基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体及其构建方法和应用 (Banana MaACO1 gene editing vector based on CRISPR/Cas9 and construction method and application thereof ) 是由 毕方铖 胡春华 杨乔松 窦同心 盛鸥 邓贵明 董涛 易干军 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体及其构建方法和应用,针对香蕉基因序列,设计基因编辑靶位点及其引物,以及在构建香蕉MaACO1基因编辑载体时结合特定的扩增程序,构建得到合理的sgRNA表达框,提供了一种有效且稳定的定向突变香蕉ACO1基因的编辑方法,从而使得香蕉的ACO1表达缺失或减弱。延缓了香蕉的后熟过程,可以明显的延长香蕉的保鲜期的效果,解决了采后香蕉在常温下成熟过快、不耐贮的问题。(The invention provides a banana MaACO1 gene editing vector based on CRISPR/Cas9, a construction method and application thereof, wherein a gene editing target site and a primer thereof are designed aiming at a banana gene sequence, and a reasonable sgRNA expression frame is constructed by combining a specific amplification program when the banana MaACO1 gene editing vector is constructed, so that an effective and stable editing method for directionally mutating banana ACO1 gene is provided, and the banana ACO1 expression is deleted or weakened. The postripeness process of the bananas is delayed, the effect of prolonging the fresh-keeping period of the bananas can be obvious, and the problems that the picked bananas are too fast to mature and not storable at normal temperature are solved.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体及其构建方法和应用。
背景技术
基因组编辑是指利用序列特异核酸酶对基因组进行定点改造，获得预期的生物体基因组序列发生改变的技术。是近年发展起来的一种基因组定向编辑的技术，其可以进行定点的突变(插入、缺失或修饰等)，具有成本低，操作简单和突变效率高等特点。
采后损失问题是目前香蕉产业面临的几大主要问题之一，据估计香蕉采后损失可达20-30％，这很大部分是由于香蕉在常温下成熟过快、不耐贮、运货架期短引起的，且香蕉在乙烯催熟后一周迅速成熟腐烂，造成巨大的损失。在过去，一般通过表达分析、RNAi等生物学手段来研究基因的功能，RNAi的方式抑制ACO基因的表达，从而减少乙烯的合成、延缓果实的成熟，但这些方法不能完全抑制ACO基因在香蕉中的转录、抑制效率较低，且其存在转基因生物安全的问题，不能很好的解决采后香蕉在常温下成熟过快、不耐贮的问题。因此，有必要寻找一种减少香蕉乙烯合成、延缓香蕉成熟的方法，以解决采后香蕉在常温下成熟过快、不耐贮的问题。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体及其构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种sgRNA表达盒，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
一种基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体的构建方法，包括以下步骤：
S1.以pYLgRNA-OsU6b质粒为模板，由核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的引物，扩增得到OsU6b启动子；以pYLgRNA-OsU6b质粒为模板，由核苷酸序列如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示的引物，扩增得到含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的靶位点的gRNA片段；
