具体实施方式

一直需要在不负面影响靶RNA中靶腺苷的编辑效率的情况下，改善编辑RNA的反义寡核苷酸(AON，有时称为“编辑寡核苷酸”或“EON”)的药代动力学特性。许多化学修饰存在于AON的产生中，其特性并不总是与实现有效RNA编辑的愿望相一致。在寻求更好的药代动力学特性的过程中，早先发现，对一些(但不是全部)核苷酸的核糖进行2'-O-甲氧基乙基(或2'-甲氧基乙氧基，或2'-MOE)修饰，似乎令人惊讶地与有效的ADAR参与和编辑相容(WO2019/158475)。以类似的方式，早先发现在一些(但不是全部)核苷酸间键处的硫代磷酸酯(PS)键令人惊讶地与有效的ADAR参与和编辑相容(WO2019/219581)。此外，早先发现，AON中一些(但不是全部)位置的膦酰基乙酸酯键修饰和/或解锁核酸(UNA)核糖修饰似乎与具有核苷酸脱氨基活性的酶的有效参与以及随后的脱氨基相容(PCT/EP2020/053283，未公开)。虽然膦酰基乙酸酯和UNA修饰的特性已为人所知，但是其与具有核苷酸脱氨基活性的酶的参与以及与脱氨基反应的相容性是未知的。

本发明的发明人现已发现，引入一种特殊类型的核苷酸间键修饰，其中AON中的孤儿核苷通过这种特殊修饰的键与其3'相邻核苷连接，以显著的方式增加了整个AON的稳定性，而AON似乎仍然能够使用具有脱氨基活性的酶，并且重要的是，似乎能够引起靶RNA分子中靶核苷酸的脱氨基。原则上，这些发现可与使用合成寡核苷酸的任何形式的碱基编辑一起使用，所述合成寡核苷酸涉及例如ADAR或ADAR脱氨酶结构域，无论它们是天然的还是重组的、截短的或全长的，是否与其他蛋白质融合(例如，Stafforst and Schneider,2012,《Angew Chem Int》51:11166-11169；Schneider等人，2014,《核酸研究(Nucleic AcidsRes)》42:e87；Montiel Gonzalez等人，2016,《核酸研究》44:e157)。本领域技术人员了解具有核苷酸脱氨酶活性的各种酶，例如ADAR1、ADAR2、APOBEC或含有这些酶的活性结构域的融合蛋白，其融合于其他蛋白用于靶向RNA结合等。本发明具体涉及包含甲基膦酸酯(MP)核间键修饰的AON。核苷酸间键编号使得键编号0位于孤儿核苷酸5'的键，并且其中寡核苷酸中的键位置朝着5'端正(+)递增且朝着3'端负递增。就核苷酸编号而言，孤儿核苷酸在位置0，核苷酸编号朝着5'端正(+)递增且朝着3'端负递增。在本发明的具体实施方案中，AON在键位置0、-1、-2、-3、-4、-5和/或-6处包含一个或多个MP键。在这些位置处，MP键在稳定AON而不阻止编辑活动方面特别有效。在一个实施方案中，AON在键位置0、-1、-2、-3、-4、-5和/或-6处包含7、6、5、4、3、2或1个MP键。在优选实施方案中，AON在键位置0、-1、-2、-3、-4和/或-5、键位置0、-1、-2、-3和/或-4、键位置0、-1、-2和/或-3、键位置0、-1和/或-2处包含MP键。在特别优选的实施方案中，AON在位置0和/或-2处包含MP键。在一个实施方案中，AON包含孤儿核苷(与靶腺苷相对)和AON中3'侧(即-1键位置)的下一个核苷之间的MP键。在一个实施方案中，AON在所有键位置处包含MP键。在另一实施方案中，AON包含单个MP键。在具体实施方案中，AON选自：仅在位置0处包含MP键的AON，仅在键位置-1处包含MP键的AON，仅在键位置-2处包含MP键的AON，仅在键位置-3处包含MP键的AON，仅在键位置-4处包含MP键的AON，仅在键位置-5处包含MP键的AON，仅在键位置-6处包含MP键的AON，以及仅在键位置-2和-4处包含MP键的AON。

这现在解决了实现AON更高稳定性的问题，同时维持其使用具有核苷酸脱氨活性的酶并获得靶RNA分子中靶腺苷的RNA编辑的能力。

使用MP来稳定AON并不是一个新概念(参见Agrawal等人1997.《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci)》USA 94:2620-2625)，但鉴于之前发现的是与靶RNA分子中的与靶核苷酸相对的RNA编辑AON中的核苷酸内部和周围的修饰，非常令人惊讶地发现，在连接孤儿核苷与相邻核苷(最好是其3'相邻核苷)的键处具有MP修饰仍然允许RNA编辑，如本文所示。应理解，本发明涵盖能够结合到靶RNA分子、募集具有核苷酸(包括腺苷)脱氨活性的任何蛋白质(天然表达的蛋白质以及外源蛋白质，包括不同或相同来源的融合蛋白)的任何AON，只要至少一个核苷酸间键包含MP键，优选其中MP存在于连接靶RNA分子中与靶核苷酸相对的AON核苷与其3'相邻核苷的核苷酸间键中，并且其中3'相邻核苷可进一步通过另一MP键连接至其各自的3'相邻核苷。因此，本发明涉及包含通过核苷酸间键连接的核苷酸的AON，其中AON--当通过结合互补靶核酸序列形成双链核酸结构时--能够在互补靶核酸序列中的靶核苷酸上募集具有核苷酸脱氨酶活性的酶，其特征在于AON已经通过引入至少一个MP修饰的核苷酸间键针对稳定性进行了优化。MP键(此处为DNA核苷之间)的化学结构如图1所示。这种修饰的一个重要作用是保护聚合物免受核酸酶介导的降解。在本发明的一个方面，当未经MP修饰时，至少一个核苷酸间键可为未经修饰的磷酸二酯键。除了核糖2'基团的修饰外，MP修饰也可存在。AON中的核糖2'基团可独立地选自2'-H(即DNA)、2'-OH(即RNA)、2'-OMe、2'-MOE、2'-F或2'-4'-连接(即锁核酸或LNA)，或如下文进一步概述的其他2'取代基。2'-4'键可从本领域已知的连接体中选择，诸如亚甲基连接体或受限乙基连接体。在所有情况下，修饰应与编辑相容，使得寡核苷酸发挥其作为RNA编辑AON的作用。通过在与具有核苷酸脱氨酶活性的酶的编辑活性不相容的位置生成至少一个解锁核酸(UNA)核糖修饰，可进一步优化AON与具有核苷酸脱氨活性的酶的结合。在UNA修饰中，核糖2'和3'碳原子之间没有碳-碳键。因此，UNA核糖修饰增加了寡核苷酸的局部灵活性。UNA可通过提高抗降解性，产生诸如改善药代动力学特性等效果。UNA还可降低毒性，并且可参与减少脱靶效应。孤儿核苷酸处应优选避免UNA核糖修饰，因为与具有核苷酸脱氨酶活性的酶结合的破坏将是显著的(GB 1901873.8，未公开)。UNA核糖修饰可能是AON中唯一的核糖修饰，但除了对核糖2'基团的修饰之外，UNA修饰可存在于与UNA修饰不同的位置或与UNA修饰相同的位置处。AON中的核糖2'基团可独立地选自2'-H(即DNA)、2'-OH(即RNA)、2'-OMe、2'-MOE、2'-F或2'-4'-连接(即锁核酸或LNA)，或下文进一步概述的其他2'取代基。2'-4'键可从本领域已知的连接体中选择，诸如亚甲基连接体或受限乙基连接体。WO2016/097212、WO2017/220751、WO2018/041973、WO2018/134301、GB1808146.3(未公开)、GB1901873.8(未公开)和PCT/EP2019/053291(未公开)对不同的2'修饰进行了详细论述。在所有情况下，修饰应与编辑相容，使得寡核苷酸发挥其作为RNA编辑AON的作用。在本发明的所有方面，具有核苷酸脱氨酶活性的酶优选为ADAR1或ADAR2。在高度优选的实施方案中，AON是靶向前mRNA或mRNA的RNA编辑单链AON，其中靶核苷酸优选为靶RNA中的腺苷，其中腺苷脱氨基为肌苷，其被翻译机器解读为鸟苷。在另一优选实施方案中，腺苷位于UGA或UAG终止密码子中，其被编辑为UGG密码子；或者其中两个靶核苷酸是UAA终止密码子中的两个腺苷，该密码子通过两个靶腺苷的脱氨基编辑为UGG密码子，其中寡核苷酸中的两个核苷酸与靶核酸错配。

