具体实施方式

下面结合实施例和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

肿瘤的微环境包括肿瘤细胞和周围的基质细胞，而基质细胞中的骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)，对肿瘤的生长、浸润和转移的作用尤为突出。外泌体是调节细胞交流的关键分子，在AML患者外周血提取的外泌体中，发现外泌体中包含白血病相关的抗原，循环外泌体中还包含有许多信号分子，这些信号分子能通过抑制免疫受体细胞，拮抗免疫受体细胞的抗肿瘤作用，提示AML细胞中的外泌体，可能通过某些信号通路，参与了AML细胞的抗化疗过程。

前期研究结果发现，提取的AML细胞的上清(AML-CM)可以增强MSCs中STAT3的磷酸化水平。进一步研究后，在AML-CM中添加外泌体抑制剂GW4869，发现它能够降低MSCs中STAT3的磷酸化水平；同时，还在AML细胞与MSCs进行共培养的体系中，也加入该外泌体抑制剂，发现MSCs对AML细胞的保护作用明显减弱，同时AML的凋亡率显著增加。以上预实验结果提示在AML的骨髓微环境中，AML细胞的外泌体可以通过调节STAT3信号通路，增强AML细胞与MSCs之间的联系。

基于以上预实验结果，提出如下假说：AML来源的外泌体可以上调MSCs中的JAK/STAT3信号通路，从而促进MSCs对AML细胞的保护作用，增强化疗抵抗，最终导致耐药形成。所以在预实验基础上，继续进行如下研究:

1)在体内外实验中进一步证实JAK/STAT3信号通路调控MSC对AML细胞化疗抵抗的作用；

2)证实AML来源的外泌体对MSCs中JAK/STAT3信号通路的上调作用，以及在介导MSC对AML细胞化疗的抵抗作用；

3)在体外实验中研究AML来源的外泌体调控JAK/STAT3信号通路的作用机理。

本研究方法将从以上三个方面进行设计，明确AML来源的外泌体对于MSCs中JAK/STAT3信号通路的调控作用及其机制，从而为临床治疗AML提供新的治疗靶点。

具体的，研究AML外泌体对AML化疗抵抗作用和机制的方法，包括以下步骤：

1)通过体内外实验证实JAK/STAT3信号通路调控MSC对AML细胞化疗抵抗的作用：

1.1)体外实验：分别分离培养MSCs与AML细胞，激活或者抑制MSCs中的JAK/STAT3信号通路，进行干预处理后，和未进行任何处理的MSCs，分别与AML细胞进行共培养，观察三组共培养细胞中，AML细胞在化疗药物干预情况下的生存情况和增殖情况。

1.2)体内实验：构建AML小鼠模型；将1.1)体外实验中分别进行激活、抑制、未处理JAK/STAT3信号通路的MSCs，通过尾静脉注射到AML小鼠体内，观察AML小鼠的一般生长情况、外周血血常规检测以及血涂片分析、小鼠骨髓象分析、肝脏病理学检测。

2)通过实验证实AML来源的外泌体对MSCs中JAK/STAT3信号通路的上调作用，以及在介导MSC对AML细胞化疗的抵抗作用：

2.1)提取AML细胞中的外泌体，和正常细胞中的外泌体，加入到MSCs细胞培养液中，检测JAK/STAT3信号通路的蛋白表达水平。

2.2)将2.1)中分别用AML细胞外泌体和正常细胞外泌体培养过的MSCs，分别与AML细胞进行共培养，并添加等量化疗药物阿糖胞苷，检查AML细胞的增殖情况和生存情况。

3)通过体外实验研究AML来源的外泌体调控JAK/STAT3信号通路的作用机理：

3.1)提取2.1)中分别用AML细胞外泌体和正常细胞外泌体培养过的MSCs中的总蛋白含量，检测VEGF、MMPs、IL-1β与TGFβ的蛋白表达水平，研究AML来源的外泌体调控JAK/STAT3信号通路的作用机制。(即明确AML细胞外泌体是通过影响哪个分子或哪几个分子的表达水平，从而影响了MSCs中JAK/STAT3信号通路。)

3.2)在3.1)完成后，对明确的信号分子进行表达干预或过表达，检测MSCs中JAK/STAT3信号通路是否被抑制或激活。(通过此步骤对该信号分子在AML来源的外泌体调控MSCs中JAK/STAT3信号通路的机制进行验证。)

实施例1

如图1所示，证实JAK/STAT3信号通路调控MSC对AML细胞化疗抵抗的作用

1.1在细胞水平证实JAK/STAT3信号通路调控MSC对AML细胞化疗抵抗的作用

1.1.1AML患者的AML细胞与健康对照者单核细胞提取

抽取初治AML患者外周血,淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,涂片,瑞特-吉姆萨染色,分类计数,AML细胞比例均≥90％。用含10％胎牛血清(fetai bovine serum,FBS)的RPMI-1640培养液将AML细胞的浓度调整为1xl0⁶/mL,置于6孔板中。在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后,离心收集培养上清液0.4μm的滤网滤去杂质,标记为pAML-S,-20℃保存备用。采用同样的方法分离培养健康人外周血单个核细胞(1x10⁶/mL),收集的培养上清液经0.4μm滤网滤去杂质,标记为Ctrl-S,-20℃保存备用,用作实验对照。

