具体实施方式

以下针对本发明实施例的示踪粒子、示踪粒子的应用方法以及示踪粒子的制备方法作详细说明。应了解的是，以下的叙述提供许多不同的实施例或例子，用以实施本发明一些实施例的不同样态。以下所述特定的组件及排列方式仅为简单清楚描述本发明一些实施例。当然，这些仅用以举例而非本发明的限定。此外，在不同实施例中可能使用类似及/或对应的标号标示类似及/或对应的组件，以清楚描述本发明。然而，这些类似及/或对应的标号的使用仅为了简单清楚地叙述本发明一些实施例，不代表所讨论的不同实施例及/或结构之间具有任何关联性。

应理解的是，附图的组件或装置可以所属技术领域具有公知常识者所熟知的各种形式存在。此外，应理解的是，虽然在此可使用用语「第一」、「第二」、「第三」等来叙述各种组件、组件、区域、层或部分，这些组件、组件、区域、层或部分不应被这些用语限定。这些用语仅是用来区别不同的组件、组件、区域、层或部分。因此，以下讨论的一第一组件、组件、区域、层或部分可在不偏离本发明的教示的情况下被称为一第二组件、组件、区域、层或部分。

于此，「约」、「大约」、「实质上」的用语通常表示在一给定值或范围的20％内，较佳是10％内，更佳是5％内，或3％之内，或2％之内，或1％之内，或 0.5％之内。在此给定的数量为大约的数量，亦即在没有特定说明「约」、「大约」、「实质上」的情况下，仍可隐含「约」、「大约」、「实质上」的含义。

本发明实施例可配合附图一并理解，本发明的附图亦被视为揭露说明的一部分。应理解的是，本发明的附图并未按照比例绘制，事实上，可能任意的放大或缩小组件的尺寸以便清楚表现出本发明的特征。

除非另外定义，在此使用的全部用语(包含技术及科学用语)具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的相同涵义。能理解的是，这些用语例如在通常使用的字典中定义用语，应被解读成具有与相关技术及本发明的背景或上下文一致的意思，而不应以一理想化或过度正式的方式解读，除非在本发明实施例有特别定义。

本发明实施例提供一种示踪粒子，其包含专一性核酸分子作为标定物，利用孔隙度较大的核心结构增加核酸分子的固定强度，并提升粒子的热传导性，进而改善示踪粒子的耐极端环境的能力。

图1显示根据本发明一些实施例中，示踪粒子10的结构示意图。应理解的是，根据一些实施例，可添加额外特征于示踪粒子10。请参照图1，示踪粒子10可包含核心结构102、核酸分子104及壳层106。核心结构102可作为示踪粒子10的载体，承载后续形成的其它结构。核酸分子104固定于核心结构 102上。核酸分子104包含特定的核酸序列，可作为示踪粒子10的标定物。再者，壳层106包覆核心结构102及核酸分子104，可作为保护及封装结构。

如图1所示，在一些实施例中，核心结构102包含多个孔洞102p，且核酸分子104固定于孔洞102p中。详细而言，在一些实施例中，一部分的核酸分子104可固定于核心结构102的孔洞102中，一部分的核酸分子104可固定于核心结构102的表面102s上。

特别地，具有孔洞102p的核心结构102可改善示踪粒子10的热传导性，使其可适用于高温的环境，且亦可增加核酸分子104于核心结构102上的固定强度。在一些实施例中，核心结构102具有第一孔隙度，第一孔隙度的范围为约2nm至约100nm或约4nm至约40nm。应理解的是，核心结构102的孔隙度不应过大，否则无法达到保护核酸分子104效果。反之，核心结构102的孔隙度不应过小，否则核酸分子104可能会没有充足的位置进行附着，因而降低核酸分子104的固定效率。

在一些实施例中，核心结构102的粒径d1的范围为约20nm至约9000nm，约20nm至约200nm，约30nm至约100nm，或约200nm至约9000nm。根据一些实施例，前述粒径可为体均粒径。

核心结构102可由无机材料形成。在一些实施例中，核心结构102的材料包含二氧化硅、硅酸盐、碳酸盐(例如碳酸钙)、纳米金、金属氧化物、耐热聚合物(例如聚乙二醇或聚苯乙烯)和高分子聚合物(例如聚乳酸)中的至少一种。

在一些实施例中，可对核心结构102的表面进行改质，以将核酸分子104 固定于核心结构102上。详细而言，可通过添加含氯的四级铵盐，使核心结构102的表面带正电荷，借此可与带负电荷的核心结构102连接。在一些实施例中，前述含氯的四级铵盐可包含N-甲基-3-氨丙基三甲氧基烷 (trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane，TMAPS)。

此外，核心结构102可包含脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)和肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)中的至少一种。在一些实施例中，核酸分子104包含双股螺旋DNA。在一些实施例中，核酸分子104可包含质粒(plasmid)。

在一些实施例中，核酸分子104的长度范围为约10个碱基对(bp)至约2000 个碱基对，或较佳约50个碱基对至约500个碱基对。核酸分子104为质粒的实施例中，核酸分子104的长度范围为约1500个碱基对至约10000个碱基对，或约2000个碱基对至约4000个碱基对。应理解的是，当核酸分子104的长度太长，则壳层106无法完整地包覆核酸分子104，或是需较长的时间才能完成包覆，增加封装过程的难度。反之，当核酸分子104的长度过短，则可能导致核酸分子104容易被分解，降低核酸分子104的序列特异性，使得标定物的辨识度变差。此外，根据一些实施例，以质粒形式存在的核酸分子104可保护目标核酸片段，有助于提升示踪粒子10于极端环境中的耐受性及回收率，且可简化纯化的步骤、具有容易操作的优点。