根据本发明的AON可包含除MP连接体修饰之外或除MP键修饰之外的核苷酸间键修饰。在一个实施方案中，一个此类其他核苷酸间键可为经膦酰基乙酸酯修饰的键。在另一实施方案中，核苷酸间键可为磷酸二酯，其中磷酸二酯的OH基团已被烷基、烷氧基、芳基、烷基硫基、酰基、-NR1R1、烯基氧基、炔氧基、烯基硫基、炔基硫基、-S-Z+、-Se-Z+或-BH3-Z+替代，并且其中R1独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳基，并且其中Z+为铵离子、烷基铵离子、杂芳族亚胺离子或杂环亚胺离子，其中任何一种为伯、仲、叔或季的，或者Z为单价金属离子，并且优选为硫代磷酸酯(PS)键。

在本发明的AON中，孤儿核苷酸通常包含具有2'-OH基团的核糖、具有2'-H基团的脱氧核糖，并且优选不包含携带2'-OMe修饰的核糖。此外，本发明的AON通常不包含相对于孤儿核苷酸的某些位置处的2'-MOE修饰，并且还包含AON内其他位置处的2'-MOE修饰。本发明的AON优选不包含如WO 2016/097212中所描述的募集部分。本发明的AON优选不包含能够形成分子内茎环结构的部分。AON优选不包含5'-端O6-苄基鸟嘌呤修饰。AON优选不包含5'-端氨基修饰。AON优选不与SNAP-标签结构域共价连接。

本发明涉及用于细胞中存在于靶RNA分子中的至少一个靶腺苷脱氨基的方法，该方法包括以下步骤：向细胞提供根据本发明第一方面的AON或根据本发明第二方面的组合物，允许细胞摄取AON，允许AON退火到靶RNA分子，允许具有核苷酸脱氨酶活性的哺乳动物酶对靶RNA分子中的靶核苷酸脱氨基；以及任选地鉴定靶RNA分子中脱氨基核苷酸的存在。优选地，靶RNA分子的存在通过以下方式检测：(i)对靶序列进行测序，(ii)当靶腺苷位于UGA或UAG终止密码子中，该终止密码子通过脱氨基编辑为UGG密码子时，评估功能性、伸长性、全长和/或野生型蛋白质的存在，(iii)当两个靶腺苷位于UAA终止密码子中，该终止密码子通过两个靶腺苷的脱氨基编辑为UGG密码子时，评估功能性、伸长性、全长和/或野生型蛋白质的存在，(iv)评估前mRNA的剪接是否因脱氨基而改变；或(v)使用功能性读出，其中脱氨基后的靶RNA编码功能性、全长、伸长性和/或野生型蛋白质。因此，本发明还涉及靶向存在于(前)mRNA中的提前终止终止密码子(PTC)的AON，以将存在于终止密码子中的腺苷改变为肌苷(读作G)，进而导致翻译期间的通读和全长功能蛋白。在一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗囊性纤维化(CF)的AON，并且在更进一步的优选实施方案中，本发明涉及用于治疗CF的AON，其中PTC诸如G542X(UGAG)、W1282X(UGAA)、R553X(UGAG)、R1162X(UGAG)、Y122X(UAA，两者均为腺苷)，W1089X、W846X和W401X突变通过RNA编辑修饰为氨基酸编码密码子，从而允许翻译成全长蛋白质。如本文所概述的，本发明的教导适用于所有可被AON靶向且可通过RNA编辑治疗的遗传疾病。另一个特别优选的示例是USH2A基因突变引起的Usher综合征II型。

在一个方面，本发明涉及能够在细胞中与靶RNA分子形成双链复合物的AON，用于存在于靶RNA分子中的疾病相关剪接突变中的靶腺苷的脱氨基，其中AON中的孤儿核苷酸(与靶腺苷相对)不携带2'-OMe修饰；其中直接位于孤儿核苷酸5'和/或3'的核苷酸(与孤儿核苷酸一起形成中心三联体)携带糖修饰和/或碱基修饰，以使AON在RNA编辑中更稳定和/或更有效；并且其中AON中的至少一个键，优选在中心三联体中，携带MP修饰。在优选实施方案中，连接中心三联体中的两个核苷的至少一个核苷酸间键携带MP修饰。在另一优选方面，孤儿核苷酸是DNA，并且在更优选方面，孤儿核苷酸以及与靶腺苷相对的核苷酸5'和/或3'的核苷酸是DNA核苷酸，而AON中的核苷酸的剩余部分(不是DNA)优选为2'-O-烷基修饰的核糖核苷酸。当两个核苷酸是DNA时，所有其他核苷酸均可为RNA，并且可为2'-OMe或2'-MOE修饰的，而在特定方面，与靶腺苷相对的中心三联体中的第三个核苷酸可为RNA和未修饰的，只要与靶腺苷相对的核苷酸不是2'-OMe修饰的。在优选实施方案中，根据本发明的AON包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个与互补靶RNA区域的错配、摆动和/或凸起。优选地，与靶腺苷相对的核苷酸是胞苷、脱氧胞苷、尿苷、脱氧尿苷或者是脱碱基的。当与靶腺苷相对的核苷酸是胞苷或脱氧胞苷时，AON包含与靶RNA分子的至少一个错配。当与靶腺苷相对的核苷酸是尿苷或脱氧尿苷时，AON可为100％互补的，并且相对于靶RNA没有任何错配、摆动或凸起。然而，在优选方面，无论与靶腺苷相对的核苷酸是胞苷、脱氧胞苷、尿苷还是脱氧尿苷，在AON和靶RNA之间均存在一个或多个附加的错配、摆动和/或凸起。在另一优选实施方案中，直接位于孤儿核苷酸5'和/或3'的核苷酸(与形成中心三联体的孤儿核苷酸一起)包含具有2'-OH基团的核糖，或具有2'-H基团的脱氧核糖，或这两者的混合物。然后，中心三联体由以下各项组成：DNA-DNA-DNA；DNA-DNA-RNA；DNA-RNA-DNA；DNA-RNA-RNA；RNA-DNA-DNA；RNA-DNA-RNA；RNA-RNA-DNA；或RNA-RNA-RNA；其中中间核苷酸不具有2'-OMe修饰(当是RNA时)，并且其中一个或两个周围核苷酸也不具有2'-OMe修饰。然后优选的是，AON中的所有其他核苷酸均具有2'-O-烷基，优选2'-OMe基团或2'-MOE基团，或如本文所公开的任何修饰。本发明的AON包含至少一个MP键修饰。本发明的AON与靶序列的摆动、错配和/或凸起不会阻止寡核苷酸与靶RNA序列的杂交，而是通过细胞中的ADAR在靶腺苷位置增加RNA编辑效率。本领域技术人员能够确定在生理条件下杂交是否仍然发生。本发明的AON可募集(使用)细胞中存在的哺乳动物ADAR酶，其中ADAR酶包含其在野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域。根据本发明的AON可利用内源性细胞途径和天然可用的ADAR酶或具有ADAR活性的酶(其可能是尚未鉴定的ADAR样酶)来特异性编辑靶RNA序列中的靶腺苷。如本文所公开，本发明的单链AON能够对靶RNA分子中的特定靶，诸如腺苷脱氨基。理想情况下，只有一个核苷酸脱氨基。另选地，1、2或3个另外的核苷酸脱氨基，但优选仅一个。本发明的AON可设计用于多种核苷酸脱氨酶并与之一起使用。ADAR就是一个具体的示例。以ADAR为例，ADAR可自然表达或人工产生(例如通过重组表达或蛋白质合成)。ADAR可为野生型或修饰型。结合本发明的AON的特征，不需要修饰重组ADAR表达。本发明的AON对于连接到AON的共轭实体没有特别限制。然而，没有必要将共轭实体连接到AON。因此，缺乏连接到AON的共轭实体的AON形成优选实施方案。本发明的AON对于与靶RNA序列不互补的募集部分没有特别限制。然而，不需要存在与靶RNA序列不互补的长募集部分。因此，缺乏与靶RNA序列不互补的长募集部分的AON形成优选实施方案。除此之外，本发明的AON确实允许存在于靶核酸分子中的靶核苷酸被天然核苷酸脱氨酶特异性脱氨基，该天然核苷酸脱氨酶包含在野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域，而没有在RNA/AON复合物的其他地方混杂编辑的风险。

