一种发芽期耐盐或盐敏感水稻种子的筛选方法
阅读说明：本技术 一种发芽期耐盐或盐敏感水稻种子的筛选方法 (Screening method of salt-tolerant or salt-sensitive rice seeds in germination period ) 是由 关亚静 高月 牟青山 胡晋 胡伟民 宋文坚 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种发芽期耐盐或盐敏感水稻种子的筛选方法,该方法包括：测定水稻种子发芽期的各个生长指标,计算校正生长指标值；采用隶属函数,计算得到隶属函数值；按照水稻类型进行分类,进行相关性分析,得到相关性生长指标；再进行主成分分析,得到权重系数；再计算各水稻种子所有相关性生长指标的修正隶属函数值的平均值,得到排序参考值；最后筛选出发芽期耐盐性强或盐敏感的水稻种子。本发明将水稻种子先进行分类,再利用隶属函数、相关性分析法和主成分分析法获得水稻种子的耐盐性排序,从而筛选获得发芽期耐盐性好的水稻种子,为后续的育种、栽培和生产提供理论依据和应用基础。(The invention discloses a screening method of salt-tolerant or salt-sensitive rice seeds in a germination period, which comprises the following steps: measuring each growth index of the rice seeds in the germination period, and calculating a corrected growth index value; calculating to obtain a membership function value by adopting a membership function; classifying according to rice types, and performing correlation analysis to obtain correlation growth indexes; then, carrying out principal component analysis to obtain a weight coefficient; then calculating the average value of the correction membership function values of all the correlation growth indexes of each rice seed to obtain a sequencing reference value; finally, screening out the rice seeds with strong salt tolerance or salt sensitivity in the germination period. According to the method, the rice seeds are classified firstly, and then the salt tolerance sequence of the rice seeds is obtained by using the membership function, the correlation analysis method and the principal component analysis method, so that the rice seeds with good salt tolerance in the germination period are obtained by screening, and a theoretical basis and an application basis are provided for subsequent breeding, cultivation and production.)
技术领域
本发明涉及植物种子活力和处理技术领域，尤其涉及一种发芽期耐盐或盐敏感水稻种子的筛选方法。
背景技术