在一些实施例中，可设计具有任意合适序列的核酸分子104作为标定物。举例而言，在一些实施例中，为了提升核酸分子104的温度耐受性，设计的核酸分子104的序列可包含嗜热菌种(Thermus thermophilus)的部分核酸序列。例如，在一些实施例中，所述嗜热菌可包含微嗜热乙型变形杆菌(Tepidimonas fonticaldi)、迟缓微嗜热菌(Tepidimonasignava)、水生微嗜热菌(Tepidimonas aquatica)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、普通高温放线菌 (Thermoactinomyces vulgaris)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、热球菌属 (Thermococcus)、栖热袍菌属(Thermotoga)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热变形菌属(Thermoproteus)、硫还原叶菌属(Desulfurolobus)、酸菌属(Acidianus)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)、布氏热网菌(Pyrodictium brockii)、甲烷嗜热菌属(Methanopyrus)或热棒菌属(Pyrobaculum)，但不限于此。

此外，在一些实施例中，设计的核酸分子104的序列可包含藻类的部分核酸序列。例如，在一些实施例中，所述藻类可包含属于单胞藻属的莱茵衣藻 (Chlamydomonasreinhardtii)、莫氏衣藻(Chlamydomonas moewusii)、卵配衣藻 (Chlamydomonaseugametos)、惰性衣藻(Chlamydomonas segnis)等；属于杜氏盐藻属的杜氏盐藻(Dunaliella salina)、杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)、普林莫杜氏藻(Dunaliellaprimolecta)等；属于绿球藻属的小球藻(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)等；属于红球藻属的雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis)等；属于绿球藻属的海洋绿球藻(Chlorococcum littorale)等；属于微细绿藻属的微细绿藻(Pseudochoricystis ellipsoidea)等；属于双眉藻属的双眉藻(Amphora sp.)等；属于菱形藻属的海洋硅藻(Nitzschia alba)、新月藻(Nitzschia closterium)、左弯菱形藻(Nitzschia laevis)等；属于隐甲藻属的寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)等；属于裸藻属的纤细裸藻(Euglena gracilis)、近轴裸藻(Euglena proxima)等；属于草履虫属的袋状草履虫 (Paramecium bursaria)等；属于聚球藻属的水生聚球藻(Synechococcusaquatilis)、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)等；属于螺旋藻属的钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)等；属于原绿球藻属的海洋原绿球藻 (Prochlorococcus marinus)等；属于卵囊藻属的多形卵囊藻(Oocystispolymorpha) 等，但不限于此。

在一些实施例中，设计的核酸分子104可具有杂合(hybrid)核酸序列。在一些实施例中，设计的核酸分子104的序列可同时包含来自原核生物及真核生物的部分核酸序列，例如，同时包含来自嗜热菌及藻类的部分核酸序列。举例而言，在一些实施例中，核酸分子104的序列包含嗜热菌的16S rDNA的部分序列以及藻类的18S rDNA的部分序列。由于在自然环境中应不存在同时具有两者物种的序列特性的生物体，因此，同时包含来自原核生物及真核生物的核酸分子104的序列应具有专一性，易于示踪粒子的辨识，且可降低与环境中的核酸片段互相干扰的可能性。具体而言，在一些实施例中，设计的核酸分子 104的序列可包含微嗜热乙型变形杆菌(Tepidimonas fonticaldi)以及莱茵衣藻 (Chlamydomonasreinhardtii)的部分核酸序列。

此外，在一些实施例中，可选择相较于腺嘌呤(Adenine，A)及胸腺嘧啶 (Thymine，T)的含量，具有较高含量的胞嘧啶(Cytosine，C)及鸟嘌呤(Guanine， G)的序列区域，作为核酸分子104的序列。由于腺嘌呤与胸腺嘧啶之间的作用力比胞嘧啶与鸟嘌呤之间的作用力强，因此，当序列的GC含量较高时其熔解温度较高，热稳定性亦较佳。具体而言，在一些实施例中，设计的核酸分子 104的序列的GC含量比例可为约55％至约70％。

在一些实施例中，核酸分子104与序列辨识号：1所示的序列具有至少 85％、90％或95％序列相似度。在一些实施例中，核酸分子104可包含如序列辨识号：2及3所示的序列。再者，在核酸分子104为质粒的实施例中，核酸分子104可包含插入于质粒中的核酸片段，且核酸片段与序列辨识号：1所示的序列具有至少85％、90％或95％序列相似度。

此外，可通过发明所属技术领域习知的技术设计核酸序列并制造核酸分子 104。例如，可利用与设计的核酸序列互补的引子，通过聚合酶连锁反应 (polymerase chainreaction，PCR)大量扩增设计的核酸序列。在一些实施例中，可进一步搭配生物发酵技术提升核酸分子104的产量。详细而言，可选择合适的质粒，并将设计好的核酸片段(例如，序列辨识号：1)插入质粒中，以建构重组的质粒(recombinant plasmid)，接着可使用发酵槽大量培养包含重组的质粒的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞可包含大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施例中，可使用碱裂解法从宿主细胞中萃取出包含目标核酸片段的重组的质粒。举例而言，根据一些实施例，以4公升的发酵槽制备核酸分子104，可达到8.85mg/日的产量，远多于以PCR制备核酸分子104的产量(约0.4mg/ 日)。

