一种碱性磷酸酶的检测方法
阅读说明：本技术 一种碱性磷酸酶的检测方法 (Detection method of alkaline phosphatase ) 是由 杨华林 周玉 马丽圆 张兴平 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种碱性磷酸酶的检测方法,属于检测碱性磷酸酶的技术领域。该碱性磷酸酶的检测方法,包括以下步骤：S1、将N-甲基卟啉二丙酸IX、G-四聚体和4-硝基苯基磷酸酯六水合物添加至缓冲液中,之后继续加入待测液得到待测体系；S2、检测所述待测体系的荧光发射光谱并获取在610nm处的荧光发射峰；S3、根据所述荧光发射峰结合碱性磷酸酶的浓度与荧光发射峰的标准方程获取所述待测液中碱性磷酸酶的浓度。本发明提出的检测方法灵敏度高且检测速度快。(The invention discloses a detection method of alkaline phosphatase, belonging to the technical field of detection of alkaline phosphatase. The detection method of alkaline phosphatase comprises the following steps: s1, adding N-methyl porphyrin dipropionic acid IX, a G-tetramer and 4-nitrophenyl phosphate hexahydrate into a buffer solution, and then continuously adding a solution to be detected to obtain a system to be detected; s2, detecting the fluorescence emission spectrum of the system to be detected and acquiring a fluorescence emission peak at 610 nm; and S3, obtaining the concentration of the alkaline phosphatase in the liquid to be detected according to the standard equation of the concentration of the fluorescence emission peak combined with the alkaline phosphatase and the fluorescence emission peak. The detection method provided by the invention has high sensitivity and high detection speed.)
技术领域
本发明涉及检测碱性磷酸酶的技术领域，具体涉及一种碱性磷酸酶的检测方法。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于人体肝脏、骨、肠、肾、胎盘等组织中。由于它在信号转导、细胞生长和凋亡中起着重要作用，因此常被用作特定疾病的标志物，如胆管梗阻、肝功能异常和肾性骨营养不良等。因此，检测碱性磷酸酶水平在临床上具有重要意义。
目前已经开发了许多测定碱性磷酸酶的方法，包括电化学方法、比色法和荧光法。其中，荧光法因其灵敏度高而备受关注。一些荧光材料，如纳米团簇、有机荧光团、量子点和碳点等已成功用于监测碱性磷酸酶。然而，这些方法大多存在试剂昂贵、时间长、合成路线复杂等局限性。基于此，有必要研究出灵敏度高、检测速度快碱性磷酸酶检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种碱性磷酸酶的检测方法，解决现有技术中检测碱性磷酸酶的灵敏度低、检测速度慢的技术问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种碱性磷酸酶的检测方法，包括以下步骤：
S1、将N-甲基卟啉二丙酸IX、G-四聚体和4-硝基苯基磷酸酯六水合物添加至缓冲液中，之后继续加入待测液得到待测体系；
S2、检测所述待测体系的荧光发射光谱并获取在610nm处的荧光发射峰；
S3、根据所述荧光发射峰结合碱性磷酸酶的浓度与荧光发射峰的标准方程获取所述待测液中碱性磷酸酶的浓度。
进一步地，在步骤S3中，所述标准方程为Y＝-62375.4834X+2028450，其中，X表示碱性磷酸酶的浓度，Y表示荧光发射峰。
进一步地，在步骤S3中，所述标准方程由以下步骤得到：
将不同已知浓度的碱性磷酸酶溶液添加至含有N-甲基卟啉二丙酸IX、G-四聚体和4-硝基苯基磷酸酯六水合物二钠盐的缓冲液中反应得到混合物；检测所述混合物的荧光发射光谱并记录在610nm处的荧光发射峰，根据所述碱性磷酸酶溶液的浓度与对应的荧光发射峰的关系建立所述标准方程。
