一种brd4蛋白抑制剂及其应用
阅读说明：本技术 一种brd4蛋白抑制剂及其应用 (BRD4 protein inhibitor and application thereof ) 是由 郭夫江 李医明 石莺莺 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种BRD4蛋白抑制剂及其应用,所述的BRD4蛋白抑制剂是具有式I所示化合物或/和其药学上可接受的盐：其中：R-(1)为烷氧基；R-(2)为羟基或4-甲基哌嗪羧酸酯基；R-(3)为氢或羟基；R-(4)为异戊烯基或饱和烷基。实验证明：本发明所述的BRD4蛋白抑制剂可显著抑制BRD4蛋白活性,可望应用于制备预防或/和治疗癌症的药物,尤其可应用于制备预防或/和治疗非小细胞肺癌的药物,具有显著药用前景。(The invention discloses a BRD4 protein inhibitor and application thereof, wherein the BRD4 protein inhibitor is a compound shown in a formula I or/and pharmaceutically acceptable salt thereof: wherein: r 1 Is an alkoxy group; r 2 Is hydroxyl or 4-methylpiperazine carboxylate; r 3 Is hydrogen or hydroxy; r 4 Is isopentenyl or saturated alkyl. Experiments prove that: the BRD4 protein inhibitor can obviously inhibit the activity of BRD4 protein, is expected to be applied to the preparation of medicaments for preventing or/and treating cancers, particularly to the preparation of medicaments for preventing or/and treating non-small cell lung cancer, and has obvious medicinal prospect.)
技术领域
本发明是涉及一种BRD4蛋白抑制剂及其应用，属于化学医药技术领域。
背景技术
BRD4蛋白是一种广泛表达的核蛋白，分子量为200kDa，含有两个串联的溴结构域(BD1和BD2)，在结构上是保守的但具有不相同的功能和一个ET结构域。现有研究显示，BRD4蛋白除了能够通过与组蛋白的乙酰化赖氨酸结合进而调节细胞周期和生长之外，还具有一定的激酶活性，且能参与致癌基因重排，导致高度致癌融合蛋白，从而在许多类型的癌症的发展中起着关键的作用。BRD4蛋白在肿瘤尤其是其在难治性肿瘤、炎症、HIV潜伏中的重要作用，已使其日益成为表观遗传领域的重要靶标之一。以BRD4蛋白为靶标，寻找选择性好、安全、高效的小分子化合物，以治疗肿瘤、炎症、艾滋病、心血管等疾病，是当前研究的热点。通过小分子化合物，干扰BRD4蛋白溴结构域，实现对肿瘤、炎症、艾滋病等疾病的靶向治疗，具有广阔的开发应用前景。目前，已报道的BRD4蛋白抑制剂JQ1和IBET151，能够有效阻断溴结构域介导的乙酰化调控，抑制多种癌症的发生发展。也有少量溴结构域蛋白抑制剂如OTX-015和RVX-208已进入临床研究阶段。然而，目前发现的BRD4蛋白抑制剂并不多，迫切需要寻找更多的BRD4抑制剂，以为癌症的治疗提供新选择。
另外，在各种癌症中，肺癌是在全世界范围内发病率及死亡率最高且治疗效果相对较差的一种恶性肿瘤。世界卫生组织公布，全球近六分之一的死亡由癌症造成。在2015年癌症造成的880万死亡案例中，肺癌的死亡占据第一，为169万。近年来，大气环境污染严重，雾霾天气长期盘踞在中国大部分地区，肺癌的发病人数呈现了快速增长的趋势，由于其高致死率，肺癌的预防和治疗显得愈为重要。目前，肺癌的治疗以西医治疗为主，治疗手段主要是外科手术、放化疗及靶向治疗，但其总的治愈率较低。化放疗作为晚期肺癌最主要的治疗手段，其疗效已进入平台期，且具有显著的毒副作用。新近发展起来的靶向治疗适应人群较窄。因此，研究和开发新的肺癌治疗技术和方法也势在必行。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一种BRD4蛋白抑制剂及其应用，为预防和/或治疗癌症尤其是肺癌筛选一类新的药物。
本发明所述的BRD4蛋白抑制剂，是具有式I所示化合物或/和其药学上可接受的盐：
其中：
R1为烷氧基；R2为羟基或4-甲基哌嗪羧酸酯基；R3为氢或羟基；R4为异戊烯基或饱和烷基。
