP,筛选表2中所示的21种ALP。
【表2】
对于上述的ALP的氨基酸序列,使用序列解析软GENETYX(注册商标)(株式会社GENETYX)进行聚类。基于聚类结果而选定表3中所示的6种ALP(S-AP1、S-AP2、S-AP3、S-AP4、S-AP5及S-AP6)。
【表3】
Code
No.
菌株
登录No.
S-AP1
1
腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)CN-32
WP_011788159.1
S-AP2
2
厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)
WP_037428906.1
S-AP3
4
冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)
WP_011636029.1
S-AP4
9
利文斯顿希瓦氏菌(Shewanella livingstonensis)
WP_124729648.1
S-AP5
12
冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)
WP_101032902.1
S-AP6
16
水泡希瓦氏菌(Shewanella vesiculosa)
WP_124017315.1
由信号肽预测程序SingalP-5.0(DTU Health Tech)预测这些ALP的信号序列。基于这些ALP的氨基酸序列,向GenScript公司委托基因合成而取得含各ALP基因的质粒DNA。在亚克隆时,代替预测的信号序列而插入荧光素酶的信号序列。向Expi293F(商标)细胞转染S-AP1、S-AP2、S-AP3、S-AP4、S-AP5及S-AP6的各表达载体而回收ALP,由凝胶过滤纯化。使用纯化的ALP,与试验例2同样地对ALP活性进行测定。为了比较,还测定T3-3AP的ALP活性。结果示于图19。如图19所示表明,S-AP1、S-AP2、S-AP3、S-AP4、S-AP5及S-AP6尽管活性比T3-AP还低,但是作为在ALP融合抗体中使用的ALP有希望的候选。
【符号的说明】
11、21:试剂盒
12、22:第1容器
13、24:捆包箱
14、25:附带文书
23:第2容器
序列表
<110> Sysmex Corporation
<120> 碱性磷酸酶融合抗体及其制造方法、以及免疫测定用试剂及免疫测定方法
<130> 19-053JP
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 480
<212> PRT
<213> 牛(Bos taurus)
<400> 1
Leu Ile Pro Ala Glu Glu Glu Asn Pro Ala Phe Trp Asn Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ala Leu Asp Val Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile Gln Thr Ala
20 25 30
Ala Lys Asn Val Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Pro Thr
35 40 45
Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Met Asn Gly Lys Leu Gly
50 55 60
Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Gln Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser
65 70 75 80
Lys Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Tyr Arg Thr Ile Gly Val
100 105 110
Ser Ala Ala Ala Arg Tyr Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu
115 120 125
Val Thr Ser Val Ile Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ala Val Gly
130 135 140
Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Ala Tyr
145 150 155 160
Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Leu Pro Ala
165 170 175
Asp Ala Gln Lys Asn Gly Cys Gln Asp Ile Ala Ala Gln Leu Val Tyr
180 185 190
Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Met Tyr Met Phe
195 200 205
Pro Glu Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Ala Ser Val Asn
210 215 220
Gly Val Arg Lys Asp Lys Gln Asn Leu Val Gln Glu Trp Gln Ala Lys
225 230 235 240
His Gln Gly Ala Gln Tyr Val Trp Asn Arg Thr Ala Leu Leu Gln Ala
245 250 255
Ala Asp Asp Ser Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Ala
260 265 270
Asp Met Lys Tyr Asn Val Gln Gln Asp His Thr Lys Asp Pro Thr Leu
275 280 285
Ala Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Gln Val Leu Ser Arg Asn Pro Arg
290 295 300
Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His
305 310 315 320
Asp Gly Lys Ala Tyr Met Ala Leu Thr Glu Ala Ile Met Phe Asp Asn
325 330 335
Ala Ile Ala Lys Ala Asn Glu Leu Thr Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile
340 345 350
Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Thr
355 360 365
Leu Arg Gly Thr Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Leu Asp
370 375 380
Ser Lys Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Ala
385 390 395 400
Leu Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Val Asn Gly Ser Thr Ser Glu Glu
405 410 415
Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ala Ser Glu Thr His
420 425 430
Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu
435 440 445
Val His Gly Val Gln Glu Glu Thr Phe Val Ala His Ile Met Ala Phe
450 455 460