本发明涉及能够在细胞中与靶核酸分子形成双链复合物的反义寡核苷酸(AON)，用于靶核酸分子中靶核苷酸，优选腺苷的脱氨基，其中AON中与靶核苷酸直接相对的核苷酸是孤儿核苷酸，并且其中AON包含一个或多个甲基膦酸酯(MP)键。本发明的AON能够使用优选内源性存在于细胞(优选哺乳动物细胞，更优选人细胞)中的具有脱氨基活性的实体(优选酶)，以提供靶核酸分子中的靶核苷酸的脱氨基。优选的靶核酸分子是RNA分子。双链AON/靶核酸分子复合物通过Watson-Crick碱基配对相互作用。优选地，孤儿核苷酸不携带2'-OMe或2'-MOE核糖修饰。优选地，孤儿核苷和/或孤儿核苷3'的核苷通过MP键(即在-1和-2位置处)连接到其各自的3'相邻核苷。更优选地，孤儿核苷及其3'相邻核苷均通过MP修饰键与其各自的3'相邻核苷连接，如AON ADAR102-13所示(图2)。在本发明的一个具体实施方案中，AON在键位置0、-1、-2、-3、-4、-5和/或-6处包含一个或多个MP键，如IDUA163、IDUA170、IDUA176、IDUA182、IDUA247、IDUA250和IDUA254所示(图6和图7)。在一个实施方案中，AON在键位置0、-1、-2、-3、-4、-5和/或-6处包含7、6、5、4、3、2或1个MP键。在优选实施方案中，AON在键位置0、-1、-2、-3、-4和/或-5、键位置0、-1、-2、-3和/或-4、键位置0、-1、-2和/或-3、键位置0、-1和/或-2处包含MP键。在特别优选的实施方案中，AON在位置0和/或-2处包含MP键，如IDUA163和IDUA176所示(图6)。在一个实施方案中，AON在所有键位置处包含MP键。在另一实施方案中，AON包含单个MP键。在特定实施方案中，AON选自：仅在位置0处包含MP键的AON(如IDUA163所示)、仅在键位置-1处包含MP键的AON(如IDUA170所示)、仅在键位置-2处包含MP键的AON(如IDUA176和IDUA264所示)，仅在键位置-3处包含MP键的AON(如IDUA182所示)、仅在键位置-4处包含MP键的AON(如IDUA247所示)、仅在键位置-5处包含MP键的AON(如IDUA250所示)、仅在键位置-6处包含MP键的AON(如IDUA253所示)，以及仅在键位置-2和-4处包含MP键的AON(如IDUA267和IDUA268所示)。在优选实施方案中，MP键将DNA核苷与另一核苷连接。在另一优选实施方案中，MP键将DNA核苷与DNA核苷连接。在本发明的一个重要方面，当在体外稳定性测定中比较时，MP键使AON比缺乏MP键的AON更稳定。基于当前教导，本领域技术人员将能够通过使用本发明发明人公开的定时体外稳定性测定(在混合在核酸酶缓冲液和无核酸酶水中应用包含来自Crotalus adamenteus毒液的磷酸二酯酶I、DNase I、RNase A和核酸酶BAL-31的核酸酶混合物)来确定MP修饰(如本文所示)是否使AON比在AON中的特定选定位置缺乏MP修饰的AON更稳定，该试验用作如何在实验室中测试稳定性的非限制性示例。本发明的另一个重要方面是，包含至少一个MP修饰键的AON能够使AON比在该位置缺乏MP修饰的AON更稳定，能够使用具有脱氨活性的实体，诸如脱氨酶，优选ADAR酶，以实现存在于靶核酸分子中的靶核苷酸的RNA编辑。因此，在优选实施方案中，与缺乏一个或多个MP键的AON相比，AON提供靶核苷酸脱氨基的能力保持在至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的水平。与稳定性分析一样，技术人员能够基于当前的教导，确定实现RNA编辑的能力水平，并且将其与在指定位置缺乏MP键的AON进行比较。在优选方面，AON还包含至少一个硫代磷酸酯(PS)或膦酰基乙酸酯核苷酸间键，和/或至少一个包含解锁核酸(UNA)核糖修饰的核苷酸。在一个更优选的方面，PS键存在于AON的两个末端，在每一端连接最终的五个核苷。在另一优选方面，本发明的AON还包含一个或多个核苷酸，其包含核糖2'位置处的取代基，其中该取代基选自由以下：-OH；-F；取代或未取代的、直链或支链的低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，它们可被一个或多个杂原子中断；-O-、S-、或N-烷基；-O-、S-、或N-烯基；-O-、S-、或N-炔基；-O-、S-、或N-烯丙基；-O-烷基-O-烷基；-甲氧基；-氨基丙氧基；-甲氧基乙氧基(2'-OMe)；-二甲氨基氧乙氧基；以及-二甲氨基乙氧基乙氧基。在更优选的实施方案中，本发明的AON包含至少一种包含2'-OMe或2'-MOE核糖修饰的核苷酸，并且其中孤儿核苷酸不携带2'-OMe或2'-MOE核糖修饰。最优选地，本发明的AON能够在细胞中使用实体，优选具有脱氨酶活性的酶，优选具有腺苷脱氨酶活性的酶，诸如ADAR1或ADAR2，更优选ADAR2。优选地，细胞中具有脱氨酶活性的酶是天然存在(且内源性存在)的人脱氨酶。根据本发明的AON优选长度至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸。此外，优选地，AON短于100个核苷酸，更优选短于60个核苷酸。

在另一实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的AON和药学上可接受的载体的药物组合物。本领域技术人员已知药学上可接受的载体。

在又一实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防遗传疾病的根据本发明的AON或根据本发明的药物组合物，所述疾病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、CADASIL、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、远端脊肌萎缩症(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良症、(营养不良)大疱性表皮松解症、法布里病、因子V莱顿相关联疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高雪氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色素沉着症、亨特综合征、亨廷顿氏病、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集综合征、莱伯氏先天性黑蒙(诸如LCA10)、Lesch-Nyhan综合征、林奇综合征、马凡综合征、黏多糖贮积症、肌营养不良、肌强直性营养不良I型和II型、神经纤维瘤病、Niemann-Pick病A、B和C型、NY-eso1相关癌症、Peutz-Jeghers综合征、苯丙酮尿症、庞培氏病、原发性睫状体病、凝血酶原突变相关疾病，诸如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、(常染色体显性)视网膜色素变性、桑德霍夫病、严重联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞贫血、脊髓性肌萎缩症、Stargardt病、Tay-Sachs病、Usher综合征(诸如Usher综合征I型、II型和III型)、X-连锁免疫缺陷、Sturge-Weber综合征和癌症。

在另一实施方案中，本发明涉及根据本发明的AON在制备用于治疗遗传疾病的药物中的用途，所述疾病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、CADASIL、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、远端脊肌萎缩症(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良症、(营养不良)大疱性表皮松解症、法布里病、因子V莱顿相关联疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高雪氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色素沉着症、亨特综合征、亨廷顿氏病、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集综合征、莱伯氏先天性黑蒙(诸如LCA10)、Lesch-Nyhan综合征、林奇综合征、马凡综合征、黏多糖贮积症、肌营养不良、肌强直性营养不良I型和II型、神经纤维瘤病、Niemann-Pick病A、B和C型、NY-eso1相关癌症、Peutz-Jeghers综合征、苯丙酮尿症、庞培氏病、原发性睫状体病、凝血酶原突变相关疾病，诸如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、(常染色体显性)视网膜色素变性、桑德霍夫病、严重联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞贫血、脊髓性肌萎缩症、Stargardt病、Tay-Sachs病、Usher综合征(诸如Usher综合征I型、II型和III型)、X-连锁免疫缺陷、Sturge-Weber综合征和癌症。