水稻是一种重要的粮食作物，为中度盐敏感的禾谷类作物，全球受盐害的土壤约占全部耕地面积的20％。中国盐碱地类型复杂，分布广泛，总面积约占全部耕地面积的25％。近年来，受全球极端天气和耕作灌溉方式不完善等问题的影响，土地盐渍化和次生盐渍化现象日趋严峻，直接威胁国家的粮食安全。为充分开发利用盐碱地，增加作物耕地面积进而提高粮食产量，从19世纪50年代开始，国内外学者开始对水稻种质资源耐盐性鉴定开展研究，改良水稻耐盐性。
土壤盐害作为对作物生长和产量影响极为严重的环境因子之一，会抑制水稻的生长发育，降低株高、分蘖数、单株绿叶数及生物量，影响光合作用，进一步导致产量下降。总之，植物的耐盐性是由多因素联合控制的综合性数量性状，仅依据单一的指标难以全面准确地反映植物抗盐性的强弱；并且水稻品种类型繁多，对水稻耐盐性的评价应针对不同类型选取若干关键的指标进行综合评价。
隶属函数分析法是一种可以将多个指标数据进行系统分析的方法，评价的结果较为科学可靠，目前在作物的抗逆性筛选鉴定方面有着广泛的应用；但有关于水稻发芽期种子抗盐性的鉴定尚不完善，并且隶属函数分析法运用在水稻发芽期耐盐性鉴定的探索尚未开展。
发明内容
本发明提供了一种发芽期耐盐或盐敏感水稻种子的筛选方法，该方法能够有效快速的从待筛选的水稻品种中筛选得到更具耐盐性的水稻种子，为后续的育种、栽培和生产提供理论依据和应用基础。
具体技术方案如下：
一种发芽期耐盐或盐敏感水稻种子的筛选方法，包括以下步骤：
(1)取多种待筛选的水稻品种，将其种子分别置于清水湿润和不同盐浓度的盐水湿润的发芽纸上，进行发芽试验，测定种子发芽及萌发14天的幼苗生长指标，并计算各水稻品种在不同盐浓度下各生长指标值与零盐浓度下各生长指标值的比值，记为校正生长指标值；
(2)对各水稻品种的校正生长指标值进行隶属函数分析，得到隶属函数值；
(3)按照水稻类型将所述水稻品种进行分类，获得不同类别的样本集；再根据步骤(1)所述的校正生长指标值，在同一样本集中，对各生长指标进行相关性分析，剔除相关性小的生长指标，得到各样本集内的相关性生长指标；
(4)根据步骤(3)所述的相关性生长指标，对各样本集内的各相关性生长指标进行主成分分析，得到各样本集内各相关性生长指标归一化权重系数；
(5)将步骤(4)所述的权重系数与相对应的各水稻品种各相关性生长指标的隶属函数值相乘，得到各水稻品种各相关性生长指标的修正隶属函数值；再计算各水稻种子所有相关性生长指标的修正隶属函数值的平均值，得到排序参考值；
(6)根据所述排序参考值对各水稻种子进行耐盐性排序，并根据耐盐性排序的结果，选择排序靠前或靠后的水稻种子，筛选出发芽期耐盐性强或盐敏感的水稻种子。
进一步地，步骤(1)中，所述待筛选的水稻品种的数量≥15种。
进一步地，步骤(1)中，所述不同盐浓度为至少两种以上的盐浓度，分别为低盐浓度和高盐浓度。
更进一步地，所述低盐浓度为50～160mM，所述高盐浓度为165～300mM。
作为优选，所述低盐浓度为150mM，所述高盐浓度为200mM。
进一步地，步骤(1)中，所述生长指标包括：发芽势、发芽率、幼苗率、发芽指数、活力指数、平均发芽时间、鲜重和干重。
进一步地，步骤(2)中，所述隶属函数的公式为：R(Xj.i)＝(Xj.i-Xj.min)/(Xj.max-Xj.min)；
其中，Xj.i表示第i个品种第j个生长指标的校正生长指标值；Xj.min表示第j个生长指标的校正生长指标值的最小值；Xj.max表示第j个生长指标的校正生长指标值的最大值；R(Xj.i)表示第i个品种第j个生长指标的隶属函数值。
进一步地，步骤(3)中所述分类的方式为：(A)以籼、粳分类，分为：籼稻、粳稻和籼粳稻；或者，(B)以育种方式分类，分为：杂交稻和常规稻；或者，(C)以稻米品质分类，分为糯稻和非糯稻。
进一步地，步骤(4)中，采用SPSS软件进行主成分分析，并计算归一化权重系数。
进一步地，步骤(3)中，所述相关性小的生长指标为：与该生长指标有相关性的其他生长指标的数量占生长指标总数量的比值≤1/3。
进一步地，步骤(6)中，对采用不同分类方式筛选出的发芽期耐盐或盐敏感的水稻种子进行统计，选出出现频率最高的水稻品种，得到发芽期耐盐或盐敏感的水稻品种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将水稻种子先进行分类，再利用相关性分析法和主成分分析法，结合隶属函数，获得水稻种子的耐盐性排序，从而筛选获得发芽期耐盐性好的水稻种子，为后续的育种、栽培和生产提供理论依据和应用基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例所需试剂：用于盐处理的氯化钠购自于Aladdin公司。