承前述，壳层106可作为封装材料，包覆核心结构102及核酸分子104。在一些实施例中，壳层106具有第二孔隙度。在一些实施例中，核心结构102 的第一孔隙度大于壳层106的第二孔隙度。在一些实施例中，壳层106的第二孔隙度实质上为0nm，亦即，壳层106实质上不具有孔洞，为实心或致密性壳层，可完整地密封核酸分子104，避免核酸分子104外露。在壳层106的第二孔隙度为0的一些实施例中，示踪粒子10可应用于流体的检测。在另一些实施例中，壳层106的第二孔隙度不为0，例如，为约0.5nm至约10nm。在壳层106的第二孔隙度不为0的一些实施例中，示踪粒子10可应用于空气的检测。

此外，壳层106可为单层结构或多层结构。如图1所示，在壳层106为单层结构的一些实施例中，壳层106可实质上不具有孔洞，实质上为密封的 (encapsulated)。

在一些实施例中，壳层106的厚度T的范围为约10nm至约5000nm，或约10nm至约150nm，或约50nm至约120nm。

在一些实施例中，壳层106包含二氧化硅、硅酸盐、碳酸盐(例如碳酸钙)、耐热聚合物(例如聚乙二醇或聚苯乙烯)和高分子聚合物(例如聚乳酸)中的至少一种。在一些实施例中，核心结构102及壳层106可由相同材料形成。

在一些实施例中，可使用含氯的四级铵盐对已固定核酸分子104的核心结构102进行改质，使得壳层106内部带正电荷，以与带负电荷的核酸分子104 连接，形成封闭的壳层-核心结构。在一些实施例中，前述含氯的四级铵盐可包含N-甲基-3-氨丙基三甲氧基烷(trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane， TMAPS)。

再者，如图1所示，在一些实施例中，完成封装后的示踪粒子10的粒径 d2的范围为约30nm至约10000nm，或约30nm至约300nm，或约50nm至约 150nm。根据一些实施例，前述粒径可为体均粒径。

此外，在一些实施例中，完成封装后的示踪粒子10具有良好的均质性，亦即，具有均匀的形状、大小或粒径。在一些实施例中，示踪粒子10的大小的变异量范围为约0％至约10％。

接着，请参照图2，图2显示根据本发明另一些实施例中，示踪粒子20 的结构示意图。应理解的是，后文中与前文相同或相似的组件或组件将以相同或相似的标号表示，其材料、制造方法与功能与前文所述相同或相似，故此部分在后文中将不再赘述。图2所示的实施例的示踪粒子20与图1所示的示踪粒子10大致类似，其差异在于，示踪粒子20的壳层106为多层结构。

详细而言，在此实施例中，壳层106包含外壳层106a以及内壳层106b。如图2所示，在此实施例中，内壳层106b可包含多个孔洞106p。孔洞106p 可降低壳层106的热传导性，进而改善示踪粒子20的温度耐受性。在一些实施例中，内壳层106b的孔隙度的范围为约4nm至约40nm。此外，此实施例中，外壳层106a实质上不具有孔洞，可完整地密封核酸分子104，避免核酸分子104外露。

应理解的是，虽然在图2所示的实施例中，壳层106包含两层，即，一外壳层106a以及一内壳层106b，但在另一些实施例中，壳层106可具有其它合适的数量的子层(sub-layer)。再者，虽然在图2所示的实施例中，内壳层106b 包含孔洞106p，在另一些实施例中，内壳层106b可实质上不具有孔洞。

根据一些实施例，本发明提供的示踪粒子可在120℃的环境下进行操作至少5小时以上。根据一些实施例，本发明提供的示踪粒子可在120℃的环境下进行操作24小时以上，且可维持80％以上的回收率。根据一些实施例，本发明提供的示踪粒子可在120℃的环境下进行操作720小时以上，且可维持20％以上的回收率。根据一些实施例，本发明提供的示踪粒子可在pH值1～13的环境下进行操作至少720小时以上。例如，可在pH值1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的环境下进行操作至少720小时以上。

此外，根据一些实施例，本发明提供的示踪粒子可用于地热或油井的流体追踪及探勘。具体而言，示踪粒子可在地层中的裂缝区域，追踪液体的运动(流动、移栖、迁移)及回收，借此分析油井或气井的分布及状态等。根据一些实施例，本发明提供的示踪粒子亦可用于污染物的追踪。根据一些实施例，本发明提供的示踪粒子可作为防伪标签。

此外，根据一些实施例，提供一种示踪粒子的应用方法，包含下列步骤：提供前述实施例所述的示踪粒子；将示踪粒子放置于欲进行观测的流体中；收集流体的样品，从样品中回收示踪粒子，并将核酸分子从示踪粒子释放；以及分析经释放的核酸分子。在一些实施例中，示踪粒子可在120℃的流体中持续操作至少720小时。根据一些实施例，示踪粒子可在pH值1～13的流体中持续操作至少720小时。

在一些实施例中，可使用氢氟酸去除示踪粒子的壳层，使核酸分子从示踪粒子释放、脱附。在一些实施例中，使用的氢氟酸水溶液(HF/NH₄F)的浓度范围为约0.5(v/v)％至约3.0(v/v)％，例如，约1.5(v/v)％。在一些实施例中，可通过实时聚合酶连锁反应(real-time polymerase chain reaction，q-PCR)分析经释放的核酸分子，确认设计的专一性核酸分子是否存在，以及确认其浓度。