一种优选方案，R1为C1～C4的烷氧基；R2为羟基或4-甲基哌嗪羧酸酯基；R3为氢或羟基；R4为异戊烯基或C1～C10的饱和烷基。
进一步优选方案，R1为甲氧基或乙氧基；R2为羟基或4-甲基哌嗪羧酸酯基；R3为氢；R4为异戊烯基。
一种优选方案，所述药学上可接受的盐为式I所示化合物与酸或碱形成的加成盐。
一种优选方案，所述的BRD4蛋白抑制剂具有如下化学结构式：
一种实施方案，式A化合物的制备包括如下反应路线中的步骤a至步骤d，式B化合物的制备包括如下反应路线中的步骤a至步骤f：
所述的BRD4蛋白抑制剂的一种应用，是用于制备预防或/和治疗癌症的药物。
一种优选方案，所述的BRD4蛋白抑制剂用于制备预防或/和治疗肺癌的药物。
进一步优选方案，所述的肺癌为非小细胞肺癌。
另外，本发明所述的药物可采用各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。
本发明所述药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都可以，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。
本发明所述药物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体以及各种制剂所必要的辅料等。例如，所述药物为口服剂型时，可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明的研究结果显示：本发明所述的式Ⅰ化合物或/和其药学上可接受的盐可显著抑制BRD4蛋白活性，可作为BRD4蛋白抑制剂的有效成分，可望应用于制备预防或/和治疗癌症的药物，尤其可应用于制备预防或/和治疗非小细胞肺癌的药物，具有显著药用前景。
附图说明
图1体现了式A化合物对非小细胞肺癌细胞克隆形成的影响；
图2体现了式A化合物对siRNA BRD4蛋白的影响；
图3体现了式A化合物对BRD4蛋白过表达的影响，图中的JQ1为阳性对照药，图中的A为本发明所述的式A化合物；
图4体现了式A和式B化合物对A549荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用；
图5体现了式A和式B化合物的给药浓度对荷瘤裸鼠肿瘤大小的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
采用如下反应路线中的步骤a至步骤d制备式A化合物，采用如下反应路线中的步骤a至步骤f制备式B化合物：
其中：
中间体2的合成工艺如下：
将化合物1溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，于0℃下加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(1当量)后反应1小时，反应完毕，用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩和硅胶柱层析纯化，所得浅黄色固体即为中间体2化合物，产率为98％。
中间体3的合成工艺如下：
将化合物2(1当量)溶于DMF中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.2当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.2当量)后于室温下搅拌30min，然后加入氨水(3当量)，再于室温下反应1h，反应完毕，用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩和硅胶柱层析纯化，所得白色固体即为中间体3化合物，产率为90％。
中间体4的合成工艺如下：
将化合物3(1当量)溶于DMF中，加入4-羟基苯甲醛(1.2当量)和对甲苯磺酸一水合物(0.2当量)，于室温搅拌至TLC检测显示原料反应完全(约搅拌1小时后)，加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩和硅胶柱层析纯化，所得白色固体即为中间体4化合物，产率为94％。
中间体5(即：式A化合物)的合成工艺如下：
将化合物4(1当量)溶于DMF中，加入少量水(DMF:H2O＝10:1)，然后加入3-甲基-2-丁烯基硼酸频那醇(1.2当量)、Cs2CO3(2当量)和Pd(dppf)2Cl2(0.1当量)，于氩气保护下在80℃反应3h，反应完毕，过滤，滤液用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩和硅胶柱层析纯化，所得白色固体即为中间体5，即：式A化合物，产率为68％。
中间体6的合成工艺如下：