18个水稻品种：钱优1号、领优华占、内5优8015、晶两优534、株两优06、Y两优689、梦两优华占、浙两优274、春优84、春优927、嘉丰优2号、嘉优5号、甬优10号、春江糯6号、秀水121、嘉58、嘉早丰18、甬籼15。根据水稻不同分类方式，可以分为籼稻、籼粳和粳稻，杂交稻和常规稻，糯稻和非糯稻(具体见表1)。
以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
表1 实施例所用水稻品种的分类
实施例1 水稻品种在不同盐浓度下发芽的生长指标
(1)水稻种子置于铺有三层经0、150或200mM盐水湿润的发芽纸上进行发芽试验，4次重复，每重复100粒种子。种子置于30℃(16小时黑暗)/20℃(8小时光照)培养箱中，光照强度为250μmol·m-2·s-1。以种子胚根突破种皮为发芽标准，每天记录发芽数。发芽第5天统计发芽势，第14天统计发芽率和幼苗率。统计发芽率时，随机选择40株幼苗测定鲜重，随后将样品置于80℃烘箱中保持24小时，取出后放干燥器冷却后测定其干重。最后计算发芽指数，活力指数和平均发芽时间。
其中发芽势(GE，％)＝(5天内种子发芽数/受检种子数)×100％；
发芽率(GP，％)＝(14天内种子发芽数/受检种子数)×100％；
正常幼苗率(SP，％)＝(第14天健壮幼苗数/受检种子数)×100％；
发芽指数(GI)＝∑(Gt/Dt)，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数；
活力指数(VI)＝GI×DW，式中，GI为发芽指数，DW为干重；
平均发芽时间(MGT，天)＝∑(Gt×Tt)/∑Gt，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数。
表2 水稻种子在不同浓度盐胁迫下的发芽和幼苗生长指标
由表2可知，10个水稻品种在0mM盐浓度下的发芽率等生长指标层次不齐，均不在同一水平，并且10个水稻品种的类型不同，其耐盐性不能简单的只根据其在150和200mM盐浓度下生长指标的差异直接进行判断得出结论。
(2)根据步骤(1)的生长指标值，计算水稻种子在不同盐浓度下各生长指标值与零盐浓度下各生长指标值的比值，得到校正生长指标值。
表3 水稻种子在不同浓度盐胁迫下发芽和幼苗校正指标
GE：相对发芽势；GP：相对发芽率；SP：相对成苗率；GI：相对发芽指数；VI：相对活力指数；MGT：相对平均发芽时间；FW：相对鲜重；DW：相对干重。
(3)根据步骤(2)的校正生长指标值，采用隶属函数计算得到样本集内各水稻种子各生长指标的隶属函数值；
隶属函数的公式为：R(Xj.i)＝(Xj.i-Xj.min)/(Xj.max-Xj.min)；
其中，Xj.i表示第i个品种第j个生长指标的校正生长指标值；Xj.min表示第j个生长指标的校正生长指标值的最小值；Xj.max表示第j个生长指标的校正生长指标值的最大值；R(Xj.i)表示第i个品种第j个生长指标的隶属函数值。
根据隶属函数值得到排序参考值，根据排序参考值对各水稻种子进行耐盐性排序，根据耐盐性排序的结果，选择排序靠前的水稻种子，即为发芽期耐盐性好的水稻种子。根据150mM盐浓度下指标隶属函数值的综合排序结果，晶两优534、甬籼15和春优927的排序为第1、第2和第3，浙两优274、秀水121和春江糯6号的排序为第16、第17和第18，而200mM盐浓度下的综合排序结果显示，甬籼15、晶两优534和Y两优689品种的排序为第1、第2和第3，浙两优274、春江糯6号和秀水121的排序为第16、第17和第18。可以基本确定甬籼15、晶两优534、春优927和Y两优689品种为抗盐品种，浙两优274、春江糯6号和秀水121为盐敏感品种。并且在不同盐浓度下，水稻的耐盐性存在细微差别。
表4 水稻种子在不同浓度盐胁迫下的发芽和幼苗生长指标
RGE：相对发芽势；RGP：相对发芽率；RSP：相对成苗率；RGI：相对发芽指数；RVI：相对活力指数；RMGT：相对平均发芽时间；RFW：相对鲜重；RDW：相对干重。
实施例2 籼稻和粳稻品种耐盐性筛选
