具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。

实施例1：以pBSKrnaSeph/has-mir-34a载体构建重组miR-140表达质粒，表达重组miR-140。

(1)根据重组miR-140的有效序列(SEQ ID NO：1)，以及pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体上的序列设计引物，同时在引物的两端加上1-15nt载体插入位点两侧的同源序列。

表1重组miR-140引物

(2)插入片段的合成

以表1中的两条引物互为模板，利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA(SEQ ID NO：3)反密码子环处具有的酶切位点，将重组miR-140的前体序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；反应体系如表2所示，反应过程如表3所示：

表2聚合酶体外扩增链反应体系(50μL)

表3聚合酶体外扩增链反应过程

图1是本实施例对重组miR-140的前体序列(SEQ ID NO：3)插入片段的引物PCR凝胶电泳图。图中M代表DL2000 DNA marker；1代表引物PCR后合成的插入片段。

(3)pBSKrnaSeph/has-mir-34a载体的双酶切

用Eag I-HF^TM，Sac II限制性内切酶对载体进行37℃酶切，反应体系如表4所示。

表4 50μL双酶切体系

图2是本实施例对pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体进行双酶切鉴定的结果图。图中M代表DL2000 DNA marker；1代表双酶切后的pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a质粒；2代表pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a质粒。结果表明pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体酶切成功。

(4)酶切质粒以及PCR片段的回收及纯化

将PCR产物和酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用OMEGA公司的胶回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)进行回收纯化。在凝胶成像系统中用365nm的紫外光观察琼脂糖凝胶电泳后的DNA分离结果，用刀片小心切下带有目的DNA区带的凝胶，尽可能切下更少的胶，放入1.5mL的EP离心管中；称取凝胶的质量；按照1:1的体积比向装有琼脂糖凝胶的离心管中加入Binding Buffer结合缓冲液，并将混合物放于60℃-65℃水浴中7min，期间每隔两到三分钟振荡混合一次，直至凝胶完全融化；将融化后得到的溶液转移到DNAMini Column离心柱中，并将离心柱放入2mL的Collection Tube收集管中；10000rpm离心1min。每次离心的溶液体积最多为700μL，可将溶液分多次离心，直至全部离心完，并弃去收集管中的滤液，重复利用收集管；在离心柱中加入700μL的添加过无水乙醇的SPW WashBuffer。放于离心机中10000rpm，室温离心1min，重复此步骤一次；弃去滤液，将离心柱以13000rpm的转速室温下离心2min，以彻底除去纯化柱中的乙醇；将离心柱置于全新干净的离心管中。向离心柱中央悬空滴加30～100μL的Elution Buffer洗脱液，静置2min使DNA完全溶解在洗脱液中。放于离心机中以13000rpm的转速室温离心1min，回收管底的洗脱液。取少量洗脱液进行DNA凝胶电泳测定是否为目的产物，贮存于-20℃。

(5)插入片段与载体的连接

胶回收片段用Ligation-Free Cloning System进行连接，反应体系如表5所示。

表5无缝连接反应体系(20μL)

混匀后，置于37℃孵育30min；转化大肠杆菌HST08感受态细菌；对克隆菌落进行氨苄青霉素抗性筛选。

(6)DNA测序鉴定重组miR-140表达载体

挑取单克隆菌落，于含有氨苄的LB培养基中培养约3h。取100μL菌液，送擎科生物科技有限公司，用测序引物M13Fow-GTAAAACGACGGCCAGT，Rev-CAGGAAACAGCTATGAC进行DNA测序鉴定。

实施例2：重组miR-140的表达

(1)200ng重组miR-140表达质粒转化HST08感受态细菌后，加入5mL LB培养基，在37℃，200rpm震荡培养过夜。菌液经10000g离心2min后，收集沉淀。于沉淀中加入180μL10mM醋酸镁-Tris·HCl溶液重悬，再加入200μL的饱和苯酚，室温振摇20～60min。10000g离心10min后收集水相，加入0.1倍水相体积的5M NaCl沉淀大分子杂质。上清液再加入2倍体积无水乙醇，10000g离心10min后，弃掉上清。吸水纸吸干残留乙醇，待RNA干燥后加入DEPC水溶解RNA，测定浓度，-80℃冰箱保存。

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

将2μg RNA样品与2×RNA上样缓冲液混合，加入变性胶样品孔内。120～150V电泳40～60min后，放入含0.5μg/mL溴化乙锭的溶液中轻摇20～30min，于凝胶成像系统下观测，拍照保存。