1.1.2AML患者和健康对照者骨髓分离培养人MSCs

将采集好的骨髓平均分装至两个50ml的无菌管，记为A管和B管，分别加入6％羟二基淀粉3ml，混匀后室温静置30min。将A、B管上部含有白细胞的血浆转移至新的离心管C，离心转速为400g，离心10min，然后将上清液移到新的离心管D；将D管在56℃的水浴锅中加热30分钟，灭活补体，离心转速为800g，离心20min，除去D管中絮状沉淀物，将上清液转移至新的离心管E，其上清作为自体血浆在细胞培养中添加。加入15ml生理盐水于C管中，充分混匀；取两个新的离心管，加入15ml人淋巴细胞分离液，用无菌移液管将用生理盐水稀释后的血浆15ml缓慢加入至分离液上层，23℃离心，转速为750g，离心20分钟，用1ml移液枪吸取中间白色物质至50ml新的离心管中，加入4倍体积的生理盐水混匀，离心转速为1500rpm，离心10min后弃去上清液。将离心后的细胞沉淀收集并用10ml生理盐水重悬，再1000rpm离心5分钟，重复重悬步骤一次；吸取上一步重悬的细胞10μl，等体积加入4g/L台盼蓝染色液，混匀后通过血细胞计数板，在倒置光学显微镜下进行计数；采用MEM培养基，添加10％自体血清，进行无菌实验；用培养基将悬浮的细胞密度调整至10⁵/ml，加入自体血清至血清浓度为10％，将细胞种到培养瓶中，培养3天，每24小时换液一次，弃去非贴壁细胞；等细胞融合至80-90％时，用含EDTA的0.25％胰酶消化，按4000细胞/cm²的密度进行传代，体外扩增4-5代，胰酶消化，终止后用生理盐水洗涤，22ml生理盐水稀释成人骨髓MSC细胞悬液。

1.1.3STAT3过表达慢病毒以及siRNA处理

STAT3过表达慢病毒LV5-STAT3和对照慢病毒LV5-Mock从上海吉玛制药技术有限公司购买。STAT3-siRNA由广州锐博生物公司设计并合成，合成序列如下：siRNA1:CCGTGGAACCATACACAAA、siRNA2：GATACGACTGAGGCGCCTA、siRNA3：GCACCTTCCTGCTAAGATT。

1.1.4细胞共培养以及化疗抵抗观察

将1.1.2中分离培养的健康对照者的骨髓MSCs分为三组，分别给予LV-5-STAT3、对照慢病毒、STAT3-siRNA，和AML患者的骨髓MSCs，分别与1.1.1中提取的AML患者的AML细胞进行共培养。

阿糖胞苷浓度实验：将提取的AML细胞种于48孔板中，分为5组，分别给予0μg/L、5μg/L、10μg/L、30μg/L、50μg/L的阿糖胞苷，每组进行3个复孔，CCK8法检测不同浓度阿糖胞苷处理后，AML细胞的增殖情况，选取能明显抑制AML细胞增殖的最小阿糖胞苷浓度进行后续实验。

CCK8法检测步骤：购买Engreen的CCK8试剂盒，步骤如下：

1)在96孔板中配制100μl的细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5％CO₂的条件下)。

2)向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。

3)将培养板在培养箱孵育一段48小时。

4)向每孔加入10μl CCK8溶液(注意不在孔中生成气泡，防止影响OD值的读数)。

5)将培养板在培养箱内孵育3小时。

6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

将共培养的细胞用上述最适宜浓度阿糖胞苷处理，用CCK8法检测不同组别中AML细胞的增殖情况，用MTT法检测AML细胞的存活情况。

1.2在动物水平证实JAK/STAT3信号通路调控MSCs对AML细胞化疗抵抗的作用

AML细胞株HL-60购自上海抚生实业有限公司。取出冻存AML细胞株HL-60的冷冻管速融，37℃解冻，细胞培养箱通5％CO₂，恒温37℃，解冻后HL-60接种于含100mg/L链霉素、100U/mL青霉素G和10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。常规传代培养3d，EDTA消化后注入离心管，1000r/min低速离心5min，收集AML细胞株HL-60调制成细胞数密度为1×10⁷的细胞悬液备用。