接着，请参照图3，图3显示根据本发明一些实施例中，示踪粒子的制备方法10M的步骤流程图。应理解的是，在一些实施例中，可于示踪粒子的制备方法进行前、进行中及/或进行后提供额外的操作步骤。在一些实施例中，所述的一些操作可能视需求被取代或删除。在一些实施例中，操作/步骤的顺序可为可互换的。此外，可参照图2所示示踪粒子20的结构，理解以下制备方法的说明。

如图3所示，在一些实施例中，示踪粒子的制备方法10M可包含形成核心结构102(步骤S12)、将核酸分子104固定于核心结构102上(步骤S14)、以及形成壳层106于核心结构102上(步骤S16)，以包覆核心结构102及核酸分子104。详细而言，在一些实施例中，形成核心结构102的步骤可进一步包含提供油相溶液、提供水相溶液、以及将油相溶液加入水相溶液中，以形成混合溶液。油相溶液可包含硅的前驱物以及助乳化剂。在一些实施例中，硅的前驱物可包含四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane，TEOS)。在一些实施例中，助乳化剂可包含C2～C10短链醇和非离子界面活性剂中的至少一种。在一些实施例中， C2～C10短链醇可包含异丙醇。在一些实施例中，硅的前驱物以及助乳化剂的比例(体积比)介于约5：1至约1：10之间，或介于约1：1至约1：10之间，例如，约1：1。

在一些实施例中，油相溶液可进一步包含溶剂。在一些实施例中，溶剂可包含C6～C18中长链烷类、C6-C18中长链酯类和甲苯中的至少一种。在一些实施例中，C6～C18中长链烷类可包含辛烷。在一些实施例中，油相溶液中的硅的前驱物以及溶剂的比例(体积比)介于约1：1至约1：15之间，或介于约1：3至约1：10之间，例如，约1：7。

在一些实施例中，油相溶液中的硅的前驱物、助乳化剂以及溶剂的比例(体积比)介于约3：1：1至约15：1：1之间，或介于约5：1：1至约10：1：1 之间，例如，约7：1：1。应理解的是，硅的前驱物、助乳化剂以及溶剂的比例需于控制于特定范围中，使得形成的示踪粒子具有良好的均质性，亦即，具有均匀的形状、大小或粒径。

再者，水相溶液可包含水以及界面活性剂。在一些实施例中，界面活性剂可包含有机铵盐类、烷基硫酸盐和脂肪酸盐中的至少一种。在一些实施例中，有机铵盐类可包含溴化十六烷基三甲铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)。在一些实施例中，水相溶液中的水以及界面活性剂的比例介于约1：1至约10：1之间，或介于约10：1至约30：1之间。

在一些实施例中，可先将水相溶液加热至约50℃至约80℃、或约55℃至约70℃，例如约60℃的温度，使界面活性剂溶解于水中，之后再将油相溶液加入至水相溶液中。

此外，在一些实施例中，形成核心结构102的步骤可进一步包含加入催化剂至混合溶液中，以及加热混合溶液。在一些实施例中，催化剂包含碱性溶液。在一些实施例中，催化剂的pH值范围为约8至约14。在一些实施例中，催化剂可包含氨水、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾和碱类液体中的至少一种。

在一些实施例中，加热混合溶液的温度范围可为约50℃至约80℃、或约 55℃至约70℃，例如，约60℃。再者，在一些实施例中，加热的时间可为约 2小时至约4小时，例如，约3小时。在一些实施例中，在加热混合溶液之后，可将混合溶液于常温下静置隔夜，之后进行离心移除上清液，使用乙醇进行超音波震荡萃取，以获得核心结构102(示踪粒子的多孔载体)。

在一些实施例中，于加热混合溶液的步骤之后，可进一步包含加入表面修饰剂至混合溶液中的步骤，以提升多孔载体的分散能力。在一些实施例中，表面修饰剂可包含含氯的四级铵盐，例如，可包含N-甲基-3-氨丙基三甲氧基烷 (trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane，TMAPS)。详细而言，在一些实施例中，可将前述步骤S12获得的核心结构102溶解于助乳化剂(例如，异丙醇)中，接着加入表面修饰剂并进行震荡及离心，之后移除上清液并将产物溶于水，以达成分散。

接着，在一些实施例中，可将前述步骤获得的核心结构102与核酸分子 104混合并进行震荡后离心，以将核酸分子104固定于核心结构102上(步骤 S14)。承前述，核酸分子104可包含脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)和肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)中的至少一种。在一些实施例中，核酸分子104的长度范围为约10个碱基对至约2000 个碱基对。在一些实施例中，核酸分子104可为质粒，其长度范围为约1500 个碱基对至约10000个碱基对。

在核酸分子104的长度范围为约10个碱基对至约2000个碱基对的一些实施例中，核心结构102与核酸分子104的比例(体积比)介于约1：1至约10：1 之间，或约2：1至约8：1之间。在核酸分子104的长度范围为约1500个碱基对至约10000个碱基对的一些实施例中，核心结构102与核酸分子104的比例(体积比)介于约1：10000至约1：1000之间，或约1：100至约1：1000之间。

在一些实施例中，可将经核酸分子104固定的核心结构102加入醇类混合溶液中，以接续之后形成壳层106的步骤。在一些实施例中，醇类混合溶液可包含甘油、乙醇以及水。在一些实施例中，甘油、乙醇以及水的比例(体积比) 介于约100：100：1至约300：300：1之间，或介于约100：100：1至约200： 200：1之间。