图3是本实施例利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组miR-140(SEQID NO：1)的表达。图中M表示RNA marker；1表示野生型HST08 E.coli总RNA；2表示重组miR-140表达质粒转化的HST08E.coli后的总RNA。与未转化重组miR-140表达质粒的细菌总RNA相比，转化后的细菌总RNA在150-300nt之间多了一条条带。结果表明，重组miR-140表达质粒在大肠杆菌中可以高表达重组miR-140。

实施例3：FPLC纯化重组miR-140

(1)采用Bio-Rad NGC^TM Chromatography System，以离子交换柱(ENrich^TMQ10×100Column)纯化重组miR-140。

流动相A：10mM NaH₂PO₄溶液，pH7.0。流动相B：10mM NaH₂PO₄溶液，1M NaCl溶液，pH7.0。

流速为2.0mL/min。以DEPC水，流动相A，流动相B分别交替冲洗色谱柱约1h。每次冲洗5柱体积。

运行以下程序对总RNA进行分离：0～8.9min(0％B)，8.9～13.7min(55％B)，13.7～53.7min(55～75％B)，53.7～73.7min(75～85％B)，73.7～83.7min(100％B)，83.7～93.7min(0％B)。以260nm的吸光度检测RNA，并收集重组RNA所对应的峰。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。

(2)RNA样品处理方法

总RNA提取步骤同上。所提取的总RNA于4℃13000rpm离心10min后，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，每次进样5～10mg。

(3)FPLC组分收集及浓缩去盐

以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。混合后的各组分用2倍体积无水乙醇沉淀RNA，-80℃冰箱放置约1h。以10000g转速于4℃离心10min收集RNA。将所得RNA沉淀用DEPC水溶解，用tra-2mL Centrifugal Filters 4℃7500g离心10min，去滤液，重复此步骤直至所有溶液离心完，再将Filters倒置，2000g离心2min，收集所得溶液，测定浓度后于-80℃保存。

图4是本实施例利用Bio-Rad NGC^TM Chromatography System纯化重组miR-140(SEQ ID NO：1)，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。结果表明，经FPLC纯化后，可得到高纯的重组miR-140(SEQ ID NO：1)。

实施例4：重组miR-140在细胞内的加工、成熟

(1)重组miR-140转染

将小鼠原代软骨细胞以1×10⁶接种到6孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为含3％血清的DMEM，将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min，然后将孵育物加入到对应的6孔板中，重组miR-140终浓度为20nM，24h后完成转染。

(2)RNA提取

按照RNA提取说明书提取RNA，所得RNA后冻于-80℃冰箱保存。

(3)qPCR检测检测重组miR-140在细胞内的表达

利用反转录试剂盒对RNA进行反转录，反转录产物冻于-20℃,具体过程如下：

a:gDNA消化，在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。

表6 Stem loop qPCR gDNA消化反应体系

b:逆转录反应体系配制(20μL体系)

表7 Stem loop qPCR cDNA逆转录反应体系

取上述已反转录好的cDNA，稀释10倍，以U6为内参，利用stem loop qPCR方法检测细胞内重组miR-140的表达量，qPCR反应程序如下：95℃，2min；95℃，5s，60℃，30s，39个循环；95℃，5s；65℃，5s；95℃，50s。所使用的引物序列如下：

表8 Stem loop qPCR引物

图5是本实施例利用Stem loop qPCR技术检测重组miR-140在小鼠原代软骨细胞中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用Students’t检验，***P<0.005vs NC)。与空白对照(Blank)相比，成熟miR-140表达显著升高，表明重组miR-140在软骨细胞中被加工为成熟的miR-140。

实施例5：重组miR-140对OA的治疗作用

选用IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞作为OA模型，进行重组miR-140转染，检测其治疗效果。

1、qPCR技术检测重组miR-140及其靶基因、OA相关特征分子、炎性因子的表达情况

(1)OA细胞模型构建及转染

将小鼠原代软骨细胞以1×10⁶接种到6孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为含IL-1β10ng/mL的完全DMEM培养基，孵育24h后，更换培养基为含3％血清的DMEM培养基，并将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min，然后将孵育物加入到对应的6孔板中，重组miR-140终浓度为20nM，24h后完成转染。

(2)RNA提取

按照RNA提取说明书提取RNA，所得RNA后冻于-80℃冰箱保存。

(3)qPCR检测相关靶基因表达

利用反转录试剂盒对RNA进行反转录，反转录产物冻于-20℃，具体过程如下：

a：gDNA消化

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃消化反应2min。

表9 Real time qPCR gDNA消化反应体系

b：逆转录反应体系配制(20μL体系)