具体筛选方法如下：
(1)取18种待筛选的水稻种子(即：钱优1号、领优华占、内5优8015、晶两优534、株两优06、Y两优689、梦两优华占、浙两优274、嘉早丰18、甬籼15、春优84、春优927、嘉丰优2号、嘉优5号、甬优10号、春江糯6号、秀水121和嘉58)，将水稻种子分别置于铺有三层经0(清水)、150或200mM盐水湿润的发芽纸上进行发芽试验，4次重复，每重复100粒种子。种子置于30℃(16小时黑暗)/20℃(8小时光照)培养箱中，光照强度为250μmol·m-2·s-1。再计算水稻种子在不同盐浓度下各生长指标值与零盐浓度下各生长指标值的差值，即为校正生长指标值；
以种子胚根突破种皮为发芽标准，每天记录发芽数。发芽第5天统计发芽势，第14天统计发芽率和幼苗率。统计发芽率时，随机选择40株幼苗测定鲜重，随后将样品置于80℃烘箱中保持24小时，取出后放干燥器冷却后测定其干重。最后计算发芽指数，活力指数和平均发芽时间。
其中发芽势(GE，％)＝(5天内种子发芽数/受检种子数)×100％；
发芽率(GP，％)＝(14天内种子发芽数/受检种子数)×100％；
正常幼苗率(SP，％)＝(第14天健壮幼苗数/受检种子数)×100％；
发芽指数(GI)＝∑(Gt/Dt)，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数；
活力指数(VI)＝GI×DW，式中，GI为发芽指数，DW为干重；
平均发芽时间(MGT，天)＝∑(Gt×Tt)/∑Gt，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数。
根据校正生长指标值，采用隶属函数计算得到样本集内各水稻种子各生长指标的隶属函数值；
隶属函数的公式为：R(Xj.i)＝(Xj.i-Xj.min)/(Xj.max-Xj.min)；
其中，Xj.i表示第i个品种第j个生长指标的校正生长指标值；Xj.min表示第j个生长指标的校正生长指标值的最小值；Xj.max表示第j个生长指标的校正生长指标值的最大值；R(Xj.i)表示第i个品种第j个生长指标的隶属函数值。
结果如实施例1所示。
(2)将18个水稻品种按照籼稻、籼粳和粳稻进行分类，其中籼稻：钱优1号、领优华占、内5优8015、晶两优534、株两优06、Y两优689、梦两优华占、浙两优274、嘉早丰18、甬籼15；籼粳：春优84、春优927、嘉丰优2号；粳稻：嘉优5号、甬优10号、春江糯6号、秀水121、嘉58；获得不同类别的样本集(籼稻、籼粳和粳稻)；
(3)根据步骤(1)所述的校正生长指标值进行相关性分析，剔除相关性小的生长指标，得到各样本集内的相关性生长指标；再根据步骤(1)所述的校正生长指标值，对各样本集内的各相关性生长指标进行主成分分析，得到各样本集内各相关性生长指标的权重系数；采用SPSS软件进行主成分分析，并计算归一化权重系数。
相关性分析的结果如表5所示。
表5 耐盐指标间的相关系数
*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平上的显著性。RGE：相对发芽势；RGP：相对发芽率；RSP：相对成苗率；RGI：相对发芽指数；RVI：相对活力指数；RMGT：相对平均发芽时间；RFW：相对鲜重；RDW：相对干重。
表5的结果显示，籼稻在150mM盐浓度下，GI和MGT与其他指标相关性均不高，剔除这2个数据；200mM盐浓度下，MGT与其他指标相关性均不高，剔除这1个数据。籼粳稻在150和200mM盐浓度下，各个指标间均具有相关性，全部保留。粳稻在150mM盐浓度下，各个指标间均具有相关性，全部保留；200mM盐浓度下，MGT与其他指标相关性均不高，剔除这1个数据。
采用主成分分析确定具有相关性的各个指标的权重。采用SPSS软件进行主成分分析，并计算归一化权重系数。主成分分析结果显示籼稻在150和200mM盐浓度下，指标只存在1个主成分，累积贡献率分别达到77.713％和81.168％。籼粳稻在150和200mM盐浓度下，指标均存在2个主成分，累积贡献率均达到100.000％。粳稻在150和200mM盐浓度下，指标均存在2个主成分，累积贡献率均达到90.643％和91.246％。