接着，可形成壳层106于经核酸分子104固定后的核心结构102上。在一些实施例中，形成壳层106于核心结构102上的步骤(步骤S16)可包含将经核酸分子104固定的核心结构102与硅的前驱物以及表面修饰剂混合并震荡。在一些实施例中，硅的前驱物以及表面修饰剂可分两次加入，并进行两次震荡。

在一些实施例中，硅的前驱物可包含四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane， TEOS)。在一些实施例中，表面修饰剂可包含含氯的四级铵盐，例如，可包含 N-甲基-3-氨丙基三甲氧基烷(trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane， TMAPS)。

在一些实施例中，经核酸分子固定的核心结构102、硅的前驱物以及表面修饰剂的比例(体积比)介于1：1：1至100：50：1之间，或介于10：1：1至 50：5：1之间。

为了让本发明的上述及其它目的、特征、及优点能更明显易懂，下文特举多个实施例、比较实施例、制备例及测试例，作详细说明如下，然其并非用以限定本发明的内容。

实施例1：专一性核酸分子的设计

杂合DNA(hybrid DNA)的序列设计

选取微嗜热乙型变形杆菌(Tepidimonas fonticaldi，菌株AT-A2)的16S rDNA的50bp片段以及莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii，菌株CC-621)的 18S rDNA的50bp片段。以25bp(16S rDNA)-25bp(18S rDNA)-25bp(16S rDNA) -25bp(18S rDNA)的方式进行串接，合成耐温能力较一般DNA序列高的100bp 的杂合DNA序列(序列辨识号：1)，作为专一性核酸分子。

杂合DNA序列独特性的确认

使用美国国家生物技术信息中心生物基因库(NCBI)的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)系统进行比对，确认前述合成的杂合DNA序列的独特性，比对结果显示为零相关(no significant similarity)，代表数据库中没有任何相似的DNA序列存在，证明所设计的杂合DNA序列具有独特性。

实施例2：独特性核酸分子的制备

委托基因合成公司Integrated DNA Technologies合成序列辨识号：1的 DNA序列(100bp)。根据序列辨识号：1的序列，设计序列辨识号：2及序列辨识号：3的一组引子对。以序列辨识号：1的DNA序列作为模板，并分别以序列辨识号：2及3的DNA列序列作为3端及5端的引子(熔化温度Tm分别为59℃及63℃)，实行PCR程序，扩增序辨识号：1的DNA片段，以产生足够的专一性核酸分子，以进行后续的核酸分子固定化步骤。

PCR程序的使用材料如下：10ng(1μl)的模板、2μl的3端及5端引子(10μM)、 25μl的2X Taq MasterMix及20μl的ddH₂O，反应总体积为50μl。PCR扩增反应的温度条件设定为：95℃反应1分钟→[95℃反应1分钟→55℃反应30秒→ 72℃反应9秒]循环12次→72℃反应1分钟→12℃停留。

通过胶体电泳分析得到的PCR产物，确认是否为设计的专一性核酸分子，胶体电泳程序的使用材料如下：2.5％琼脂糖(agarose)、10X TBE缓冲液 (Tris-borate-EDTA)、1kb的DNA ladder(作为标记物(marker，M))(CLUBIO)及6X Loading dye(CLUBIO)，使用DNA电泳系统Mupid-2plus(Mupid)。胶体电泳的结果如图4所示，图中的A～C均为PCR产物，M为标记物1kb的DNA ladder，由图4可知，PCR扩增的产物长度为100bp，与序列辨识号：1的DNA 长度相符。

接着，使用Gel/PCR extraction Kit(Biomate)进行电泳胶体的纯化，移除PCR 过程中未作用的dNTPs及引子，避免影响后续的DNA固定化步骤。在纯化步骤后，可得到序列辨识号：1的DNA产物。

实施例3：包含独特性核酸分子的质粒的制备

使用T&A选殖载体(cloning vector，Yeastern biotech)将目标专一性序列(序列辨识号：1)进行克隆(cloning)，并将重组后的质粒(长度约3kb)送入宿主大肠杆菌(Escherichia coli，DH5α)中，之后以发酵槽大量培养大肠杆菌，并通过离心获取菌体，再以碱裂解法由菌体中萃取出包含所需的目标专一性序列的质粒。

使用限制酶EcoRⅠ及HindⅢ对质粒进行切割，并通过胶体电泳分析，确认获取的质粒长度是否正确(约3kb)，胶体电泳程序的使用材料如下：1.5％琼脂糖(agarose)、0.5XTAE缓冲液(Tris-Acetate-EDTA)、1kb的DNA ladder(作为标记物(marker，M))(CLUBIO)及6X Loading dye(CLUBIO)，使用DNA电泳系统Mupid-2plus(Mupid)。胶体电泳的结果如图5A所示，图中的A为未经限制酶切割的质粒，B为为经EcoRⅠ切割的质粒，C为经HindⅢ切割的质粒，M 为标记物1kb的DNA ladder，由图5A可知，通过培养大肠杆菌所获得的质粒长度约为3kb，与原始建构的质粒长度相符。