Ala Gly Cys Val Glu Pro Tyr Thr Asp Cys Asn Leu Pro Ala Pro Ala
465 470 475 480
<210> 2
<211> 1440
<212> DNA
<213> 牛(Bos taurus)
<400> 2
ttaattccgg cagaagaaga aaacccggcg ttttggaacc gtcaggccgc acaggccctg 60
gatgtagcta aaaaacttca accgattcaa actgcagcca agaatgtgat cctgtttcta 120
ggggatggta tgggggtccc gacagtgaca gctactcgta ttttgaaggg tcagatgaat 180
gggaagttgg gcccggaaac ccctcttgca atggatcaat tcccttatgt ggctctttca 240
aagacatata atgttgatcg tcaagtacca gatagcgcag gtactgccac cgcgtactta 300
tgcggggtga aaggtaatta tcgtaccatt ggcgtatcgg cagctgctcg ctataaccag 360
tgtaatacca cccgtggaaa cgaagtgacc agcgtcatta accgcgcaaa gaaggcgggc 420
aaagcagtcg gcgtagtaac aacaactcgt gttcaacatg ctagcccggc tggcgcatac 480
gcacatacgg tcaatcgcaa ctggtattcg gatgccgacc ttccggctga tgctcaaaaa 540
aatggttgtc aagacatcgc ggcccaactt gtatacaata tggatatcga tgtcatcctt 600
ggcggcggcc gtatgtacat gtttcccgaa ggaaccccag atccggaata ccctgacgat 660
gcgtcggtga acggggtgcg taaagataaa cagaacttgg tccaagagtg gcaggccaaa 720
caccagggag ctcagtatgt ctggaatcga accgcgctgt tgcaggcagc agatgattcc 780
tcggttaccc acttaatggg acttttcgaa ccggccgata tgaaatacaa tgtccagcag 840
gaccacacaa aagaccctac cctggccgaa atgactgagg ccgcattaca agtcttaagc 900
cgtaacccca gagggttcta tctgttcgtt gagggcggcc gcatcgatca tgggcaccat 960
gatggcaaag cctatatggc ccttactgaa gccatcatgt tcgacaacgc gatagcgaag 1020
gcaaatgaat taacttctga actggatacc ctgatcttgg tgacagccga tcatagtcat 1080
gtattctcat ttgggggcta caccctgcgt ggtaccagta tctttggctt ggccccgggt 1140
aaggctctgg attccaagag ctatacctcc attctgtacg gtaacgggcc tgggtatgct 1200
cttgggggcg gttcgcgccc cgatgttaac ggttcaacgt ccgaagaacc ttcttatcgt 1260
cagcaggcag ccgtgcccct cgcgagcgag acgcatggag gtgaggacgt ggcggtgttt 1320
gctcgcggtc cgcaggcgca tcttgtacac ggagtgcaag aggagacgtt tgtagctcat 1380
ataatggcgt tcgcaggttg cgtggagcct tacacagatt gtaacttgcc tgcacctgcg 1440
<210> 3
<211> 443
<212> PRT
<213> 希瓦氏菌属(Shewanella sp.) T3-3
<400> 3
Met Ser Val Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Leu Val
1 5 10 15
Phe Ser Ala Ser Ser Lys Ala Ala Pro Glu Leu Glu Asn Gly Pro Met
20 25 30
Lys Pro Pro Ser Lys Pro Lys Asn Ile Val Ile Met Val Gly Asp Gly
35 40 45
Met Gly Pro Ser Tyr Thr Ser Ala Tyr Arg Tyr Phe Lys Asp Asn Pro
50 55 60
Asp Thr Glu Glu Val Glu Gln Thr Val Phe Asp Arg Leu Leu Val Gly
65 70 75 80
Met Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Ser Val Ser Gly Tyr Val Thr Asp Ser
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Val Lys Ser Tyr Asn Gly
100 105 110
Ala Ile Ser Val Asp Thr Gln Lys Gln His Leu Pro Thr Met Leu Glu
115 120 125
Lys Ala Lys Ala Leu Gly Leu Ser Thr Gly Val Ala Val Thr Ser Gln
130 135 140
Ile Asn His Ala Thr Pro Ala Ala Phe Leu Ala His Asn Glu Ser Arg
145 150 155 160
Lys Asn Tyr Asp Ala Leu Ala Leu Ser Tyr Leu Asp Thr Asn Ala Asp
165 170 175
Val Leu Leu Gly Gly Gly Gln Lys Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Glu
180 185 190
Lys Phe Thr Ala Lys Gly Tyr Gln His Ile Ser Arg Phe Glu Asp Leu
195 200 205
Ala Thr Ile Thr Gln Pro Lys Val Ile Gly Leu Phe Ala Gln Val Gln
210 215 220
Leu Pro Trp Ala Leu Asp Glu Lys Asn Ala Asn Arg Leu Ser Thr Met
225 230 235 240
Thr Gln Lys Ala Leu Asp Leu Leu Ser Gln Asn Glu Gln Gly Phe Val
245 250 255
Leu Leu Val Glu Gly Ser Leu Ile Asp Trp Ala Gly His Ser Asn Asp
260 265 270
Ile Ala Asn Thr Met Gly Glu Met Asp Glu Phe Ala Asn Ala Leu Glu
275 280 285
Val Val Glu Gln Phe Val Arg Gln His Pro Asp Thr Leu Met Val Ala
290 295 300
Thr Ala Asp His Asn Thr Gly Gly Leu Ser Ile Gly Ala Gly Gly Asp
305 310 315 320
Tyr Arg Trp Asn Pro Glu Ile Leu Arg Asn Met Ser Ala Ser Thr Asp
325 330 335
Thr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Gly Gly Asp Gln Trp Gln Ala Asp Leu