各指标权重系数＝该指标得分系数/各个指标得分系数之和，其中该指标得分系数＝具有kaiser标准化的正交旋转法构成得分/各个指标得分之和的平方根。籼稻在150和200mM盐浓度下，VI的权重较高，分别为0.180和0.219。籼粳在150和200mM盐浓度下，GP的权重较高，分别为0.202和0.163。粳稻在150和200mM盐浓度下，FW的权重较高，分别为0.195和0.412(表6)。
表6 盐胁迫各指标的权重和贡献率
(4)将步骤(3)的权重系数与相对应的各水稻种子各相关性生长指标的隶属函数值相乘，得到各水稻种子各相关性生长指标的修正隶属函数值；再计算各水稻种子所有相关性生长指标的修正隶属函数值的平均值，得到排序参考值；
结合隶属函数结果与对应指标的权重，得到新的隶属函数值排序表(见表7)。
表7 18个水稻品种耐盐系数权重排序
RGE：相对发芽势；RGP：相对发芽率；RGI：相对发芽指数；RVI：相对活力指数；RDW：相对干重。
(5)根据所述排序参考值对各水稻种子进行耐盐性排序，根据耐盐性排序的结果，选择排序靠前的水稻种子，即为发芽期耐盐性好的水稻种子。
根据150mM盐浓度下指标隶属函数值的综合排序结果，甬籼15和晶两优534的排序为第1和第2，浙两优274和春江糯6号的排序为第17和第18，而200mM盐浓度下的综合排序结果显示，甬籼15和晶两优534品种的排序为第1和第2，浙两优274和秀水121的排序为第17和第18，而此时春江糯6号的排序为第14。可以基本确定甬籼15和晶两优534为抗盐品种，浙两优274、春江糯6号和秀水121为盐敏感品种。并且在不同盐浓度下，水稻的耐盐性存在细微差别。
实施例3 杂交稻和常规稻品种耐盐性筛选
具体筛选方法如下：
(1)取18种待筛选的水稻种子(即：钱优1号、领优华占、内5优8015、晶两优534、株两优06、Y两优689、梦两优华占、浙两优274、嘉早丰18、甬籼15、春优84、春优927、嘉丰优2号、嘉优5号、甬优10号、春江糯6号、秀水121和嘉58)，将水稻种子分别置于铺有三层经0(清水)、150或200mM盐水湿润的发芽纸上进行发芽试验，4次重复，每重复100粒种子。种子置于30℃(16小时黑暗)/20℃(8小时光照)培养箱中，光照强度为250μmol·m-2·s-1。再计算水稻种子在不同盐浓度下各生长指标值与零盐浓度下各生长指标值的差值，即为校正生长指标值；
以种子胚根突破种皮为发芽标准，每天记录发芽数。发芽第5天统计发芽势，第14天统计发芽率和幼苗率。统计发芽率时，随机选择40株幼苗测定鲜重，随后将样品置于80℃烘箱中保持24小时，取出后放干燥器冷却后测定其干重。最后计算发芽指数，活力指数和平均发芽时间。
其中发芽势(GE，％)＝(5天内种子发芽数/受检种子数)×100％；
发芽率(GP，％)＝(14天内种子发芽数/受检种子数)×100％；
正常幼苗率(SP，％)＝(第14天健壮幼苗数/受检种子数)×100％；
发芽指数(GI)＝∑(Gt/Dt)，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数；
活力指数(VI)＝GI×DW，式中，GI为发芽指数，DW为干重；
平均发芽时间(MGT，天)＝∑(Gt×Tt)/∑Gt，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数。
再根据校正生长指标值，采用隶属函数计算得到样本集内各水稻种子各生长指标的隶属函数值；
隶属函数的公式为：R(Xj.i)＝(Xj.i-Xj.min)/(Xj.max-Xj.min)；
其中，Xj.i表示第i个品种第j个生长指标的校正生长指标值；Xj.min表示第j个生长指标的校正生长指标值的最小值；Xj.max表示第j个生长指标的校正生长指标值的最大值；R(Xj.i)表示第i个品种第j个生长指标的隶属函数值。
结果如实施例1所示。
(2)将18个水稻品种按照杂交稻和常规稻进行分类，其中杂交稻：钱优1号、领优华占、内5优8015、晶两优534、株两优06、Y两优689、梦两优华占、浙两优274、春优84、春优927、嘉丰优2号、嘉优5号、甬优10号；常规稻：嘉早丰18、甬籼15、春江糯6号、秀水121、嘉58。获得不同类别的样本集(杂交稻和常规稻)；
(3)根据步骤(1)的校正生长指标值，对各样本集内的各生长指标进行相关性分析，剔除相关性小的生长指标，得到各样本集内的相关性生长指标；再根据步骤(1)所述的校正生长指标值，对各样本集内的各相关性生长指标进行主成分分析，得到各样本集内各相关性生长指标的权重系数，采用SPSS软件进行主成分分析，并计算归一化权重系数。；