表10 Real time qPCR cDNA逆转录反应体系

取上述已反转录好的cDNA，稀释10倍，以GAPDH为内参，利用qPCR方法分别检测ADAMTS5、IL-6、Col2a1、MMP-13的表达量，qPCR反应程序如下：95℃，2min；95℃，5s，60℃，30s，39个循环；95℃，5s；65℃，5s；95℃50s。所使用的引物序列如下：

表11 miR-140qPCR引物

图6是本实例利用q-PCR技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后靶基因(ADAMTS5)、炎性因子IL-6、OA相关特征分子(MMP-13、Col2a1)表达量结果图(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用Students’t检验，*P<0.05，**P<0.01vs Model)。与IL-1β刺激的模型组(Model)相比，实验组ADAMTS5、IL-6、MMP-13表达显著降低，Col2a1表达增加，表明重组miR-140在mRNA水平通过对靶基因调控，抑制蛋白聚糖酶及蛋白水解酶对蛋白聚糖及胶原的破坏，抑制炎症因子的生成，从而维持软骨细胞的合成代谢平衡，发挥抗骨关节炎作用。

2.WB检测重组miR-140的OA治疗作用

(1)OA细胞模型构建及转染

将小鼠原代软骨细胞以1×10⁶接种到6孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为含IL-1β10ng/mL的完全DMEM培养基，孵育24h后，更换培养基为含3％血清的DMEM培养基，并将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min，然后将孵育物加入到对应的6孔板中，重组miR-140终浓度为20nM，24h后完成转染。

(2)蛋白提取

24h后，弃掉6孔板中的培养基，DPBS洗一遍，加入含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上裂解30min，用细胞刮将细胞刮下来加入到1.5mL EP管中，在日立离心机上离心(12000rpm,15min,4℃)，将上清转移至新准备的EP管中，利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将蛋白定量加入loading buffer煮沸10min后，在10％的分离胶的蛋白胶中每个泳道加入30μg蛋白进行电泳(70V，30min；120V，1.3h)、PVDF膜转膜(200mA，2h)。将膜转移到20％脱脂牛奶(TBST)中封闭1h，随后移除20％脱脂牛奶，按分子量进行裁膜，分别加入TBST稀释的一抗GAPDH(1：2000，Proteintech，10494-1-AP)、IL-6(1：1000，Abclonal，A0286)、MMP-13(1：1000，Abclonal，A16920)、Col2a1(1：1000，Abclonal，A1560)、ADAMTS5(1：250，Abcam，Ab41037)，4℃摇床过夜，第二天回收一抗，TBST洗三遍，加入二抗(TBST稀释，1：1000，壮志)室温摇床孵育2h，TBST洗三遍，利用Tanon 4600SF成像仪进行扫膜。

图7是本实例利用WB技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后靶基因(ADAMTS5)、炎性因子IL-6、OA相关特征分子(MMP-13、Col2a1)蛋白表达量图。与IL-1β刺激的模型组(model)相比，实验组ADAMTS5、IL-6、MMP-13表达显著降低，Col2a1表达增加，表明在蛋白水平通过对靶基因调控，抑制蛋白聚糖酶及蛋白水解酶对蛋白聚糖及胶原的破坏，抑制炎症因子的生成，从而维持软骨细胞的合成代谢平衡，发挥抗骨关节炎作用。

3.免疫荧光(IF)实验评价重组miR-140的OA治疗作用

(1)OA细胞模型构建及转染

将小鼠原代软骨细胞以1×10⁶接种到6孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为含IL-1β10ng/mL的完全DMEM培养基，孵育24h后，更换培养基为含3％血清的DMEM培养基，并将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min，然后将孵育物加入到对应的6孔板中，重组miR-140终浓度为20nM，24h后完成转染。

(2)免疫荧光染色

24h后，弃掉6孔板中的培养基，PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛固定20min，PBS洗2遍，加入0.5％Triton-X100室温破膜10min，PBS洗2遍，加入3％BSA封闭30min，PBS洗2遍，加入MMP-13和IL-6的一抗稀释液室温摇床孵育2h，PBS洗3遍，加入FITC标记的二抗(1：500，CST)室温避光孵育1h，弃去二抗，PBS洗3遍，加入细胞核染料Heochst33342(1：1000)室温孵育5min，弃去染料，PBS洗3遍，利用激光共聚焦显微镜进行观察拍照。

图8是本实例利用免疫荧光染色技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后炎性因子IL-6和OA相关特征分子MMP-13的表达结果图。与IL-1β刺激的模型组(Model)相比，实验组IL-6和MMP-13表达显著降低，表明重组miR-140具有抑制炎症因子生成及蛋白聚糖酶活性的作用。