进一步地，在步骤S1中，所述G-四聚体的序列为5’-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG-3’。
进一步地，在步骤S1中，所述G-四聚体在所述缓冲液中的浓度为500nM以上。
进一步地，在步骤S1中，所述4-硝基苯基磷酸酯六水合物在所述缓冲液中的浓度为500μM以上。
进一步地，在步骤S1中，所述缓冲液的pH为8-8.5。
进一步地，所述不同浓度的碱性磷酸酶溶液的浓度分别为0U/L、2.5U/L、5U/L、10U/L、15U/L、20U/L、25U/L、30U/L、40U/L、60U/L。
进一步地，在步骤S1中，加入所述待测液后混合30-40分钟，之后在36-37℃下继续反应得到所述待测液。
进一步地，在36-37℃下继续反应30-40分钟得到所述待测液。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：当碱性磷酸酶不存在时，缓冲液中的G-四聚体和N-甲基卟啉二丙酸IX形成复合物发出强烈的荧光(400nm激发，610nm发射)。当存在碱性磷酸酶后，缓冲液中的4-硝基苯基磷酸酯六水合物被水解成对硝基苯酚，此时再用400nm的荧光激发，其能量都被对硝基苯酚所吸收，因此G-四聚体/N-甲基卟啉二丙酸IX复合物得不到激发，造成荧光下降，检测待测体系的荧光发射光谱并获取在610nm处的荧光发射峰，并结合碱性磷酸酶的浓度与荧光发射峰的标准方程即可获取所述待测液中碱性磷酸酶的浓度，该方法灵敏度高且检测速度快。
附图说明
图1A是本发明PNPP和PNP的紫外-可见吸收光谱图。
图1B是本发明G4/NMM复合物的荧光激发光谱。
图2是本发明基于G4/NMM与对PNP内过滤效应检测碱性磷酸酶原理图。
图3是本发明实施例1不同条件下的荧光光谱图。
图4A是本发明实施例1 610nm处G4/NMM的荧光强度结果图。
图4B是本发明实施例1不同用量的PNPP对G4/NMM复合物荧光强度的影响结果图。
图4C是本发明实施例1缓冲液的pH值对G4/NMM复合物荧光强度的影响结果图。
图5A是本发明实施例1不同浓度的ALP响应的荧光光谱图。
图5B是本发明实施例1不同浓度的ALP在610nm处的荧光信号结果图，其中，插图为荧光信号在2.5-25U/L范围内的线性关系图。
图6是本发明实施例1方法选择性分析结果图。
具体实施方式
本具体实施方式提供了一种碱性磷酸酶(即ALP)的检测方法，包括以下步骤：
S1、将N-甲基卟啉二丙酸IX(即NMM)、G-四聚体(即G4)和4-硝基苯基磷酸酯六水合物(即PNPP)添加至缓冲液中，之后继续加入待测液混合30-40分钟，之后在36-37℃下继续反应30-40分钟得到待测体系；所述G-四聚体的序列为5’-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG-3’；所述G-四聚体在所述缓冲液中的浓度为500nM以上；所述4-硝基苯基磷酸酯六水合物在所述缓冲液中的浓度为500μM以上；所述缓冲液的pH为8-8.5。
S2、检测所述待测体系的荧光发射光谱并获取在610nm处的荧光发射峰；
S3、根据所述荧光发射峰结合碱性磷酸酶的浓度与荧光发射峰的标准方程获取所述待测液中碱性磷酸酶的浓度；所述标准方程为Y＝-62375.4834X+2028450，其中，X表示碱性磷酸酶的浓度，Y表示荧光发射峰；所述标准方程由以下步骤得到：
将不同已知浓度的碱性磷酸酶溶液添加至含有N-甲基卟啉二丙酸IX、G-四聚体和4-硝基苯基磷酸酯六水合物二钠盐的缓冲液中反应得到混合物；检测所述混合物的荧光发射光谱并记录在610nm处的荧光发射峰，根据所述碱性磷酸酶溶液的浓度与对应的荧光发射峰的关系建立所述标准方程；所述不同浓度的碱性磷酸酶溶液的浓度分别为0U/L、2.5U/L、5U/L、10U/L、15U/L、20U/L、25U/L、30U/L、40U/L、60U/L。
发明原理如下：
结合图2，其中，G4/NMM表示G-四聚体/N-甲基卟啉二丙酸IX复合物，Alkalinephosphatase为碱性磷酸酶，PNPP为4-硝基苯基磷酸酯六水合物二钠盐，PNP为对硝基苯酚。PNPP为ALP的底物，通过ALP的水解，可以生成产物对硝基苯酚(即PNP)。如图1A所示，PNPP在310nm处具有一吸收峰，当生成PNP后，最大吸收峰移动到在400nm处。如图1B所示，G4/NMM的最大激发波长正好是400nm。因此，生成的PNP可以通过内过滤效应猝灭G4/NMM的荧光。
通过PNP的吸收波谱及G4/NMM的激发波谱分析，得知PNP的最大吸收峰和G4/NMM的最大激发峰接近。通过此现象，我们设计了一种检测ALP的荧光新方法。
检测原理为：当ALP不存在时，G4/NMM发出强烈的荧光(400nm激发，610nm发射)。当加入ALP后，PNPP被水解成PNP，此时再用400nm的荧光激发，其能量都被PNP所吸收，因此G4/NMM得不到激发，造成荧光下降。在这个过程中，由于ALP的角色是催化剂，因此一种超灵敏的ALP检测方法可以被建立。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例包括以下步骤：利用酶标仪扫描PNPP和PNP的紫外可见吸收光谱、G4/NMM的荧光激发光谱并研究方法的可行性；利用酶标仪研究方法的可行性；G4浓度、PNPP浓度、缓冲液pH的优化；方法的灵敏度和线性检测范围；方法的选择性；真实样品检测。