相关性分析的结果如表8所示。
结果显示杂交稻和常规稻在150mM在150和200mM盐浓度下，各个指标间均具有相关性，全部保留。其中常规稻各个指标间的相关性显著高于杂交稻。
表8 耐盐指标间的相关系数
*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平上的显著性。RGE：相对发芽势；RGP：相对发芽率；RSP：相对成苗率；RGI：相对发芽指数；RVI：相对活力指数；RMGT：相对平均发芽时间；RFW：相对鲜重；RDW：相对干重。
采用主成分分析确定具有相关性的各个指标的权重。采用SPSS软件进行主成分分析，并计算归一化权重系数。主成分分析结果显示杂交水稻在150和200mM盐浓度下，指标分别存在3个和2个主成分，累积贡献率分别达到91.161％和81.391％。常规稻在150和200mM盐浓度下，指标均存在1个主成分，累积贡献率分别达到81.470％和86.420％。
各指标权重系数＝该指标得分系数/各个指标得分系数之和，其中该指标得分系数＝具有kaiser标准化的正交旋转法构成得分/各个指标得分之和的平方根。杂交稻在150和200mM盐浓度下，分别是GP和FW的权重较高，分别为0.180和0.173。常规稻在150和200mM盐浓度下，VI的权重较高，分别为0.168和0.170(表9)。
表9 盐胁迫各指标的权重和贡献率
(4)将步骤(3)的权重系数与相对应的各水稻种子各相关性生长指标的隶属函数值相乘，得到各水稻种子各相关性生长指标的修正隶属函数值；再计算各水稻种子所有相关性生长指标的修正隶属函数值的平均值，得到排序参考值；
结合隶属函数结果与对应指标的权重，得到新的隶属函数值排序表(见表10)。
表10 18个水稻品种耐盐系数权重排序
RGE：相对发芽势；RGP：相对发芽率；RGI：相对发芽指数；RVI：相对活力指数；RDW：相对干重。
(5)根据所述排序参考值对各水稻种子进行耐盐性排序，根据耐盐性排序的结果，选择排序靠前的水稻种子，即为发芽期耐盐性好的水稻种子。
根据150mM盐浓度下生长指标隶属函数值的综合排序结果，晶两优534和嘉优5号的排序为第1和第2，秀水121和春江糯6号的排序为第17和第18，而200mM盐浓度下的综合排序结果，晶两优534和嘉丰优2号品种的排序为第1和第2，春江糯6号和秀水121的排序为第17和第18。可以基本确定晶两优534、嘉优5号和嘉丰优2号为抗盐品种，秀水121和春江糯6号为盐敏感品种。在不同盐浓度下，水稻耐盐和盐敏感品种较为一致。
实施例4 糯稻和非糯稻品种耐盐性筛选
(1)取18种待筛选的水稻种子(即：钱优1号、领优华占、内5优8015、晶两优534、株两优06、Y两优689、梦两优华占、浙两优274、嘉早丰18、甬籼15、春优84、春优927、嘉丰优2号、嘉优5号、甬优10号、春江糯6号、秀水121和嘉58)，将水稻种子分别置于铺有三层经0(清水)、150或200mM盐水湿润的发芽纸上进行发芽试验，4次重复，每重复100粒种子。种子置于30℃(16小时黑暗)/20℃(8小时光照)培养箱中，光照强度为250μmol·m-2·s-1。再计算水稻种子在不同盐浓度下各生长指标值与零盐浓度下各生长指标值的差值，即为校正生长指标值；
以种子胚根突破种皮为发芽标准，每天记录发芽数。发芽第5天统计发芽势，第14天统计发芽率和幼苗率。统计发芽率时，随机选择40株幼苗测定鲜重，随后将样品置于80℃烘箱中保持24小时，取出后放干燥器冷却后测定其干重。最后计算发芽指数，活力指数和平均发芽时间。
其中发芽势(GE，％)＝(5天内种子发芽数/受检种子数)×100％；
发芽率(GP，％)＝(14天内种子发芽数/受检种子数)×100％；
正常幼苗率(SP，％)＝(第14天健壮幼苗数/受检种子数)×100％；
发芽指数(GI)＝∑(Gt/Dt)，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数；
活力指数(VI)＝GI×DW，式中，GI为发芽指数，DW为干重；
平均发芽时间(MGT，天)＝∑(Gt×Tt)/∑Gt，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数。