在又一实施方案中，本发明涉及用于对细胞中存在于靶核酸分子，优选RNA靶分子中的至少一种靶核苷酸，优选腺苷脱氨基的方法，该方法包括以下步骤：向细胞提供根据本发明的AON或根据本发明的药物组合物；允许AON退火到靶核酸分子；允许具有核苷酸脱氨酶活性的哺乳动物酶对靶核酸分子中的靶核苷酸脱氨基；以及任选地鉴别靶核酸分子中脱氨基核苷酸的存在。通过使用根据本发明的AON使用的具有核苷酸脱氨酶活性的哺乳动物酶优选为腺苷脱氨酶，并且能够改变靶核酸分子中的靶核苷酸，该靶核苷酸随后优选是脱氨基为肌苷的腺苷。鉴定脱氨基核苷酸的存在的任选步骤优选通过以下方式进行：对靶核酸分子的区域进行测序，其中该区域包含脱氨基靶核苷酸；当靶核苷酸是位于UGA或UAG终止密码子中的腺苷，该终止密码子通过脱氨基编辑为UGG密码子时，评估功能性、伸长性、全长和/或野生型蛋白质的存在；当两个靶腺苷位于UAA终止密码子中，该终止密码子通过两个靶腺苷的脱氨基编辑为UGG密码子时，评估功能性、伸长性、全长和/或野生型蛋白质的存在；当靶RNA分子为前体mRNA时，评估前体mRNA的剪接是否因脱氨基而改变；或使用功能性读出，其中脱氨基后的靶核酸分子编码功能性全长、伸长性和/或野生型蛋白质。

在又一实施方案中，本发明涉及用于对存在于靶核酸分子，优选靶RNA分子中的至少一种靶核苷酸，优选腺苷脱氨基的方法，该方法包括以下步骤：提供根据本发明的AON；允许AON退火至靶核酸分子，形成双链核酸复合物；允许具有核苷酸脱氨酶活性的哺乳动物酶对靶核酸分子中的靶核苷酸脱氨基；以及鉴定靶核酸分子中脱氨基核苷酸的存在。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗受试者，优选有此需要的人受试者的方法，其中受试者患有由涉及腺苷出现的突变(例如在PTC中)引起的遗传疾病，并且在该方法中，将腺苷脱氨基为肌苷将缓解、预防或改善疾病，该方法包括以下步骤：向受试者施用根据本发明的AON或药物组合物，允许在受试者的细胞中形成AON双链核酸复合物及其特异性互补靶核酸；允许具有脱氨活性的内源性存在酶，诸如hADAR1或hADAR2的参与；以及允许酶将靶核酸靶分子中的靶腺苷脱氨基为肌苷，从而减轻、预防或改善遗传疾病。可根据该方法治疗的遗传病优选但不限于本文所列的遗传病(见上文)。

定义

本文所用的术语‘腺嘌呤’、‘鸟嘌呤’、‘胞嘧啶’、‘胸腺嘧啶’、‘尿嘧啶’和‘次黄嘌呤’(肌苷中的核碱基)是指核碱基本身。术语‘腺苷’、‘鸟苷’、‘胞苷’、‘胸苷’、‘尿苷’和‘肌苷’是指与(脱氧)核糖糖相连的核碱基。术语“核苷”是指与(脱氧)核糖基糖相连的核碱基，不含磷酸基团。“核苷酸”由一个核苷和一个或多个磷酸基团组成。因此，术语“核苷酸”是指相应的核碱基-(脱氧)核糖基-磷酸连接体，以及核糖部分或磷酸基团的任何化学修饰。因此，该术语将包括一个包括锁核糖部分(包含2'-4'桥，包含亚甲基或任何其他基团)的核苷酸、解锁核酸(UNA)、包括连接体的核苷酸，该连接体包含磷酸二酯、磷酰基乙酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯(PS)、硫代磷酸(二)酯、甲基膦酸酯(MP)、磷酰胺连接体等。有时，术语腺苷和腺嘌呤、鸟苷和鸟嘌呤、胞苷和胞嘧啶、尿嘧啶和尿苷、胸腺嘧啶和胸苷/尿苷、肌苷和次黄嘌呤互换使用，一方面指相应的核碱基，另一方面指核苷或核苷酸。有时术语核碱基、核苷和核苷酸可互换使用，除非上下文明确要求不同，例如当一个核苷与相邻核苷连接，并且这些核苷之间的键被修饰时。在这种情况下，可认为核苷具有修饰的连接体，或者核苷酸是修饰的核苷酸。如上所述，核苷酸是核苷+一个或多个磷酸基团。术语“核糖核苷”和“脱氧核糖核苷”，或“核糖”和“脱氧核糖”如本领域所用。每当提及“反义寡核苷酸”、“寡核苷酸”或“AON”时，除非上下文另有规定，否则均指寡核苷酸和脱氧寡核苷酸。每当提及“寡核苷酸”时，其可包含碱基A、G、C、U或I。每当提及“脱氧寡核苷酸”时，其可包含碱基A、G、C、T或I。

在优选方面，本发明的AON是寡核苷酸，其可包含化学修饰，并且可在特定位置处包括脱氧核苷酸(DNA)。术语诸如寡核苷酸、寡核苷酸(oligo)、ON、寡核苷酸组合物、反义寡核苷酸、AON、(RNA)编辑寡核苷酸、EON和RNA(反义)寡核苷酸可在本文中互换使用。每当提及寡核苷酸结构中的核苷酸时，包括诸如胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶和β-D-葡萄糖基-5-羟基甲基胞嘧啶；当提及腺嘌呤时，包括N6-甲基腺嘌呤和7-甲基腺嘌呤；当提及尿嘧啶时，包括二氢尿嘧啶、4-硫尿嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶；当提及鸟嘌呤时，包括1-甲基鸟嘌呤。每当提及核苷或核苷酸时，均包括呋喃核糖衍生物，诸如2'-脱氧、2'-羟基和2'-O-取代变体，诸如2'-O-甲基，以及其他修饰，包括2'-4'桥联变体。每当提及寡核苷酸时，两个单核苷酸之间的键可为磷酸二酯键及其修饰，包括磷酰基乙酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、PS、硫代磷酸(二)酯、MP、磷酰胺连接体等。

术语“包含(comprising)”涵盖“包括(including)”以及“由…组成(consisting)”，例如，“包含X”的组合物可仅由X组成或者可以包括一些附加的东西，例如X+Y。术语“约(about)”与数值X相关是任选的，并且意味着，例如X±10％。“实质上(substantially)”一词并不排除“完全(completely)”，例如，“实质上不含Y(substantially free from Y)”的组合物可完全不含Y。在相关情况下，本发明的定义中可省略“实质上(substantially)”一词。

本文使用的术语“互补”是指AON在生理条件下与靶序列杂交的事实。这个术语并不意味着AON中的每一个核苷酸均与靶序列中的相反核苷酸完美配对。换句话说，尽管AON可能与靶序列互补，但在AON与靶序列之间可存在错配、摆动和/或凸起，而在生理条件下，AON仍与靶序列杂交，使得细胞RNA编辑酶可编辑靶腺苷。因此，术语“实质上互补”还意味着，尽管存在错配、摆动和/或凸起，AON与靶序列之间仍有足够的匹配核苷酸，在生理条件下，AON与靶RNA杂交。如本文所示，AON可为互补的，但也可包含与靶序列的一个或多个错配、摆动和/或凸起，只要在生理条件下AON能够与其靶杂交。

与核酸序列相关的术语“下游”是指沿着3'方向上的序列进一步延伸；术语“上游”的含义正好相反。因此，在编码多肽的任何序列中，起始密码子在有义链的终止密码子上游，但在反义链的终止密码子下游。

“杂交”通常是指特异性杂交，不包含非特异性杂交。使用本领域熟知的技术，可以在选定的实验条件下发生特异性杂交，以确保探针和靶之间的大多数稳定相互作用是探针和靶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％的序列同一性。术语“错配”在本文中用于指根据Watson-Crick碱基配对规则不形成完美碱基对的双链RNA复合物中的相对核苷酸。错配的核苷酸是G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U对。在一些实施方案中，本发明的AON包含少于四个错配，例如0、1或2个错配。摆动碱基对有：G-U、I-U、I-A和I-C碱基对。

本发明的AON包含与存在于靶RNA分子中的靶核苷酸直接相对的核苷酸。AON中与靶核苷酸直接相对的核苷酸在本文被定义为“孤儿核苷酸”。“中心三联体”被定义为AON内由孤儿核苷酸及其3'和5'相邻核苷酸组成的区域(因此，中心三联体＝三个核苷酸，孤儿核苷酸位于中间)。

术语“剪接突变”涉及编码前体mRNA的基因中的突变，其中剪接机制在某种意义上是功能失调的，即来自外显子的内含子剪接受到干扰，并且由于异常剪接，随后的翻译超出框架，导致编码蛋白质提前终止。如本文所论述的，通常此类缩短的蛋白质被迅速降解且不具有任何功能活性。精确的突变不一定是RNA编辑的靶；可能是剪接突变中邻近或附近的腺苷是靶核苷酸，其向I的转换将剪接突变修正回正常状态。本领域技术人员知道在剪接突变位点或区域内对腺苷进行RNA编辑后，确定正常剪接是否恢复的方法。