将化合物5(1当量)溶于丙酮中，然后加入4-甲基哌嗪-1-甲酰氯盐酸盐(3当量)和K2CO3(5当量)，再于60℃下反应3h，加入少量水，再反应3h，反应完毕，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩和硅胶柱层析纯化，所得得白色固体即为中间体6化合物，产率为80％。
中间体7(即：式B化合物)的合成工艺如下：
将化合物6溶于干燥DCM中，然后加入HCL溶液(4mol/L，在1,4-二氧六环中)，于室温下反应2h，有固体析出，反应完毕后，旋干所得固体即为中间体7，即：式B化合物，产率为100％。
实施例2
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT，即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，是活细胞代谢物还原剂。
本实施例利用MTT法检测式A化合物和式B化合物对肺癌细胞的影响，实验所用肺癌细胞为A549、HCC827、H1975和H460细胞株。
(1)肺癌细胞培养
A549、HCC827、H1975和H460细胞株(用含10％小牛血清及1％双抗的RIPA-1640培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养。取对数生长期的肺癌细胞铺板，细胞密度为1×104个/mL铺板于96孔板中。
(2)加药干预
24h后，加入用完全培养基稀释的不同浓度梯度(0.01、0.1、0.3、1、3.125、6.25、12.5、25、50、100μM)的式A化合物/式B化合物分别进行干预。
(3)细胞处理
1)分别于48h和72h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT，置于培养箱中继续培养4h。
2)小心吸走孔内培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶解结晶。置于酶标仪中振荡均匀，并测定在550nm及630nm波长处吸光度的差值(OD)，计算细胞存活率，即：细胞存活率＝[(用药组孔平均OD值-空白调零孔平均OD值)/(对照组孔平均OD值-空白调零孔平均OD值)]×100％。
(4)数据分析
数据分析处理应用Grapad Prism 7.00软件，计量资料均采用X±SE表示，n代表样本数，多组资料之间差异比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两组间比较采用t检验；P<0.05为有显著统计学差异，P<0.01为极显著统计学差异。
(5)实验结果
由最终结果得知，本发明所述的式A和式B化合物均可显著抑制四株非小细胞肺癌细胞的存活率。式A化合物对四株细胞的具体影响可见表1所示，式B化合物对四株细胞的具体影响可见表2所示。
表1式A化合物对四株细胞的半数有效抑制浓度(IC50值，μM)
表2式B化合物对四株细胞的半数有效抑制浓度(IC50值，μM)
由表1和表2所示结果可见：本发明所述的式A化合物和式B化合物均能明显抑制非小细胞肺癌细胞的存活率，且效果显著。
实施例3
本实施例考察式A化合物对肺癌细胞克隆形成的影响：
(1)克隆形成实验
取生长状态良好的肺癌细胞于每孔400个细胞铺于6孔板中过夜，待细胞贴壁后加药干预24h，之后弃去含有药液的培养液，加入完全培养基继续培养约9天，再用20％的多聚甲醛固定30分钟后用PBS洗三遍，之后用0.04％的结晶紫固定染色约2分种，用PBS洗去结晶紫，计数并计算克隆形成的抑制率，详细结果请见图1所示，由图1所示结果可见：本发明所述的式A化合物对A549细胞、H1975细胞和H460细胞的长期增殖作用均具有明显抑制效果，且当式A化合物的给药浓度为3μM时，对A549细胞、H1975细胞和H460细胞的克隆形成抑制率均接近100％。
实施例4
本实施例考察式A化合物对siRNA BRD4蛋白的影响：
(1)实验方法
①构建BRD4(h)-siRNA序列
引物名称
引物序列5’to 3’
Primer-F
GCGGGAGCAGGAGCGAAGC
Primer-R
UCUUCGCUCCUGCUCCCGC
②将siRNA配成2.5nmol/L每管，然后将A549细胞接种于6孔板中，24h后细胞约张至80％；
③用200μL Opti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为50nM)，加入2μL/孔，轻轻吹打3-5次混匀；
④用200μL Opti-MEM稀释转染试剂lipofectamineTM2000以5μL/孔，轻轻吹3-5次混匀，室温静置5min；
⑤混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹3-5次混匀，室温静置18-20min；