(1)研究方法的可行性
为了评估我们设计的可行性，首先分别对G4/NMM(G4序列为：5’-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG-3’)、G4+NMM+PNPP、G4+NMM+PNP、G4+NMM+PNPP+ALP进行荧光光谱扫描，我们准备四组样品分别是500nM G4+500nM NMM；500nM G4+500nM NMM+500μMPNPP；500nM G4+500nM NMM+500μM PNP；500nM G4+500nM NMM+500μM PNPP+100U/L ALP；上述样品均在pH＝8的缓冲液(50mM HEPES，0.5M NaCl)中反应30min，每组样品取200μL加入到96孔酶标板中，用酶标仪记录荧光信号变化。
结果如图3所示：G4/NMM复合物在610nm处显示出强荧光。当添加PNPP时，荧光不受影响。然而，添加PNP可以显著抑制荧光。当将ALP添加到PNPP和G4/NMM的混合物中时，由于PNPP水解成PNP，也可以明显观察到荧光猝灭。因此，这些结果表明，所提出的方法可用于检测碱性磷酸酶。
(2)反应条件的优化
为了实现碱性磷酸酶检测方法的最佳分析性能，对本实验涉及的几个实验参数进行了优化：
由于NMM的荧光强度将随着G-四聚体浓度的增加而增加，将NMM浓度固定在500nM，优化G-四聚体浓度。分别将100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM的G-四聚体和500nM的NMM加入到pH＝8的缓冲液(50mM HEPES，0.5M NaCl)中反应30分钟，每组样品取200μL加入到96孔酶标板中，用酶标仪记录荧光信号变化。结果如图4A所示，G-四链体浓度在100-800nM范围内增加，荧光强度在500nM处达到平台，表明NMM完全被G4结合。因此，选择500nM G-四链体浓度作为最佳浓度。
由于在实验中，既要保证有足够的底物PNPP和ALP反应，又要遵循节省实验材料的原则，因此我们研究了PNPP浓度对荧光猝灭效果的影响。当ALP的浓度固定在100U/L时，分别将浓度为100-800μM的PNPP加入到含有500nM G4和500nM NMM的缓冲液(50mM HEPES，0.5M NaCl)中反应30分钟，每组样品取200μL加入到96孔酶标板中，用酶标仪记录荧光信号变化。如图4B所示，当浓度达到500μM时，荧光不再继续降低。因此，过量的PNPP不能再降低荧光强度。因此，选择浓度为500μM的PNPP作为最佳浓度。
最后，考虑到缓冲液pH对荧光猝灭效果的影响，对缓冲液pH进行了优化，如图4C所示，当pH＝8.0时，荧光猝灭效果最好，因此选择pH＝8.0进行后续实验。
(3)方法的灵敏度和线性检测范围
首先，我们把不同浓度的碱性磷酸酶加入到含有500nM NMM、500nM G4，500μM的PNPP的缓冲液(50mM HEPES，0.5M NaCl，PH＝8)中反应30分钟，充分混匀，37℃反应30min。最后，用酶标仪记录光谱变化。如图5A所示，在0-30U/L的浓度范围内，荧光强度随ALP浓度的增加而降低，然后达到一个平台期，再增加ALP浓度，荧光变化也不明显。随后，我们对610nm处的峰值进行了分析，结果如图5B所示，在2.5-25U/L范围内，荧光强度与ALP浓度具有良好的线性相关性。校准方程为Y＝-62375.4834X+2028450(R2＝0.995)，X表示碱性磷酸酶的浓度，Y表示荧光发射峰。根据3倍空白误差/斜率，从校准曲线中获得检测限为0.81U/L。
(4)方法的选择性
通过比较ALP的响应与血清中可能存在的干扰物质(BSA、甘氨酸、葡萄糖、Na+、K+、Ca2+、Fe3+、Mg2+)的响应，研究了我们设计的生物传感器的选择性。用BAS(牛血清白蛋白)来研究蛋白质的干扰。结果如图6所示，只有ALP能产生较大的荧光变化，而其它干扰物质均在背景水平，需要说明的是F0表示无ALP的荧光强度，F表示有ALP的荧光强度，F0-F表示两者的差值。这些结果表明，该方法对血清中ALP的检测具有较高的选择性。
(5)牛血清样品中碱性磷酸酶的检测
为了评估所提出的检测方法在实际生物样品中的适用性和可靠性，在牛血清中进行了ALP测定的分析性能。在测量之前，血清样品用10倍稀释液处理以减少基质干扰。然后，采用标准加入法将不同浓度的ALP加入血清样品中。最后，用该检测方法测定了碱性磷酸酶的含量，并计算了回收率。如表1所示，回收率在90.46％至98.90％之间，这证明了所提出的检测方法检测生物样品中的ALP的可靠性。
表1碱性磷酸酶的回收率分析
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。