根据本发明的AON可在其几乎全部核苷上进行化学修饰，例如通过为核苷提供2'-O-甲基化糖部分(2'-OMe)和/或2'-O-甲氧基乙基糖部分(2'-MOE)。然而，孤儿核苷酸优选不包含2'-OMe修饰，并且在又一优选方面，与靶腺苷相对的每个核苷酸两侧的两个相邻核苷酸的至少一个，且在优选方面为两者进一步不包含2'-OMe修饰。就RNA编辑而言，AON的所有核苷酸持有2'-OMe修饰的完全修饰产生非功能性寡核苷酸(本领域已知)，大概是因为它阻碍了靶位置的ADAR活性。一般而言，通过提供具有2'-OMe基团的相对核苷酸，或者提供鸟嘌呤或腺嘌呤(因为这两种核碱基也能够减少相对腺苷的编辑)作为相对碱基，可保护靶RNA中的腺苷免受编辑。在根据本发明可容易地使用的寡核苷酸领域中，各种化学和修饰是已知的。核苷酸之间的规则核苷酸间键可通过磷酸二酯键的单硫代或二硫代而改变，分别产生硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。核苷酸间键的其他修饰是可能的，包括酰胺化和肽连接体。MP键可使用已知的化学反应形成，例如在Agrawal等人1997.《美国国家科学院院刊》USA94:2620-2625中所公开的。在优选方面，本发明的AON包含18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。

本领域已知，RNA编辑实体(诸如人ADAR酶)根据许多因素以不同的特异性编辑dsRNA结构。一个重要因素是构成dsRNA序列的两条链的互补程度。两条链的完美互补通常会导致hADAR的催化结构域以非歧视性的方式对腺苷脱氨基，或多或少地与它遇到的任何腺苷发生反应。hADAR1和2的特异性可通过引入化学修饰和/或确保dsRNA中的大量错配来增加，这可能有助于以尚未明确定义的方式定位dsRNA结合结构域。此外，可通过提供包含与待编辑腺苷相对的错配的AON来增强脱氨基反应本身。优选通过提供具有与待编辑腺苷相对的胞苷的靶向部分来创建错配。作为替代方案，也可使用尿苷与腺苷相对，这是可理解的，不会因为U和A对而导致“错配”。当靶链中的腺苷脱氨基后，靶链将获得肌苷，对于大多数生化过程，肌苷被细胞的生化机器“解读”为G。因此，在A到I转换后，错配已经得到解决，因为I完全能够与根据本发明的寡核苷酸构建体的靶向部分中的相对C进行碱基配对。在由于编辑而解决错配后，底物被释放，寡核苷酸构建体-编辑实体复合物从靶RNA序列中释放，然后可用于下游生化过程，诸如剪接和翻译。此外，这种开/关速率很重要，因为靶向寡核苷酸不应与靶RNA紧密结合。编辑靶RNA序列所需的特异性水平可取决于不同的靶。按照本专利申请中的说明，本领域技术人员将能够根据他们的需要设计寡核苷酸的互补部分，并且通过一些试错，获得期望的结果。

存在于细胞中的RNA编辑分子通常是蛋白质性质的，诸如后生动物(包括哺乳动物)中发现的ADAR酶。优选地，细胞编辑实体是酶，更优选腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶，还更优选腺苷脱氨酶。这些是具有ADAR活性的酶。最令人感兴趣的是人ADAR、hADAR1和hADAR2，包括其任何亚型，诸如hADAR1 p110和p150。本领域已知的RNA编辑酶(根据本发明的寡核苷酸构建体可方便地为其设计)包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)，诸如人或人细胞中的hADAR1和hADAR2以及胞苷脱氨酶。人ADAR3(hADAR3)已在现有技术中描述，但据报道没有脱氨酶活性。已知hADAR1存在于两种亚型中；一种长的150kDa干扰素诱导型和一种短的100kDa型，其由一个常见的前mRNA通过选择性剪接产生。因此，存在于细胞中的150kDa亚型的水平可能受到干扰素，特别是干扰素-γ(IFN-γ)的影响。hADAR1也可由TNF-α诱导。这提供了开发联合治疗的机会，由此将根据本发明的IFN-γ或TNF-α和AON作为联合产品或作为单独产品同时或随后以任何顺序向患者施用。某些疾病状况可能已经与患者某些组织中IFN-γ或TNF-α水平升高相一致，这为使编辑对患病组织更具特异性创造了进一步的机会。本领域普通技术人员将理解，细胞内的编辑实体被重定向到其他靶位点的程度可通过改变根据本发明的AON对编辑分子的识别结构域的亲和力来调节。精确的修饰可通过一些试错和/或基于AON和编辑分子的识别结构域之间的结构相互作用的计算方法来确定。另外，或者另选地，驻留在细胞中的编辑实体的募集和重定向的程度可由AON的剂量和剂量方案来调节。这是由实验者(体外)或临床医生确定的，通常在一期和/或二期临床试验中。

本发明涉及真核细胞，优选后生动物，更优选哺乳动物，最优选人细胞中靶RNA序列的修饰。本发明可用于任何器官的细胞，器官例如皮肤、肺、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、肠道、肌肉、腺体、眼睛、大脑、血液等。本发明特别适用于修饰与(人)受试者的疾病状态有关的细胞、组织或器官中的序列。细胞可在体外、体外或体内定位。本发明的一个优点是，它可用于活生物体中的原位细胞，但也可用于培养中的细胞。在一些实施方案中，对细胞进行体外处理，然后将其引入活生物体(例如，将其重新引入最初来源的生物体)。本发明还可用于编辑所谓的类器官内的细胞中的靶RNA序列。类器官在体外衍生的组织中可被认为是三维的，但是使用特定的条件来驱动以产生单独的、分离的组织(例如，见Lancaster&Knoblich,《科学(Science)》2014,vol.345no.6194 1247125)。在治疗环境中，它们是有用的，因为它们可在体外从患者细胞中衍生，然后类器官可作为自体材料重新引入患者体内，与正常移植相比，此类自体材料不太可能被排斥。待处理的细胞通常会发生基因突变。突变可以是杂合子，也可以是纯合子。本发明通常用于修饰点突变，诸如N到A突变，其中N可为G、C、U(在DNA水平T上)，优选G到A突变，或N到C突变，其中N可为A、G、U(在DNA水平T上)，优选U到C突变。

在不希望受到理论约束的情况下，通过hADAR1和hADAR2进行的RNA编辑被认为发生在细胞核的初级转录物上，在转录或剪接期间，或在细胞质中，例如成熟mRNA、miRNA或ncRNA可被编辑。已知编辑酶的不同亚型存在差异定位，例如，hADAR1 p110主要位于细胞核中，hADAR1 p150位于细胞质中。胞苷脱氨酶的RNA编辑被认为是在mRNA水平上进行的。

许多遗传病是由G到A突变引起的，这些是优选的靶疾病，因为突变靶点腺苷上的腺苷脱氨基将使突变逆转为密码子，从而产生功能性、全长和/或野生型蛋白质，特别是当它涉及PTC时。可用根据本发明的寡核苷酸预防和/或治疗的遗传疾病的优选示例是其中靶RNA中的一个或多个腺苷的修饰将带来(潜在)有益改变的任何疾病。特别优选的是Usher综合征和CF，更具体地说，优选的是在CFTR RNA中对疾病诱导性PTC中腺苷的RNA编辑。CF突变领域的技术人员认识到，CFTR基因中已知1000到2000个突变，包括G542X、W1282X、R553X、R1162X、Y122X、W1089X、W846X、W401X、621+1G>T或1717-1G>A。

应当清楚的是，根据本发明的靶向编辑可应用于任何腺苷(或胞嘧啶)，无论其是给定序列中的突变核苷酸还是野生型核苷酸。例如，编辑可用于创建具有不同特性的RNA序列。此类特性可为编码特性(产生具有不同序列或长度的蛋白质，导致蛋白质特性或功能的改变)或结合特性(导致RNA本身或靶或结合配偶体的抑制或过度表达；通过在靶RNA上重新编码miRNA或其同源序列，可改变整个表达途径)。蛋白质功能或定位可通过功能结构域或识别基序随意改变，功能结构域或识别基序包括但不限于信号序列、靶向或定位信号、蛋白水解裂解或共翻译或翻译后修饰的识别位点、酶的催化位点、结合配偶体的结合位点、降解或活化信号等。这些和其他形式的RNA和蛋白质“工程”，无论是否用于预防、延迟或治疗疾病，或用于医学或生物技术中的任何其他目的，作为诊断、预防、治疗、研究工具或其他，均涵盖在本发明中。