4.甲苯胺蓝染色实验评价重组miR-140的体外OA治疗作用

将小鼠原代软骨细胞以1×10⁵接种到24孔板中，待细胞贴壁展开后，更换培养基为含IL-1β10ng/mL的完全DMEM培养基，孵育24h后，更换培养基为含3％血清的DMEM培养基，并将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min，然后将孵育物加入到对应的24孔板中，重组miR-140终浓度为20nM，24h后完成转染，PBS洗3遍，每孔加入1％甲苯胺蓝染色液(索莱宝)500μL，室温孵育30min，PBS洗5遍，加入4％多聚甲醛固定20min，PBS洗2遍后普通显微镜下明场拍摄。

图9是本实例利用甲苯胺蓝染色技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后对OA的治疗作用。与IL-1β刺激的模型组(Model)相比，实验组的蓝色明显加深，接近正常对照组(Control)，表明重组miR-140具有抑制蛋白聚糖流失的作用。

5.重组miR-140对半月板失稳术诱导的OA小鼠的软骨保护及治疗作用

将6-8周大的C57BL/6小鼠右后肢行半月板失稳手术，手术两周后，隔日关节腔原位注射miR-140或MSA(20mg/Kg)，完成7次给药后安乐处死小鼠，收集右后肢关节，4％多聚甲醛固定24h后，先进行micro-CT三维重建扫描，再将关节组织石蜡包埋，切片后，进行番红固绿和H&E染色。

图10是本实例利用番红固绿和H&E染色技术检测经过miR-140治疗后对OA小鼠软骨的保护作用。与造模后saline组相比，小鼠胫骨软骨部位的红色明显恢复，颜色接近正常对照组；通过对H&E染色结果统计分析软骨退化面积、软骨退化宽度、滑膜炎性评分，miR-140治疗组的上述三个指标明显低于saline组，表明miR-140治疗具有软骨保护及OA治疗作用。

图11是本实例利用micro-CT三维重建技术比较不同治疗组软骨下骨的骨力学参数，经miR-140治疗后小鼠的骨小梁厚度、骨小梁数量、骨体积比都具有明显的回升，接近正常对照组，说明miR-140具有抑制OA小鼠软骨下骨的骨丢失作用。

本发明以改良tRNA为支架，嵌合miR-140序列，在大肠杆菌中表达重组miR-140。生产的重组miR-140能够在小鼠原代细胞中加工成熟，同时维持OA中软骨细胞的合成代谢平衡，在体内发挥软骨保护作用，进一步治疗OA。其可以用于制备骨关节炎模型中调控miR-140水平及其靶基因表达的试剂、前药、药物、原料药或药物组合，或者用作骨关节炎模型中用来维持软骨细胞合成代谢平衡、保护软骨从而治疗OA的试剂、前药、药物、原料药或药物组合。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

序列表

<110> 西北工业大学

<120> 一种抗骨关节炎的重组miR-140及其生产方法和应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 190

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagcgaugg ccgagugguu aaggcguugg acuggccagc ugugaguguu ucuucagugg 60

uuuuacccua ugguagugug agcaauagua aggaacuacc auaggguaaa accacugaga 120

agugcugcac guuguuggcc caauccaaug gggucucccc gcgcagguuc gaacccugcu 180

cgcugcgcca 190

<210> 2

<211> 98

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcagcgaugg ccgagugguu aaggcguugg acunnnnnnn nnnnnnnnna auccaauggg 60

gucuccccgc gcagguucga acccugcucg cugcgcca 98

<210> 3

<211> 108

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccagcugu gaguguuucu ucagugguuu uacccuaugg uagugugagc aauaguaagg 60

aacuaccaua ggguaaaacc acugagaagu gcugcacguu guuggccc 108

<210> 4

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtaacgct gaattcggct acgtagctca gttggttaga gcagcggccg ggccagctgt 60

gagtgtttct tcagtggttt taccctatgg tagtgtgagc aatagtaagg aa 112

<210> 5

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctttcgctaa ggatctgcag tggtggctac gacgggattc gaacctgtga cccgcggggg 60

ccaacaacgt gcagcacttc tagagtggtt tgtacctatg gtagttcctt actattgc 118

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctctgactt caacagcgac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctcttgtg ctcttgctgg 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcgtatcca gtgcagggtc cgag 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtattcgcac tggatacgac ctacct 26

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacgcacagt ggttttac 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccagtgcagg gtccgaggta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctctgactt caacagcgac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcctcttgtg ctcttgctgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccaggataa aaccaggcag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggccaaggg ttgtaaatgg 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggagcccacc aagaacgata g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtgaagtagg gaaggccgtg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acaccgctaa cgtccagatg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcggtactcg atgacggtct 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

taccatcctg cgactcttgc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttcacccaca tcaggcactc 20