⑥转染4-6h后更换新鲜培养基；
⑦转染完成后加入药物24h后通过蛋白检测；
(2)实验结果
图2体现了式A化合物对BRD4 siRNA的影响，实验细胞为人肺癌细胞A549，转染48h后加1μM D36干预24h。NC为阴性对照，H3和GAPDH均作为内参，敲减GAPDH为阳性对照。由图2所示结果可见：BRD4敲减和联合1μM式A化合物，siRNA BRD4可以显著降低BRD4蛋白，联合式A化合物后也是显著降低，说明本发明所述的式A化合物不为BRD4激动剂。
实施例5
本实施例考察式A化合物对BRD4蛋白过表达的影响：
(1)构建过表达慢病毒载体质粒
首先设计引物将目的基因片段从原质粒上扩增下来，再通过引物两端所含无缝克隆识别位点将其重组到酶切后的过表达载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的过表达质粒。
(2)转染步骤
①将已经长好的细胞以合适的比例传代到培养皿中，当第二天细胞长至70％-80％时准备转染；
②将2μg转染级质粒DNA用250μL的无血清培养基稀释，并混合均匀；
③吸取5.0μL的Fugene HD转染试剂加入混合好的DNA稀释液中，混合均匀，室温静置20min，得到核酸-转染试剂复合物；
④将制备好的核酸-转染试剂复合物加入到含细胞核完全培养基的培养孔中，水平方向上下左右轻轻晃动培养板，使其混合均匀；
⑤放置于培养箱中，24h后换液，继续培养48h，并加入药物干预后加入嘌呤霉素盐酸盐(Puromycin dihydrochloride)筛选24h；
⑥提蛋白检测。
(3)实验结果
图3体现了式A化合物对BRD4蛋白过表达的影响，图中的JQ1为阳性对照药，图中的A为本发明所述的式A化合物。由图3所示结果可见：JQ1 1μM和式A化合物1μM均可以显著降低BRD4蛋白，说明式A化合物为BRD4蛋白抑制剂。
实施例6
本实施例考察式A化合物和式B化合物对BALB/c-nu小鼠肿瘤生长的影响：
BALB/c-nu小鼠A549细胞皮下注射造模，分别经吉非替尼灌胃20mg/kg/d、式A化合物灌胃50mg/kg/d、式A化合物灌胃20mg/kg/d、式B化合物腹腔注射20mg/kg/d或、式B化合物腹腔注射5mg/kg/d，均作用16天，然后测肿瘤体积。
数据为mean±SE，n＝8。*P<0.05；**P<0.01。
BALB/c-nu小鼠属于先天性无胸腺裸小鼠，T淋巴细胞功能缺陷，B淋巴细胞功能一般正常，NK细胞活力正常，抵抗力差。
(1)BALB/c-nu小鼠的饲养
BALB/c-nu小鼠饲养于屏障系统小鼠实验饲养室(温度：22～23℃，湿度：50～70％，工作照度：150～300Lx，动物照度：15～20Lx，噪声标准<60dB)。
(2)肿瘤细胞悬液的制备
①取出A549细胞，吸取培养基，用PBS 2mL洗两遍，在加入胰酶2mL消化3min后，加入4mL完全培养基中止消化，吹打均匀后放入离心管离心；
②放入离心机中以1000rpm转速离心5min，弃去上清液，合并细胞，用双无培养基重悬；
③细胞计数，取10μL细胞与10μL台盘蓝混合，打入计数板计数，使细胞密度达到107cells/0.1mL；
④与基质胶等比例混合，吹匀置于冰上。
(3)裸鼠接种肿瘤
①将细胞及所用物品紫外灭菌30min；
②吹打细胞使细胞悬液均匀；
③取出裸鼠，用注射针吸取0.1mL进行肿瘤接种；先用75％乙醇擦小鼠注射部位，然后进行皮下注射。
(4)实验分组及给药
接种后，约5-6天，将裸鼠分组；分组按照肿瘤的大小平均分布，分为6组；
给药方式：灌胃/腹腔注射；
给药剂量：每只裸鼠注射0.1mL。
(5)裸鼠肿瘤的处理
从动物房取出裸鼠，将裸鼠脱颈椎处死，剥离肿瘤，按肿瘤大小进行排列拍照。
(6)肿瘤体积及抑瘤率
肿瘤体积V＝π*长*宽*高/6；
抑瘤率(％)＝[(阴性对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]*100％。
(7)实验结果
实验中，每天每只裸鼠给药0.12mL，利用游标卡尺测量肿瘤的生长情况。利用公式V＝π*肿瘤长*肿瘤宽*肿瘤高/6，如此21天，根据所记录的数据，制得的裸鼠肿瘤的生长曲线如图4所示，由图4可见：式A化合物和式B化合物给药组的A549荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线与比较组相比，肿瘤生长情况明显较缓慢，且在第9天有统计学意义。
经过16天给药后，脱颈椎处死裸鼠，剥离肿瘤，按照实体肿瘤体积由大到小的排列顺序摆放，拍照，得到图5所示图片，由图5可见：式A化合物和式B化合物给药组的肿瘤体积明显小于未给药的对照组。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。