待施用的AON量、剂量和施用方案可能因细胞类型、待治疗疾病、目标人群、施用方式(例如全身与局部)、疾病严重程度和副作用的可接受水平而异，但这些可也应在体外研究、临床前和临床试验期间通过反复试验进行评估。当修饰后的序列导致易于检测到的表型变化时，试验特别简单。高剂量的AON可能会竞争与细胞内核酸编辑实体(例如ADAR)的结合，从而耗尽可自由参与RNA编辑的实体数量，但常规剂量试验将揭示给定AON和给定靶的任何此类效应。

一种合适的试验技术涉及将AON递送到细胞系或测试生物体，然后在此后的不同时间点采集活检样本。可在活检样本中评估靶RNA的序列，并且可很容易地跟踪具有修饰的细胞的比例。在本次试验完成一次后，可保留知识，并且可在不需要采集活检样本的情况下进行未来的递送。因此，本发明的方法可包括以下步骤：鉴定细胞的靶RNA序列中存在所需变化，从而验证靶RNA序列已被修饰。如上文所述，该步骤通常涉及对靶RNA的相关部分或其cDNA拷贝(或其剪接产物的cDNA拷贝，在靶RNA是前mRNA的情况下)进行测序，因此可容易地验证序列变化。另选地，例如，当由靶RNA序列编码的蛋白质是离子通道时，可在蛋白质水平(长度、糖基化、功能等)上评估变化，或者通过一些功能性读出，诸如(n)(诱导型)电流来评估变化。

在细胞中进行RNA编辑后，修饰的RNA会随时间的推移而稀释，例如由于细胞分裂、编辑的RNA的半衰期有限等原因。在实际治疗方面，本发明的方法可涉及重复递送AON，直到足够的靶RNA被修饰以向患者提供有形益处和/或随时间的推移维持益处。

本发明的AON特别适合于治疗用途，因此本发明提供了包含本发明的AON和药学上可接受的载体的药物组合物。在本发明的一些实施方案中，药学上可接受的载体可简单地为盐溶液。这可有效地是等渗的或低渗的，特别是肺部递送。本发明还提供包括本发明的药物组合物的递送装置(例如注射器、吸入器、喷雾器)。

本发明还提供了本发明的AON，用于在哺乳动物，优选人细胞中改变靶RNA序列的方法，如本文所述。类似地，本发明提供了本发明的AON在制备用于改变哺乳动物，优选人细胞中靶RNA序列的药物中的用途，如本文所述。

本发明还涉及用于细胞中存在于靶RNA序列中的至少一种特定靶腺苷的脱氨基的方法，该方法包含以下步骤：

向细胞提供根据本发明的AON；允许细胞摄取AON；允许AON退火到靶RNA分子；允许包含野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的哺乳动物ADAR酶将靶RNA分子中的靶腺苷脱氨基为肌苷；以及任选地鉴定RNA序列中肌苷的存在。

在优选方面，取决于A到I转化的最终脱氨基效应，鉴定步骤包含：对靶RNA进行测序；评估功能性、伸长性、全长和/或野生型蛋白质的存在；评估前mRNA的剪接是否因脱氨基而改变；或使用功能性读出，其中脱氨基后的靶RNA编码功能性、全长、伸长性和/或野生型蛋白质。由于腺苷脱氨基为肌苷可能导致蛋白质在靶位置不再受到突变A的影响，因此对脱氨基为肌苷的鉴定也可为功能性读出，例如对是否存在功能性蛋白质的评估，或者甚至是对由腺苷引起的疾病被(部分)逆转的评估。本文提及的每种疾病的功能评估通常根据本领域技术人员已知的方法进行。在靶腺苷脱氨基后鉴定肌苷存在的非常合适的方式当然是使用本领域技术人员熟知的方法进行RT-PCR和测序。

根据本发明的AON适宜地在水溶液(例如盐水)或悬浮液中施用，任选包含添加剂、赋形剂和与药物用途相容的其他成分，浓度范围为1ng/ml至1g/ml，优选10ng/ml至500mg/ml，更优选100ng/ml至100mg/ml。剂量可适当地在约1μg/kg至约100mg/kg之间，优选约10μg/kg至约10mg/kg，更优选约100μg/kg至约1mg/kg之间。施用可通过吸入(例如通过雾化)、鼻内、口服、注射或输注、静脉内、皮下、皮内、颅内、玻璃体内、肌内、气管内、腹膜内、直肠内等方式。施用可为固体形式、粉末形式、药丸形式、凝胶形式、滴眼液形式或与人类药物用途相容的任何其他形式。

实施例

实施例1：使用体外生化分解分析，包含甲基膦酸酯(MP)键修饰的反义寡核苷酸 (AON)比缺乏此类MP修饰的AON更稳定

众所周知，与未携带此类2'-OMe修饰的AON相比，靶RNA分子中与靶腺苷相对的核苷酸糖部分的2'-OMe修饰的存在降低了该特定靶腺苷向肌苷的脱氨基。不幸的是，在这个特殊位置没有此类糖修饰使得AON不稳定。本发明的发明人质疑是否可通过在两个DNA核苷酸之间进行核苷酸间键修饰来解决这一问题。为此，在AON中的两个DNA核苷(其中一个与靶小鼠IDUA RNA分子中存在的靶腺苷相对)及其各自的3'相邻核苷之间引入了两个甲基膦酸酯(MP)键。MP修饰的DNA-DNA键的结构如图1所示。图2显示了小鼠IDUA靶分子的序列以及使用的互补AON，表明AON ADAR102-1中的DNA核苷(图2中大写)之间不存在修饰，并且两个DNA核苷及其各自的3'相邻核苷之间存在MP修饰，在ADAR102-13中用^标记。ADAR102-21的序列(在AON的所有位置均携带2'-OMe修饰以及在该胞苷与其3'相邻腺苷之间以及在两个5'前键中携带PS修饰)和ADAR102-25的序列(在与ADAR102-1相同的位置处携带两个DNA核苷，并且具有与ADAR102-21类似的PS键)未显示。

所有四种寡核苷酸，ADAR102-1(2x DNA，无键修饰)、ADAR102-25(2x DNA，PS修饰)、ADAR102-21(PS修饰)和ADAR102-13(2x DNA，MP修饰)均在生化稳定性测定中进行了测试。用无核酸酶水(Ambion)将所有寡核苷酸稀释至25μm的浓度，并且将10μl的每个寡核苷酸与10μl的肝裂解物和10μl的核酸酶混合物在37℃下孵育。肝裂解物的制备如下：使用来自Miltenyi Biotech的GentleMacs匀浆器将3.5g野生型C57BI/6J小鼠肝脏在9ml的100mMTris HCl、pH8和1mM MgOAc 4℃下匀浆，在4℃下以4000rpm离心5分钟，然后按Pierce BCA蛋白质测定试剂盒的测定，等分为1ml等分试样的12mg/ml蛋白质浓缩液，并且储存在-80℃下以供进一步使用。核酸酶混合物的制备如下：将5μl来自Crotalus adamenteus毒液的磷酸二酯酶I(Sigma)、5μl DNase I(新英格兰生物实验室)、5μl RNase A(赛默飞世尔科技)和5μl核酸酶BAL-31(新英格兰生物实验室)混合在30μl的核酸酶BAL-31缓冲液(新英格兰生物实验室)和10μl无核酸酶水(Ambion)中。通过加入等体积的变性样本缓冲液(8M尿素、20mM EDTA、5mM Tris-HCl、pH7.5、30％甘油、0.005％二甲苯腈蓝、0.01％溴酚蓝)，在预定时间点(0、30和120分钟)停止寡核苷酸的孵育。随后，使用BioRad Mini-PROTEAN-Tetra细胞凝胶电泳系统在变性15％Mini-PROTEAN TBE尿素凝胶、15孔、15μl、BioRad上解析样本。凝胶用甲苯胺蓝O(Sigma-Aldrich)染色30分钟并在水中解染。用带有白光转换屏的BioRadGel Doc XR+成像仪对凝胶进行成像，并使用ImageJ程序进行分析。