再根据校正生长指标值，采用隶属函数计算得到样本集内各水稻种子各生长指标的隶属函数值；
隶属函数的公式为：R(Xj.i)＝(Xj.i-Xj.min)/(Xj.max-Xj.min)；
其中，Xj.i表示第i个品种第j个生长指标的校正生长指标值；Xj.min表示第j个生长指标的校正生长指标值的最小值；Xj.max表示第j个生长指标的校正生长指标值的最大值；R(Xj.i)表示第i个品种第j个生长指标的隶属函数值。
结果如实施例1所示。
(2)将18个水稻品种按照非糯稻和糯稻进行分类，其中非糯稻：钱优1号、领优华占、内5优8015、晶两优534、株两优06、Y两优689、梦两优华占、浙两优274、春优84、春优927、嘉丰优2号、嘉优5号、嘉早丰18、甬籼15、秀水121、嘉58；糯稻：春江糯6号、甬优10号。获得不同类别的样本集(非糯稻和糯稻)；
(3)根据步骤(1)的校正生长指标值，对各样本集内的各生长指标进行相关性分析，剔除相关性小的生长指标，得到各样本集内的相关性生长指标；再根据步骤(1)所述的校正生长指标值，对各样本集内的各相关性生长指标进行主成分分析，得到各样本集内各相关性生长指标的权重系数；采用SPSS软件进行主成分分析，并计算归一化权重系数。
相关性分析的结果如表11所示。
表11 耐盐指标间的相关系数
*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平上的显著性。RGE：相对发芽势；RGP：相对发芽率；RSP：相对成苗率；RGI：相对发芽指数；RVI：相对活力指数；RMGT：相对平均发芽时间；RFW：相对鲜重；RDW：相对干重。
结果显示，非糯稻在150mM盐浓度下各指标间的相关性不高，其中FW与其他指标相关性均不高，剔除这1个数据；200mM盐浓度下，各个指标间均具有相关性，全部保留。非糯稻的各个指标数据全部保留。
采用主成分分析确定具有相关性的各个指标的权重。主成分分析结果显示非糯稻在150和200mM盐浓度下，指标存在2个主成分，累积贡献率分别达到83.893％和83.908％。糯稻在150和200mM盐浓度下，生长指标存在1个主成分，累积贡献率均达到100.000％。各指标权重系数＝该指标得分系数/各个指标得分系数之和，其中该指标得分系数＝具有kaiser标准化的正交旋转法构成得分/各个指标得分之和的平方根。非糯稻在150和200mM盐浓度下，GP和DW的权重较高，分别为0.200和0.177(表12)。
表12 盐胁迫各指标的权重和贡献率
(4)将步骤(3)的权重系数与相对应的各水稻种子各相关性生长指标的隶属函数值相乘，得到各水稻种子各相关性生长指标的修正隶属函数值；再计算各水稻种子所有相关性生长指标的修正隶属函数值的平均值，得到排序参考值；
结合隶属函数结果与对应指标的权重，得到新的隶属函数值排序表(见表13)。
表13 18个水稻品种耐盐系数权重排序
RGE：相对发芽势；RGP：相对发芽率；RGI：相对发芽指数；RVI：相对活力指数；RDW：相对干重。
根据150mM盐浓度下生长指标隶属函数值的综合排序结果，甬籼15和嘉早丰18品种的排序为第1和第2，甬优10号和春江糯6号的排序为第17和第18，而200mM盐浓度下的综合排序结果，甬籼15和晶两优534品种的排序为第1和第2，甬优10号和春江糯6号的排序为第17和第18。可以基本确定甬籼15，晶两优534和嘉早丰18为抗盐品种，甬优10号和春江糯6号为盐敏感品种。在不同盐浓度下，水稻的耐盐性存在细微差别。
实施例5 综合分析不同类型水稻品种耐盐性分析
综合对比水稻按不同类型进行耐盐性分析，结果显示不同分类分析后耐盐和盐敏感品种的筛选结果略有差异。不同分类方式分析下，150mM盐浓度下耐盐品种甬籼15和晶两优534出现频次最高，盐敏感品种春江糯6号出现频次最高；在200mM盐浓度下，甬籼15和晶两优534出现频次最高，盐敏感品种春江糯6号和秀水121出现频次最高。综合而言，可以确定甬籼15和晶两优534为耐盐品种，春江糯6号为盐敏感品种。除此之外，不同分类方式分析下预测指标也存在差异。按照籼稻、籼粳稻和粳稻这类分析方法得到的预测指标与综合排序之间的相关性最高，均超过90％，更具有可靠性。
表14 不同类型水稻耐盐性分析
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