接着，以获取的质粒作为模板，以序列辨识号：2及3的DNA列序列作为3端及5端的引子，实行PCR程序，PCR程序的使用材料如下：10ng(1μl) 的模板、2μl的3端及5端引子(10μM)、25μl的2X Taq MasterMix及20μl的 ddH₂O，反应总体积为50μl。PCR扩增反应的温度条件设定为：95℃反应5分钟→[95℃反应30秒→60.7℃反应30秒→72℃反应10秒]循环29次→72℃反应5分钟→4℃停留。

通过胶体电泳分析得到的PCR产物，确认是否为目标专一性序列(序列辨识号：1)，胶体电泳程序的使用材料如下：2.5％琼脂糖(agarose)、10X TBE缓冲液(Tris-borate-EDTA)、1kb的DNA ladder(作为标记物(marker，M))(CLUBIO) 及6X Loading dye(CLUBIO)，使用DNA电泳系统Mupid-2plus(Mupid)。胶体电泳的结果如图5B所示，图中的A～D均为PCR产物，M为标记物1kb的 DNA ladder，由图5B可知，PCR扩增的产物长度约为100bp，与序列辨识号： 1的DNA长度相符。

测试例1：合成的专一性核酸分子对环境与人体的风险评估

通过环境菌株毒性测试，测试合成的序列辨识号：1的DNA序列对于环境中的微生物是否有抑制作用。结果如图6A～6D所示，图6A、6B及6C分别显示所合成的DNA序列对于E.coli、Bacillus cereus及Pseudomonas putida的毒性实验结果，图6D为E.coli受到抑制的对照组。由上述结果可知，所合成的序列辨识号：1的DNA序列不会对环境中常见的微生物产生抑制作用。

再者，将序列辨识号：1的序列与人类染色体的序列(Human G+T)进行比对，比对结果显示E-value>>1(数值)，相似度为零(若E-value<10^-5代表高同源性)，因此，取代人类基因的风险接近零。此外，进一步将序列辨识号：1的序列拆分成各25bp的四个片段进行比对，比对结果显示E-value>1，相似度极低，取代人类基因的风险亦接近零。

实施例4：示踪粒子A的制备

核心结构的制备及表面修饰

取玉米淀粉及去离子水配制35％的淀粉悬浮液，并于35℃进行搅拌。使用0.5N的NaOH将淀粉液的pH值调整至9.5。接着，取20g的次氯酸钠缓慢加入淀粉液中(添加时间大于30分钟)，并使用1N的HCl将淀粉液的pH值维持在9.5。在次氯酸钠添加后，继续搅拌50分钟，并使用0.5N的NaOH将淀粉液的pH值维持在9.5。待反应完成后，使用1N的HCl将淀粉液的pH值调整至7，以二次水及酒精清洗后抽气过滤，并于50℃烘箱进行烘干，得到改质淀粉。

取22mL的四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane，TEOS)，添加至36mL的去离子水及1mL的2％HCl中，搅拌至水解透明。接着，在加入3g的前述改质淀粉之后，以分液漏斗缓慢滴入20mL的5％NH₄OH，搅拌40分钟。过滤出固体，并放入50℃烘箱进行干燥24小时。之后，于550℃高温锻烧固体，持温3小时。于此，可得到示踪粒子的多孔载体(核心结构)。

取2g的前述多孔载体，添加至20mL的异丙醇中，均匀分散，接着，加入0.889mL的N-甲基-3-氨丙基三甲氧基烷 (trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane，TMAPS)及1mL的去离子水，于40℃搅拌2小时。接着，以15275RCF(相对离心力，relative centrifugalforce)离心 10分钟，去除上清液，并使固体分散于40mL的去离子水中。于此，可得到经表面修饰的多孔载体。

核酸分子的固定化

取35μL的经表面修饰的多孔载体，添加至10μL的前述序列辨识号：1 的DNA产物(300ppm)(或1300ppm)中，使用震荡仪进行震荡后，以18000RCF 离心10分钟。之后，取出上清液并以二次水清洗数次，并使固体分散于500μL 的二次水中。

壳层的封装

接着，加入0.6μL的N-甲基-3-氨丙基三甲氧基烷 (trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane，TMAPS)及0.6μL的TEOS，以900rpm 摇动4小时。之后，加入4μL的TEOS以900rpm摇动96小时。接着，以19375 RCF离心10分钟，移除上清液，并以二次水清洗数次，使固体分散于45μL 的二次水中。于此，可完成示踪粒子A。

图7A及7B分别显示多孔载体在壳层的封装程序前以及封装程序后的扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)观测图。由SEM分析结果，可观察到示踪粒子的粒径在封装程序前约为40nm～50nm(如图7A所示)，在封装程序后，增加至约60nm～75nm(如图7B所示)。

实施例5：示踪粒子B的制备

核心结构的制备及表面修饰

取2g的溴化十六烷基三甲胺(hexadecyl trimethyl ammonium bromide， CTAB)与30ml的二次水于血清瓶中制备水相溶液，加热至60℃使其溶解。此外，取7.2ml的辛烷、1ml的四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane，TEOS)以及1ml 的异丙醇制备油相溶液，并将油相溶液以滴管滴加至水相溶液。接着加入0.022ml的25％氨水，并于60℃反应3小时，反应完成后于常温下静置隔夜。之后，将反应完成的混合溶液离心并去除上清液，使用乙醇进行超音波震荡萃取，置换油相溶液，于此，可得到示踪粒子的多孔载体(核心结构)。

前述多孔载体离心后，添加至20mL的异丙醇中，均匀分散，接着，加入 0.222mL的N-甲基-3-氨丙基三甲氧基烷(TMAPS)，使用震荡仪震荡18小时后，以15275RCF(相对离心力，relative centrifugal force)离心10分钟，去除上清液，并使固体分散于20mL的二次水中。于此，可得到经表面修饰的多孔载体。