结果在图3中给出，并且清楚地表明，当与其中两个DNA核苷酸在测试条件下与正常磷酸二酯连接的ADAR102-1相比时，两个DNA核苷酸之间的PS键的存在(在ADAR102-25中)没有给出附加的稳定性。上面板显示了携带2'-OMe修饰和PS键的ADAR102-21的结果，并且表明2'-OMe的存在确实增加了寡核苷酸的稳定性。令人惊讶的是，在寡核苷酸中的相同位置处没有携带2'-OMe修饰的寡核苷酸，但其中引入了MP键，使得寡核苷酸非常稳定，并且在该稳定性测定中似乎与2'-OMe修饰的寡核苷酸一样稳定。结论是，在寡核苷酸中引入MP键可提供与2'-OMe糖修饰相当的稳定性。

实施例2：由携带稳定性MP键修饰的AON进行的RNA编辑

接下来，发明人质疑MP修饰尽管提供了更稳定的AON，但是否仍会阻止RNA编辑，类似于在AON的DNA核苷酸之间携带PS修饰的AON中观察到的低RNA编辑效率(数据未显示)。因此，研究了MP修饰-现在已知它增加了AON的稳定性-是否允许RNA编辑，这与2'-OMe修饰(尽管提供稳定性)不同，2'-OMe修饰使AON在RNA编辑中无效。

为此，在RNA编辑分析中比较ADAR102-1和ADAR102-13，如下所示。首先，将两个AON退火至小鼠IDUA靶RNA。退火在缓冲液(5mM Tris-Cl pH7.4、0.5mM EDTA和10mM NaCl)中以靶RNA与AON的1:3比例(编辑反应中的最终浓度为6nM AON和2nM靶)进行。样本在95℃下加热3分钟，然后缓慢冷却至室温。接下来，进行编辑反应。将退火的双链AON/靶RNA与蛋白酶抑制剂(完全、迷你、不含EDTA的蛋白酶I，Sigma-Aldrich)、RNase抑制剂(RNasin，Promega)、聚A(Qiagen)、tRNA(Invitrogen)和编辑反应缓冲液(15mM Tris-Cl pH7.4、1.5mM EDTA、3％甘油、60mM KCl、0.003％NP-40、3mM MgCl₂和0.5mM DTT)混合。通过向混合物中加入由GenScript生产的纯化的ADAR2至最终浓度为8nM来开始反应，并在37℃下孵育预定时间点(0、2、5、10、20、40和60分钟)。通过加入190μL沸水停止反应，然后将混合物在95℃下孵育5分钟。然后将停止的反应混合物用作使用Maxima逆转录酶和六聚体(ThermoFisher)合成cDNA的模板。将cDNA稀释10倍，并且将该稀释液的1μL用作数字液滴PCR(ddPCR)的模板。使用BioRad的QX-200液滴数字PCR系统进行核酸靶序列绝对定量的ddPCR测定。将从RT cDNA合成反应中获得的1μL稀释cDNA用于总共20μL的反应混合物中，包括用于Probes no dUTP的ddPCRSupermix(Bio-Rad)，一种Taqman SNP基因型测定，使用以下正向和反向引物结合以下基因特异性探针：

正向引物：

5'-CTCACAGTCATGGGGCTC-3'(SEQ ID NO:4)

反向引物：

5'-CACTGTATGATTGCTGTCCAAC-3'(SEQ ID NO:5)

野生型探针(FAM NFQ标记)：

5'-AGAACAACTCTGGGCAGAGGTCTCA-3'(SEQ ID NO:6)

突变探针(HEX NFQ标记)：

5'-AGAACAACTCTAGGCAGAGGTCTCA-3'(SEQ ID NO:7)

使用多通道移液管，将包括cDNA的总体积为20μl的PCR混合物填充到ddPCR盒(BioRad)的中间行。复制体被两个盒分割。底部各行填充70μl的探针油滴生成油(BioRad)。更换橡胶垫片后，QX200液滴发生器中生成液滴。将40μl油乳剂从盒的顶行转移到96孔PCR板上。使用PX1封板机在170℃下用锡箔密封PCR板4秒钟，然后进行以下PCR程序：在95℃下进行1个循环的酶激活10分钟，在95℃下进行40个循环的变性30秒，在63.8℃下退火/延伸1分钟，在98℃下进行1个循环的酶失活10分钟，随后在8℃下储存。PCR结束后，用QX200液滴读取器对平板进行读取和分析。

结果在图4中给出，并且清楚地表明，尽管与靶腺苷相对的DNA核苷酸(ADAR102-1)之间未携带键修饰的AON相比有所减少，但使用ADAR102-13确实使RNA编辑率高达30％。这清楚地表明，连接靶RNA分子中与靶腺苷相对的两个DNA核苷酸及其各自的3'相邻核苷的MP修饰的存在允许RNA编辑。加上修饰增加了AON的稳定性的事实，与现有技术中迄今为止所展示的相比，可认为这两个特征一起提供了一种改进的RNA编辑工具。

实施例3：通过携带稳定MP键修饰的AON编辑RNA

接下来，发明人质疑在AON哪里可以进行MP修饰，并且仍然允许RNA编辑。合成并测试了相对于孤儿核苷在0至-6键位置处具有MP修饰的AON。如实施例2所示进行编辑分析，但有以下变化：最终浓度为1nM靶RNA、24nM AON和3nM ADAR2，并且在编辑反应缓冲液中使用3mM MgSO₄代替3mM MgCl₂。如实施例2所述进行反应，并且通过在时间点0秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、25分钟和50分钟的时间点将95μl煮沸的3mM EDTA溶液加入5μl从反应中提取的等分试样中来停止反应。

然后使用Maxima逆转录酶试剂盒(Thermo Fisher)和靶RNA特异性引物(5'-GGAAACGTAGGTTGGGGTGTG-3'SEQ ID NO:8)，将停止反应混合物的6μl等分试样用作cDNA合成的模板。在引物和dNTP存在的情况下，RNA在95℃下初步变性5分钟，随后缓慢冷却至10℃，之后根据制造商的说明，使用62℃的延伸温度，以20μl的总体积进行第一次链合成。

根据制造商的说明，使用Amplicataq gold 360DNA聚合酶试剂盒(应用生物系统公司)，以1μl的cDNA为模板，通过PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析。下列引物以10μM的浓度使用：Pyroseq Fwd2IDUA，5'-AGTACTCACAGTCATGGGGCTCA-3'(SEQ ID NO:9)，和PyroseqRev2 IDUA Biotin，5'-GCCAGGACACCCACTGTATGAT-3'(SEQ ID NO:10)。后一种引物还含有与其5'端结合的生物素，这是焦磷酸测序反应期间自动处理所需的。采用以下热循环方案进行PCR：最初在95℃变性5分钟，随后进行40个循环的在95℃下30秒、60℃下30秒和72℃下30秒，最后在72℃下延长7分钟。

由于在逆转录反应的cDNA合成过程中肌苷与胞苷之间存在碱基对，因此在PCR期间，并入编辑位置的核苷酸将是鸟苷。鸟苷(已编辑)与腺苷(未编辑)的百分比通过焦磷酸测序确定。PCR产物的焦磷酸测序和后续数据分析由PyroMark Q48 Autoprep仪器(QIAGEN)按照制造商的说明进行，输入10μl的PCR产物和4μM的以下测序引物：IDUA-Seq2，5'-TGGGGCTCATGGCCCT-3'(SEQ ID NO:11)。为该靶RNA链专门定义的设置包括两组序列信息。其中第一组定义了仪器分析的序列，其中特定位置含有腺苷或鸟苷的可能性由“/”指示：5'-GTTGGATGGAGAACAACTCTA/GGGCAGAGGTCTCAA/GAGGC TGGGGCT-3'(SEQ ID NO:12)。请注意，测序中分析了两个位置：靶位点和不应编辑的对照位点(结果仅显示靶位点)。第二组定义了分配对应于每个核苷酸的测序试剂的顺序，并且还包括空白对照(即不应该在该特定位置并入的核苷酸)，其被仪器用来定义背景信号。本次分析的分配顺序定义如下：CGTGAT GAGACACTCGTAGCAGAGTCTGCAGAGCTGCA(SEQ ID NO:13)。仪器进行的分析以该位置检测到的腺苷和鸟苷的百分比提供所选核苷酸的结果，因此，所选位置的A-到-I编辑程度将通过该位置的鸟苷百分比进行测量。

图6和图7中的结果表明，在孤儿核苷酸附近区域的任何核苷酸之间具有MP键的AON允许RNA编辑。观察到位置0和-2的修饰提供了与阳性对照AON相似的RNA编辑特性。其他位置可携带MP。无论从最终编辑水平还是反应动力学来看，它们在RNA编辑方面似乎均没有那么有效。