S2.由核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物，以所述OsU6b启动子和所述gRNA片段为模板，扩增得到获得sgRNA表达盒；
S3.将sgRNA表达盒插入pYLCRISPR/Cas9质粒。
在其中一些实施例中，步骤S1中所述的扩增得到OsU6b-gRNA表达框的扩增程序为：94±3℃10±1s，58±2℃15±1s，68±2℃20±1s，20-30循环；及/或步骤S2中所述的扩增得到获得sgRNA表达盒的扩增程序为：95±3℃10±1s，58±2℃15±1s，68±2℃20±1s，15-25循环。
本发明还提供一种基因编辑载体，具体技术方案如下：
所述基因编辑载体为含有如上所述sgRNA表达盒的载体；
或所述基因编辑在载体为如上所述的基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体的构建方法制备得到的香蕉MaACO1基因编辑载体。
本发明还提供一种工程菌，具体技术方案如下：
一种工程菌，所述工程菌为含有如上所述的sgRNA表达盒的细菌或含有如上所述的香蕉MaACO1基因编辑载体的细菌。
在其中一些实施例中，所述细菌为农杆菌EHA105。
本发明还提供一种试剂盒，具体技术方案如下：
一种基因定点突变试剂盒，包含以下至少一种组分：所述的sgRNA表达盒、如上所述的引物、如上所述的香蕉MaACO1基因编辑载体和如上所述的工程菌。
本发明还提供一种香蕉MaACO1基因的定点突变方法，具体技术方案如下：
一种香蕉MaACO1基因的定点突变方法，包括以下步骤：使用如上所述的工程菌，以香蕉为受体材料，进行香蕉遗传转化，获得MaACO1基因的定点突变的香蕉阳性植株。
本发明还提供一种新应用，具体技术方案如下：
如上所述的sgRNA表达盒、香蕉MaACO1基因编辑载体、引物、工程菌、基因定点突变试剂盒或香蕉MaACO1基因的定点突变方法在延缓香蕉成熟中的应用。
本发明还提供一种香蕉，具体技术方案如下：
一种耐贮存香蕉，所述香蕉由如上所述的香蕉MaACO1基因的定点突变方法制备得到。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明针对香蕉基因序列，设计得到基因编辑靶位点及其引物，并在构建香蕉MaACO1基因编辑载体时结合特定的扩增程序，构建得到合理的sgRNA表达框，提供了一种有效且稳定的定向突变香蕉ACO1基因的编辑方法，从而使得香蕉的ACO1表达缺失或减弱。
进一步地，通过构建上述基因编辑载体，应用于香蕉MaACO1基因定点突变，能够稳定遗传的香蕉突变体植株，使得该香蕉突变体植株的乙烯生物合成的关键酶不表达或低表达，抑制/阻断了香蕉乙烯合成途径，使乙烯的合成大量减少，实现果实成熟明显减缓，延缓香蕉的后熟过程，可以明显的延长香蕉的保鲜期的效果，解决了采后香蕉在常温下成熟过快、不耐贮的问题。
附图说明
图1为MaACO1基因结构及靶位点选择；
图2为pYLgRNA-OsU6b质粒图谱；
图3为pYLCRISPR/Cas9质粒图谱；
图4为构建好的基因编辑载体示意图；
图5为常温条件下基因编辑香蕉与野生型香蕉的成熟表型对比图；
图6为乙烯利催熟条件下基因编辑香蕉与野生型香蕉的成熟表型对比图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一种基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体的构建方法，包括以下步骤：
S1.以pYLgRNA-OsU6b质粒为模板，由核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的引物，扩增得到OsU6b启动子；以pYLgRNA-OsU6b质粒为模板，由核苷酸序列如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示的引物，扩增得到含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的靶位点的gRNA片段；
S2.由核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物，以所述OsU6b启动子和所述gRNA片段为模板，扩增得到获得sgRNA表达盒；
S3.将sgRNA表达盒插入pYLCRISPR/Cas9质粒。
优选地，所述OsU6b-gRNA表达框中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的靶位点。
在其中一些实施例中，步骤S1中所述的扩增得到OsU6b-gRNA表达框的扩增程序为：94±3℃10±1s，58±2℃15±1s，68±2℃20±1s，20-30循环。优选为94±2℃10±0.5s，58±1℃15±0.5s，68±1℃20±0.5s，22-28循环。更优选为94℃10s，58℃15s，68℃20s，25-28循环。
更优选地，步骤S1中所述的扩增中，pYLgRNA-OsU6b质粒为1-6ng；优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的引物各0.15-0.25μg；优选的，核苷酸如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示的引物各0.05-0.15μg。