核酸分子的固定化

取350μL的经表面修饰的多孔载体，添加至前述实施例3制备的包含序列辨识号：1的质粒产物(100μl)中，以15275RCF离心10分钟后，去除上清液，并使固体溶解于5ml的醇类混合液(甘油：乙醇：水＝150：150：1)中。

壳层的封装

接着，加入6μl的TMAPS以及6μl的TEOS，使用震荡仪进行震荡4小时，再加入40μl的TEOS使用震荡仪震荡4天。之后，再加入24μl的TMAPS 使用震荡仪震荡18小时，并置换溶液为二次水。于此，可完成示踪粒子B。

图8A及8B分别显示多孔载体在壳层的封装程序前以及封装程序后的扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)观测图。由SEM分析结果，可观察到示踪粒子的粒径在封装程序前约为30nm～40nm(如图8A所示)，在封装程序后，增加至约50nm～60nm(如图8B所示)。

比较例1：示踪粒子C的制备

示踪粒子C的制备方法大致上与实施例4的示踪粒子A相似，但示踪粒子C并未进行壳层的封装，亦即，示踪粒子C的DNA为裸露的。

比较例2：示踪粒子D的制备

示踪粒子D的制备方法大致上参考Method(1968)，及Kim等人研究结果(T.G.Kim et al.,2017)。首先，配制50ml的95％酒精加上60ml二次水溶液在固定转速450rpm下搅拌15分钟，再加入20ml TEOS混合水解30分钟，最后加入6ml的25％氨水搅拌2小时使其聚合。反应完后将液体以15275 RCF转速离心15分钟后去除上清液，再以95％酒精清洗固体3次，放置50℃烘箱烘干。相较于示踪粒子A的多孔载体，示踪粒子D的载体为致密实心载体，孔隙度接近0。

实施例6：核酸分子的脱附流程

以氢氟酸(HF)移除保护DNA的壳层，脱附DNA，将10μL经封装完成的示踪粒子添加至40μL的1.5％HF/NH4F水溶液与中，使用震荡仪进行震荡混合约5分钟，接着，使用DNA纯化套组(Bioman Scientific)回收经脱附的DNA。

实施例7：回收的核酸分子的分析

使用实时聚合酶链式反应(q-PCR)分析，进行经回收的DNA的定量分析，确认其是否包含所设计的专一性DNA序列，并同时测量其浓度(质量)。q-PCR 程序的使用材料如下：1μl的模板(经脱附回收的DNA)、0.75μl的3端引子 (10μM)(序列辨识号：2)、0.75μl的5端引子(10μM)(序列辨识号：3)、12.5μl 的2X SYBR Green Master Mitrix(Thermo FisherScientific)及10μl的ddH₂O，反应总体积为25μl。q-PCR扩增反应的温度条件设定为：95℃反应10分钟→[95℃反应15秒→60℃反应9秒]循环40次→12℃停留。

测试例2：示踪粒子的耐温能力测试

分别将前述实施例4所制备的示踪粒子A与比较例1所制备的示踪粒子 C，置于温度为25℃、100℃、120℃、140℃、160℃、180℃及200℃的油浴槽中进行加热20分钟。接着，取出示踪粒子，并分别回收其上残留的DNA，进行胶体电泳分析。

结果如图9A及9B所示，图9A及9B分别显示比较例1及实施例4所制备的示踪粒子的耐温测试结果，图中的25、100、120、140、160、180及200 代表加热的温度，M为标记物(1kb的DNA ladder)。由图9A、图9B结果可知，比较例1的示踪粒子C(裸露的DNA)的高温耐受能力可达约100℃，而实施例 4的示踪粒子A(封装的DNA)的高温耐受能力可达约200℃。

此外，进一步针对实施例4的示踪粒子A在120℃时的耐温能力进行测试。具体而言，在不同时间点量测DNA的回收率，结果如下列表1所示。

表1

由表1的结果可知，经封装的示踪粒子A在经加热5小时后的DNA回收率仍可维持在76.5％。

此外，进一步针对实施例5的示踪粒子B在120℃时的耐温能力进行测试。在不同时间点量测DNA的回收率，结果如下列表2所示。

表2

由表2的结果可知，经封装的示踪粒子B在经加热24小时后的DNA回收率仍可维持在81.5％。

测试例3：示踪粒子的耐温能力测试比较

将前述实施例4所制备的示踪粒子A与比较例2所制备的示踪粒子D置于120℃的油浴槽中进行加热。接着，分别在加热1、2及2.5小时后，取出示踪粒子并回收其上残留的DNA，量测残留的DNA含量，计算残留率，结果如下列表3所示。

表3

由表3的结果可知，在120℃加热2.5小时后，实施例4所制备的示踪粒子A的DNA残留率为79.4％，而比较例2所制备的示踪粒子D的DNA残留率为52.4％。由此可知，相较于载体为实心(不具孔隙)的示踪粒子D，具有多孔载体结构的示踪粒子A具有较佳的高温耐受能力。

测试例4：示踪粒子的耐酸碱能力测试

将前述实施例4所制备的示踪粒子A置于具有不同pH值的溶液中，以测试示踪粒子A的结构在酸性及碱性环境下的耐受性。分别以硫酸及酸性溶液进行酸性溶液及碱性溶剂的配制。将示踪粒子置于pH 1、pH 3、pH 5、pH 7、 pH 9及pH 13的溶液中60分钟，接着，取出示踪粒子，回收其上残留的DNA，进行胶体电泳分析。