实施例4：通过携带稳定MP键修饰的AON在细胞中编辑RNA

发明人接下来研究了AON在细胞中进行编辑的能力，细胞中存在具有实施例2和3中使用的靶位点序列的RNA。所论述的细胞是一种小鼠胚胎成纤维细胞系，其中内源性Idua基因具有G-至-A突变(在靶位点产生A)，导致提前终止密码子(W392X)的形成。这些细胞还过度表达来自稳定整合cDNA构建体的Idua W392X RNA。简而言之，在转染前24小时接种150000个细胞，按照制造商的说明(以1μl Lipofectamine 2000与1μg EON的比例)用100nMAON和Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行转染。根据制造商的说明，使用Direct zolRNA MiniPrep(Zymo Research)试剂盒在转染后48小时从细胞中提取RNA，并且根据制造商的说明，使用Maxima逆转录酶试剂盒(Thermo Fisher)制备cDNA，结合随机六聚体和寡聚dT引物。将cDNA稀释4倍，并且将该稀释液的1μL用作数字滴PCR(ddPCR)的模板，其按照实施例2中的详细说明进行。

图8中的结果显示，不含MP(IDUA103)的AON显示可变编辑，与背景没有明显区别，背景由含有未处理(NT)细胞或仅用Lipofectamine 2000(mock)处理的细胞的对照样本定义。相比之下，带有MP键修饰的AON可容易地在该背景水平以上在细胞中进行编辑。这代表了AON抵抗核酸酶降解的能力以及募集内源性编辑酶的能力。

序列表

<110> PROQR治疗上市公司II

<120> 用于RNA编辑的化学修饰寡核苷酸

<130> P3670PC00

<160> 13

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 61

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 1

uguuggaugg agaacaacuc uaggcagagg ucucaaaggc uggggcugug uuggacagca 60

a 61

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AON: ADAR102-1; ADAR102-13

<400> 2

cacagcccca gccuuugaga ccucugucca gaguuguuc 39

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IDUA125; IDUA163; IDUA170; IDUA176; IDUA182; IDUA247; IDUA250;

IDUA253; IDUA103; IDUA268

<400> 3

gccccagccu uugagaccuc uguccagagu uguucu 36

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

ctcacagtca tggggctc 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cactgtatga ttgctgtcca ac 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 野生型探针（FAM NFQ 标记）

<400> 6

agaacaactc tgggcagagg tctca 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体探针(HEX NFQ标记)

<400> 7

agaacaactc taggcagagg tctca 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶RNA-特异性引物

<400> 8

ggaaacgtag gttggggtgt g 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pyroseq Fwd2 IDUA 引物

<400> 9

agtactcaca gtcatggggc tca 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pyroseq Rev2 IDUA 生物素

<400> 10

gccaggacac ccactgtatg at 22

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IDUA-Seq2 引物

<400> 11

tggggctcat ggccct 16

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 焦磷酸测序分析序列

<400> 12

gttggatgga gaacaactct agggcagagg tctcaagagg ctggggct 48

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 分配顺序

<400> 13

cgtgatgaga cactcgtagc agagtctgca gagctgca 38

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种能够在细胞中与靶核酸分子形成双链复合物的反义寡核苷酸(AON)，其用于使所述靶核酸分子中靶核苷酸，优选腺苷脱氨基，其中所述AON中与所述靶核苷酸直接相对的核苷酸是孤儿核苷酸，其中核苷酸间键编号使得键编号0位于所述孤儿核苷酸的5'键，并且其中所述寡核苷酸中的键位置朝着5'端正(+)递增且朝着3'端负递增，并且其中所述AON在键位置0、-1、-2、-3、-4、-5和/或-6处包含一个或多个甲基膦酸酯(MP)键，其中所述MP键具有以下化学结构：

2.根据权利要求1所述的AON，其中所述孤儿核苷酸不携带2'-OMe或2'-MOE核糖修饰。

3.根据权利要求1或2所述的AON，其中所述AON在键位置-0和/或-2处包含MP键。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的AON，其中所述MP键将DNA核苷与另一核苷连接。

5.根据权利要求4所述的AON，其中所述MP键将DNA核苷与DNA核苷连接。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的AON，其中所述AON还包含至少一个硫代磷酸酯或磷酰基乙酸酯核苷酸间键，和/或至少一个包含解锁核酸(UNA)核糖修饰的核苷酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的AON，其中所述AON还包含一个或多个核苷酸，该核苷酸包含核糖的2'位置处的取代基，其中所述取代基选自：-OH；-F；取代或未取代的、直链或支链的低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，它们可被一个或多个杂原子中断；-O-、S-、或N-烷基；-O-、S-、或N-烯基；-O-、S-、或N-炔基；-O-、S-、或N-烯丙基；-O-烷基-O-烷基；-甲氧基；-氨基丙氧基；-甲氧基乙氧基；-二甲氨基氧乙氧基；和-二甲氨基乙氧基乙氧基。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的AON，其中所述AON包含至少一个包含2'-OMe或2'-MOE核糖修饰的核苷酸，并且其中所述孤儿核苷酸不携带2'-OMe或2'-MOE核糖修饰。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的AON，其中所述AON能够在细胞中使用具有脱氨酶活性的酶，优选具有腺苷脱氨酶活性的酶，诸如人ADAR1或ADAR2。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的AON，其中所述AON的长度至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个核苷酸，并且其中所述AON短于100个核苷酸，优选短于60个核苷酸。

11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的AON和药学上可接受的载体。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的AON，或根据权利要求11所述的药物组合物，其用于治疗或预防遗传疾病，所述遗传疾病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、CADASIL、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊肌萎缩症(DSMA)、杜氏贝氏肌营养不良症、(营养不良)大疱性表皮松解症、法布里病、因子V莱顿相关联疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高雪氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色素沉着症、亨特综合征、亨廷顿氏病、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集综合征、莱伯氏先天性黑蒙(诸如LCA10)、Lesch-Nyhan综合征、林奇综合征、马凡综合征、黏多糖贮积症、肌营养不良、肌强直性营养不良I型和II型、神经纤维瘤病、Niemann-Pick病A、B和C型、NY-eso1相关癌症、Peutz-Jeghers综合征、苯丙酮尿症、庞培氏病、原发性睫状体病、凝血酶原突变相关疾病，诸如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、(常染色体显性)视网膜色素变性、桑德霍夫病、严重联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞贫血、脊髓性肌萎缩症、Stargardt病、Tay-Sachs病、Usher综合征(诸如Usher综合征I型、II型和III型)、X-连锁免疫缺陷、Sturge-Weber综合征和癌症。

13.一种对细胞中存在于靶RNA分子中的至少一种靶核苷酸，优选腺苷脱氨基的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)向所述细胞提供根据权利要求1至10中任一项所述的AON或根据权利要求11所述的药物组合物；

(ii)允许所述AON退火到所述靶RNA分子；

(iii)允许具有核苷酸脱氨酶活性的哺乳动物酶对所述靶RNA分子中的所述靶核苷酸脱氨基；和

(iv)任选地鉴定所述靶RNA分子中脱氨基核苷酸的存在。

14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(iv)包括：

a)对所述靶RNA分子的区域进行测序，其中所述区域包含脱氨基的靶核苷酸；

b)当所述靶核苷酸是位于UGA或UAG终止密码子中的腺苷，该终止密码子通过所述脱氨基编辑为UGG密码子时，评估功能性、伸长性、全长和/或野生型蛋白质的存在；

c)当两个靶腺苷位于UAA终止密码子中，该终止密码子通过两个靶腺苷的所述脱氨基编辑为UGG密码子时，评估功能性、伸长性、全长和/或野生型蛋白质的存在；

d)当所述靶RNA分子为前体mRNA时，评估所述前体mRNA的剪接是否因所述脱氨基而改变；或

e)使用功能性读出，其中所述脱氨基后的所述靶RNA分子编码功能性、全长、伸长性和/或野生型蛋白质。

15.一种对存在于靶RNA分子中的至少一种靶核苷酸，优选腺苷脱氨基的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供根据权利要求1至10中任一项所述的AON；

(ii)允许所述AON退火到所述靶RNA分子；

(iii)允许具有核苷酸脱氨酶活性的哺乳动物酶对所述靶RNA分子中的所述靶核苷酸脱氨基；和

(iv)鉴定所述靶RNA分子中脱氨基核苷酸的存在。