在其中一些实施例中，步骤S2中所述的扩增得到获得sgRNA表达盒的扩增程序为：95±3℃10±1s，58±2℃15±1s，68±2℃20±1s，15-25循环。优选为95±2℃10±0.5s，58±1℃15±0.5s，68±1℃20±0.5s，15-22循环。更优选为95℃10s，58℃15s，68℃20s,17-20循环。
优选地，步骤S3中所述的将sgRNA表达盒插入pYLCRISPR/Cas9质粒时，sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9质粒通过Bsa I-HF酶切，然后用T4 DNA连接酶连接。
本发明所述的香蕉MaACO1基因编辑载体由基于CRISPR/Cas9的香蕉MaACO1基因编辑载体的构建方法制备得到。
本发明所述的一种工程菌，为含有如上所述的香蕉MaACO1基因编辑载体的细菌。
优选地，所述工程菌为含有如上所述的香蕉MaACO1基因编辑载体的农杆菌EHA105。
优选地，所述工程菌的制备方法包括：将sgRNA表达盒插入pYLCRISPR/Cas9质粒后，热击转化E.coli DH10B感受态细胞，培养后采用含有Kan和IPTG的培养基筛选阳性克隆，对阳性克隆提取质粒并测序，将测序正确的质粒电极转化农杆菌EHA105。
优选地，测序时使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
本发明所述的一种香蕉MaACO1基因的定点突变方法，包括以下步骤：使用如上所述的工程菌，以香蕉为受体材料，进行香蕉遗传转化，获得MaACO1基因的定点突变的香蕉阳性植株。
优选地，所述香蕉为三倍体巴西蕉Musa acuminata(AAA group,cv.Brazilian)。
优选地，所述香蕉遗传转化，包括：以潮霉素为筛选标记，通过农杆菌共培养、液体筛选及植株再生，获得抗潮霉素的再生植株。
本发明还提供一种香蕉，所述香蕉由如上所述的香蕉MaACO1基因的定点突变方法制备得到。
实施例1香蕉MaACO1基因编辑载体的构建
1、根据香蕉的基因序列，选取MaACO1基因的第二个外显子上的5′-CCTCATGGATGAAGTGGAGAAGG-3′(SEQ ID NO.1)为靶标位点，如图1所示。
2、取2-5ng pYLgRNA-OsU6b质粒(图2，刘耀光老师实验室赠送)为模板，根据靶标位点设计并在一个反应中使用4种引物：U-F和gRTF+各0.2μM，U6bR-和gRTR各0.1μM。25-28循环：94℃10s，58℃15s，68℃20s，用于扩增含靶标位点的gRNA片段和驱动gRNA表达的启动子片段，后期的循环通过overlapping PCR产生2个片段合并的包含靶点的sgRNA表达框片段，即OsU6b-gRNA表达框。
启动子扩增引物如下：
U-F：5′-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3′；SEQ ID NO.2
U6bR-:5′-TCTCCACTTCATCCATGAGGCaacacaagcggcagc-3′；SEQ ID NO.3
gRNA扩增引物如下：
gRTF+：5′-CCTCATGGATGAAGTGGAGAgttttagagctagaaat-3′；SEQ ID NO.4
gRTR:5′-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3′；SEQ ID NO.5
3、将步骤2中第一轮PCR产物，OsU6b启动子和含靶点的gRNA片段，各取1μl用H2O稀释10倍后，取1μl为模板，用1/10量引物PpsF和PgsR的工作液(最终浓度0.15μM)，使用适量高保真PCR酶进行扩增。按如下条件扩增17-20循环：95℃10s，58℃15s，68℃20s。取2-3μl电泳检查产物长度是否符合正确，进一步用PCR产物纯化kit纯化获得含靶点的OsU6b-gRNA表达盒，可以用于进一步的酶切连接。
第二轮PCR引物如下：
PpsF SEQ ID NO.6：
5′-TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3′；
PgsR SEQ ID NO.7：
5′-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3′
OsU6b-gRNA表达框序列(SEQ ID NO.12)如下：
TTCAGAGGTCTCTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGGATGCAAGAACGAACTAAGCCGGACAAAAAAAAAAGGAGCACATATACAAACCGGTTTTATTCATGAATGGTCACGATGGATGATGGGGCTCAGACTTGAGCTACGAGGCCGCAGGCGAGAGAAGCCTAGTGTGCTCTCTGCTTGTTTGGGCCGTAACGGAGGATACGGCCGACGAGCGTGTACTACCGCGCGGGATGCCGCTGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTGGGTCGCGGGAGCGTTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACCGAACAATGAAGAACCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTGCCTCATGGATGAAGTGGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGATACGCGTcggtCGAGACCCACGCT
4、按如下体系进行酶切与连接的反应
试剂
加入量(μl)
终浓度
来源/厂家
10×CutSmart Buffer
1.5
1×
New England Biolabs,Inc
10mM ATP
1.5
1mM
TaKaRa
pYLCRISPR/Cas9质粒
60-80ng
4-6ng/μl
刘耀光老师实验室赠送(图3)
OsU6b-sgRNA表达盒
10-15ng
PCR扩增
Bsa I-HF
10U
0.1-0.2U/μl
New England Biolabs,Inc
T4 DNA ligase
35U
2-3U/μl
New England Biolabs,Inc
ddH<sub>2</sub>O
最终15μl
自制
用变温循环进行酶切连接约10-15循环：37℃5min；10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。将OsU6b-sgRNA表达盒插入pYLCRISPR/Cas9质粒，得连接产物。
5、取1-1.5μl步骤4中制备得到的连接产物热击转化E.coli DH10B感受态细胞，热击激后加入1ml LB培养基，37℃培养1-1.5h。涂板培养基为LB+50μg/ml Kan,0.3～0.5mMIPTG。其中，ccdBs是pYLCRISPR/Cas9质粒中的一个致死基因，只有成功将ccdB切除并且连接上目的片段的质粒转化的菌株可以生长：当sgRNA表达盒成功插入pYLCRISPR/Cas9质粒时，说明成功切除质粒上的ccdBs基因，转化菌株可以生长；当sgRNA表达盒未成功插入pYLCRISPR/Cas9质粒时，ccdBs基因没有被切除，IPTG诱导没有彻底切除ccdBs的空载质粒转化子的ccdBs表达致死。而含有目标插入序列(OsU6b-gRNA表达框)的阳性克隆可以在含抗生素的平板上生长。
6、提取质粒，利用测序引物F：5′-GCGGTGTCATCTATGTTACTA-3′(SEQ ID NO.8)和测序引物R：5′-GGCTGTATCTACGTTATTGAAG-3′(SEQ ID NO.9)对OsU6b-gRNA表达框的序列进行确认。
7、将测序确认正确的质粒电击转化农杆菌(EHA105)。从农杆菌克隆中提取质粒，取约5-10ng质粒为模板，用扩增启动子和扩增gRNA的引物进行PCR确认，所构建好的载体如图4所示。
实施例2、香蕉MaACO1基因敲除株系的获得与鉴定
1、以实施例1中构建的确认为阳性农杆菌(EHA105)为基础，以课题组保存的三倍体巴西蕉Musa acuminata(AAA group,cv.Brazilian)悬浮系为受体材料，进行农杆菌介导的香蕉遗传转化实验，以潮霉素为筛选标记，通过农杆菌共培养、液体筛选及植株再生等过程，获得抗潮霉素的再生植株。
2、阳性株系的PCR鉴定：获得再生植株后，提取各再生植株的基因组DNA，设计引物扩增潮霉素抗性基因，挑选表达框已转入的阳性植株。
3、选择两株阳性植株，在编辑靶点上下游分别设计引物，引物序列如下：
MaACO1F：5′-GAAGGGAGAGAGGAGAAG-3′，SEQ ID NO.10
MaACO1R：5′-CAAGAAACGAAACGATGAG-3′，SEQ ID NO.11
通过PCR扩增阳性植株的靶标区域447bp片段。反应条件如下：95℃10s，55℃30s，72℃30s，32-35个循环。
PCR产物送交测序公司进行高通量扩增子测序，根据测序结果，结果表明两个阳性植株的靶标位点已发生编辑，且基因编辑模式均为多等位基因突变。
4、将经高通量测序确认发生编辑的两个株系种植在实验大棚中，直至收获果实，发现：
在常温不催熟的条件下(22℃)，发生编辑的突变株系的果实相比野生型成熟明显减缓，野生型果实在20天左右已完全成熟且开始腐烂，然而MaACO1突变果实约在80天左右开始成熟(图5)，这可以大大增长香蕉采后的常温保存期。
在常温乙烯催熟的条件下(22℃)，野生型和突变株系的果实都能在7-10天内完全成熟，但突变株系的果实成熟过程稍晚1-2天(图6)。
这说明通过实施例1构建的基因编辑载体定点突变MaACO1基因能起到明显的延缓果实成熟的作用，是一个理想的应用基因编辑延长果实采后保鲜期的靶标位点。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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