结果如图10所示，图中的M为标记物(1kb的DNA ladder)，由图10的结果可知，示踪粒子A的DNA量在pH 9以下的范围几乎未减少，并未受到pH 改变的影响，且在pH 9以上的范围亦未明显减少。由上述结果可知，实施例 4的示踪粒子A具有耐强酸及耐强碱的能力。

此外，亦对实施例5的示踪粒子B进行耐酸碱能力测试，将示踪粒子B 置于不同pH值的溶液中，以测试示踪粒子B的结构在酸性及碱性环境下的耐受性。分别以硫酸及酸性溶液进行酸性溶液及碱性溶剂的配制。将示踪粒子置于pH 1、pH 3、pH 5、pH 7、pH 9及pH 13的溶液中24小时，接着，取出示踪粒子并回收其上残留的DNA，量测残留的DNA含量，计算残留率，结果图 11所示。

由图11的结果可知，在1小时内，示踪粒子B的DNA量在pH 9以下的范围几乎未减少(图中pH 3、pH 5及pH 7的线条重叠)，并未受到pH改变的影响，且在pH 9以上的范围亦未明显减少，显示示踪粒子B具有耐强酸及耐强碱的能力。值得注意的是，在反应24小时之后，示踪粒子B的DNA量在 pH 9以下的范围亦未明显减少，表示其具有长时间耐强酸的能力。

测试例5：示踪粒子的添加于实场地热水耐温能力测试

将前述实施例5所制备的纳米多孔载体固定已建构目标DNA卷标的质粒，再经由封装程序后生产出的示踪粒子B。示踪粒子B置于小型反应槽，内部添加实场地热水，实场地热水分别为火山型地热区(中国大屯山地热水， pH1.5，水中总溶解固体物～9200ppm)的地热水及变质岩行地热区地热水(中国仁泽地热水pH8.8，水中总溶解固体物～4000ppm)。再个别置入于120℃的油浴槽中进行加热。接着，分别在加热480及720小时后，取出示踪粒子并回收其上残留的DNA，量测残留的DNA含量，计算残留率，结果如下列表4所示。

表4

由表4的结果可知，在120℃加热720小时后，酸性环境的示踪粒子E的 DNA残留率为10.7％，而弱碱性环境的示踪粒子E的DNA残留率为7.5％。由此可知，示踪粒子E已具有初步于地热实场应用的可行性。

测试例6：示踪粒子的管柱示踪测试

为了模拟示踪粒子应用在实际场域(在土壤或岩层)中的情况，将20号筛的石英砂(0.84mm)填充于直径为0.8cm长度为10.7cm的玻璃管柱中，制备石英砂管柱。一般而言，地热流体通道(裂隙)的导水度(hydraulic conductivity)约为10^-7～10^-2m/sec，制备的石英砂管柱的导水度约为3.4*10^-5m/sec。接着，将前述实施例4所制备的示踪粒子A置于水中，并以0.1ml/min的流速通入石英砂管柱中，并收集流出管柱的样本。

管柱示踪测试的目的是要探讨时间相对于扩散程度，对示踪粒子回收率的影响。由图12结果显示随着时间变化所回收到的示踪粒子A的DNA含量，由DNA含量的曲线变化可知，示踪粒子A在一次注入之后，少部分示踪粒子 A通过平流作用由最短通道流出，而大部分示踪粒子A因流场分布不均以延散及扩散行为流出通道(大部分在140分钟流出)。上述传输行为符合常见的示踪试验结果。此外，经测量，示踪粒子A的回收率可达97.5％，表示本实施例的示踪粒子不会被石英砂吸附，且能于低传导度流体通道中自由流动。

综上所述，根据本发明一些实施例，示踪粒子包含专一性核酸分子作为标定物(标签、指纹)，以无机材料作为基材及封装材，利用孔隙度适中的核心结构增加核酸分子的固定量，并降低粒子的热传导性(降低热阻)，进而改善示踪粒子的温度耐受性。此外，示踪粒子亦具有耐酸及耐碱等性能，可进一步提高示踪粒子于极端环境中的耐受性及回收率。

虽然本发明的实施例及其优点已揭露如上，但应该了解的是，任何所属技术领域中具有公知常识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作更动、替代与润饰。此外，本发明的保护范围并未局限于说明书内所述特定实施例中的制程、机器、制造、物质组成、装置、方法及步骤，任何所属技术领域中具有公知常识者可从本发明揭示内容中理解现行或未来所发展出的制程、机器、制造、物质组成、装置、方法及步骤，只要可以在此处所述实施例中实施大抵相同功能或获得大抵相同结果皆可根据本发明使用。因此，本发明的保护范围包括前述制程、机器、制造、物质组成、装置、方法及步骤。另外，每一权利要求构成个别的实施例，且本发明的保护范围也包括各个权利要求及实施例的组合。本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定的保护范围为准。

序列表

<110> 财团法人工业技术研究院

<120> 示踪粒子及其应用方法与制备方法

<160> 3

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 1

taacgggtga cggaggatta gggttgctaa tacctggggc tgatgacggc gattccggag 60

agggagtaac ctgagagtac cgtaagaagc accggctaac 100

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 2

taacgggtga cggaggatt 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 3

accgtaagaa gcaccggcta ac 22