340 345 350
Ala Arg Gly Leu Gly Phe Glu Leu Asn Ala Asp Glu Val Thr Gln Leu
355 360 365
Ser Thr Ala Arg Met Gln Gly Leu Glu Thr Met Thr Glu Ala Ile Arg
370 375 380
Lys Ile Ile Asp Lys Arg Thr Gly Thr Gly Trp Thr Thr Ser Gly His
385 390 395 400
Thr Gly Thr Asp Val Gln Val Phe Ala Ala Gly Pro Ala Ala Glu Leu
405 410 415
Phe Asn Gly His Gln Asp Asn Thr Asp Ile Ala Asn Lys Ile Phe Thr
420 425 430
Leu Leu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Lys Thr Glu
435 440
<210> 4
<211> 1332
<212> DNA
<213> 希瓦氏菌属(Shewanella sp.) T3-3
<400> 4
atgagcgtca ccaaaacatc actcttattg ctgactatcg gattagtatt ttcagctagc 60
agcaaggccg cacccgagct tgaaaacggg cctatgaaac cgccatcaaa acctaaaaac 120
atcgttatta tggtgggtga cggcatgggc ccttcgtaca ccagcgccta ccgctatttc 180
aaagataatc ctgacaccga agaagtcgaa caaaccgtat tcgatagact cttagttggc 240
atggcaagta cgtatcctgc cagtgtcagc ggctatgtca cagattctgc tgcggcggca 300
actgcgctcg ccacaggcgt aaaatcttat aatggcgcta tttccgtcga tacccaaaag 360
caacacttac caaccatgct cgaaaaagcc aaagcattag ggttaagcac aggtgtggcg 420
gtaacatcac aaatcaacca tgccacgccc gcggcatttt tagcccacaa cgagagccgt 480
aaaaattacg atgctctggc gctcagttat ttagacacaa atgccgatgt acttttgggc 540
ggcggacaga agtatttctc gcctgaactg ctcgaaaaat tcaccgccaa aggttatcaa 600
cacattagcc gctttgaaga tttggccact ataacccaac ccaaagtcat tggcctgttt 660
gcacaggtgc aactgccttg ggcgctcgat gagaaaaatg caaatcgcct cagcactatg 720
actcaaaaag ccctcgattt actctcacaa aatgagcaag gctttgtatt gttagtcgaa 780
ggcagcttga ttgactgggc cggacacagc aatgatatcg ccaacaccat gggcgaaatg 840
gatgaatttg ccaatgcact cgaagtggtt gagcagtttg tacgccaaca tccagacacc 900
ttaatggtag ccactgccga tcataatacc ggtggactct caattggtgc tggcggagat 960
tatcgctgga acccagagat tttacgcaat atgtctgcca gcacggacac gcttgcctta 1020
gccgcactcg gtggtgacca atggcaagcc gatctggccc gaggtttagg atttgagcta 1080
aacgccgatg aagtgactca attgagcaca gcccgaatgc aaggtcttga aaccatgact 1140
gaagccattc gtaaaatcat cgacaagcgc accggcactg gctggacaac ctcaggccac 1200
actggcacag acgtacaagt atttgccgca ggccctgctg ccgagttatt taatggccac 1260
caagataata ccgacatagc caacaaaatt ttcactttat tgcctaaacc gaaaaaagcc 1320
aaaaccgaat aa 1332
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 8
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 9
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 10
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 11
<211> 220
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 11
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Ala
20 25 30
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Asn Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln
180 185 190
Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr
210 215 220
<210> 12
<211> 213
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 12
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Ser Arg Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp
115 120 125
Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr
130 135 140
Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr
145 150 155 160
Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr
165 170 175
Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser
180 185 190
His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val
195 200 205
Gln Ser Phe Ile Gly
210
<210> 13
<211> 660
<212> DNA
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 13
cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cctcagtaat aatgcagtga gctgggtccg ccaggctcca 120
ggggaggggc tggaatggat cggaaccatt agtagtaatg ataacacata ttatgcgacc 180
tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcacc 240
agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca tctattatta tggttatggt 300
tatgttttta acttgtgggg cccaggcact ctggtcaccg tctcctcagg gcaacctaag 360
gctccatcag tcttcccact ggccccctgc tgcggggaca cacccagctc cacggtgacc 420
ctgggctgcc tggtcaaagg ctacctcccg gagccagtga ccgtgacctg gaactcgggc 480
accctcacca atggggtacg caccttcccg tccgtccggc agtcctcagg cctctactcg 540
ctgagcagcg tggtgagcgt gacctcaagc agccagcccg tcacctgcaa cgtggcccac 600
ccagccacca acaccaaagt ggacaagacc gttgcgccct cgacatgcag caagcccacg 660
<210> 14
<211> 650
<212> DNA
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 14
gctatcgcag cgagctcgtg atgacccaga ctccagcctc cgtgtctgag cctgtgggag 60
gcacagtcac catcaattgc caggccagtg aggatattta cagctcttta gcctggtatc 120
agcagaaacc agggcagcgt cccaagctcc ttatgtatta tgcatccact ctggcatctg 180
gggtcccatc gcggttcaaa ggcagtggat ctgggacaga gttcactctc accatcagcg 240
acctggagtg tgccgatgct gccacttact actgtcaaag ctattatctt agtagtagta 300
gtaggtatgg taatgcgttc ggcggaggga ccgaggtggt ggtcaaaggt gatccagttg 360
cacctactgt cctcatcttc ccaccagctg ctgatcaggt ggcaactgga acagtcacca 420
tcgtgtgtgt ggcgaataaa tactttcccg atgtcaccgt cacctgggag gtggatggca 480
ccacccaaac aactggcatc gagaacagta aaacaccgca gaattctgca gattgtacct 540
acaacctcag cagcactctg acactgacca gcacacagta caacagccac aaagagtaca 600
cctgcaaggt gacccagggc acgacctcag tcgtccagag cttcataggg 650
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
tgataaaagg gttcgatccc tacc 24
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
gcagtgcacg gtggcgcagt acacc 25
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gccaccgtgc actgcttaat tccggcagaa gaagaaaacc 40
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
cgaacccttt tatcacgcag gtgcaggcaa gttacaatc 39
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
ggtggcggtg gatccttaat tccggcagaa gaagaaaacc 40
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gtggatccgg agggggcgga agtttaattc cggcagaaga agaaaacc 48
<210> 21
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
ggagggggcg gaagtggcgg gggaggttca ttaattccgg cagaagaaga aaacc 55
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gaagccgctg ctaagttaat tccggcagaa gaagaaaacc 40
<210> 23
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ctgctaagga ggcagccgcg aaattaattc cggcagaaga agaaaacc 48
<210> 24
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gaggcagccg cgaaagaagc agcggctaaa ttaattccgg cagaagaaga aaacc 55
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
gcagtgcacg gtggcgcagt acacc 25
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gccaccgtgc actgccagtc ggtggaggag tccgg 35
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
ggatccaccg ccacccgtgg gcttgctgca tgtcgaggg 39
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
ccccctccgg atccaccgcc acccgtgggc ttgctgcatg tcgaggg 47
<210> 29
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
acttccgccc cctccggatc caccgccacc cgtgggcttg ctgcatgtcg aggg 54
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
cttagcagcg gcttccgtgg gcttgctgca tgtcgaggg 39
<210> 31
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
gctgcctcct tagcagcggc ttccgtgggc ttgctgcatg tcgaggg 47
<210> 32
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
tttcgcggct gcctccttag cagcggcttc cgtgggcttg ctgcatgtcg aggg 54
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
taatctagat aattaaaggg ttcg 24
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
gctgcgatag cccggaaaca gtacc 25
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ccgggctatc gcagcgagct cgtgatgacc cagac 35
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
taattatcta gattatcaac agtcacccct attgaagc 38