AML小鼠模型建立：SPF级，SCID小鼠60只，雌雄各半，7～8周龄，体质量20～22g。动物房要求恒温20～22℃，恒湿60％～70％，5只1笼喂养，自然光照，自由饮纯净水，食料高压灭菌。在超净台上，按100mg/kg体质量的环磷酰胺腹腔注射预处理，每日1次，注射2d，第3日取备用的AML细胞株HL-60细胞悬液，均从小鼠右侧腹部皮下单点注射(1×10⁷/鼠)，空白对照组不做处理。注射后第3周以肝脾出现肿瘤浸润、外周血白细胞达(4.03±1.92)×10⁹/L为成瘤标准。

将1.1.4中分别给予LV-5-STAT3、对照慢病毒、STAT3-siRNA的MSCs，尾静脉注射到AML小鼠和对照小鼠体内。并对各组小鼠进行如下观察与检测：

小鼠的一般情况：在实验期间按照3次每周的频率观察小鼠精神、食欲、活动能力、毛发状况、腹部肿块、体质量等情况，并做好记录。

外周血血常规检测：第25天小鼠处死前，摘眼球取血，采血量1mL/只，EDTA-K2抗凝，全自动血常规检测仪检测外周血常规。

血涂片分析：制备血涂片，瑞氏-吉姆萨染色，待干后即可镜检，中性树胶封固。

小鼠骨髓象分析：无菌分离的小鼠双侧股骨和胫骨，用PBS冲洗骨髓腔至颜色发白。吹打至细胞悬液，离心机离心细胞悬液，PBS洗涤1次，制备细胞爬片。瑞氏-吉姆萨染色，待干后即可镜检，中性树胶封固。

肝脏病理学检测：第25天处死小鼠后取新鲜肝脏，在多聚甲醛中固定，在按照设置好的乙醇浓度梯度中依次进行脱水，在二甲苯中进行透明，石蜡包埋组织块，冷冻切片后HE染色，乙醇脱水后二甲苯透明，晾干后即可镜检和封片。

实施例2

如图2所示，证实AML来源的外泌体对MSCs中JAK/STAT3信号通路的上调作用，以及介导MSC对AML细胞化疗的抵抗作用

2.1AML细胞与正常细胞中外泌体提取

采用Total Exosome Isolation Kit外泌体提取试剂盒提取1.1.1中AML患者和健康对照者血浆外泌体，并按照其说明书进行操作，详细步骤如下：

(1)取冻存的血浆样本25℃水浴溶解后，置于冰上；

(2)取500ul血浆4℃下以2000r/min离心20min，用移液枪吸取上清置新的无菌、无酶EP管，弃管底细胞及碎片；

(3)将上清4℃下以10000r/min离心20min，用移液枪吸取上清置新的无菌、无酶EP管，弃管底碎片；

(4)加入250ul无菌、无酶PBS(phosphate buffer saline)，涡旋混匀；

(5)加入25ul蛋白酶K，涡旋混匀，37℃下孵育10min；

(6)加入150ul外泌体沉淀试剂(Exosome Isolation Reagent)，涡旋混匀，4℃下孵化30min；

(7)室温下以10000r/min离心5min，去除上清液，保留管底颗粒样沉淀，即为外泌体，将所得沉淀置于80℃冻存。

2.2外泌体对MSCs中JAK/STAT3信号通路的调节作用

将2.1中提取的AML患者和健康对照者血浆中的外泌体，与1.1.2中提取的健康对照者的骨髓MSCs进行共培养，通过western blot检测共培养体系中JAK蛋白与STAT3蛋白的表达水平。

Western blot实验步骤：提蛋白：贴壁细胞胰蛋白酶消化为悬浮细胞，离心，去上清，收集细胞，加入1mlPBS，将细胞转移到1.5ml的EP管中，常温下400rmp，离心3.5min，然后倒掉上清，用PBS洗2次，最后将离心得到的细胞每管加入碧云天生产的Western细胞裂解液(RIPA)，置于冰上，裂解半小时，然后在超声破碎仪上进行超声以便去除DNA，RNA污染，超声3次，每次15s。

测蛋白浓度：采用碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒，标准品的浓度为0.5ug/ul。每个浓度设三个复孔。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl。加2ul样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20ul。各孔加入200ul BCA工作液，37℃放置30min。在酶标仪上测A570。根据结果绘制标准曲线，计算出样品蛋白浓度。

电泳：电泳时在上层胶时使用85v低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压150v恒压电泳。根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

转膜：选用PVDF膜，用前需用甲醇激活。使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为200mA，转膜时间为45～60min。转膜的效果可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。

封闭：1g脱脂奶粉+20ml TBST(1×)配成5％封闭液；转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(TBST)中，漂洗1-2min，以洗去膜上的转膜液。加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭90min。

一抗孵育：封闭结束后，用TBST洗膜3次，一次5min，然后按照适当比例(1:1000)用Western一抗稀释液稀释一抗，在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤3次，每次5min。

二抗孵育：参考二抗的说明书，按照适当比例(1:1000)用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤3次，每次5min。

蛋白检测：使用Western荧光检测试剂检测蛋白，配制显影液，曝光。

2.3外泌体介导MSCs对AML细胞化疗抵抗作用

将2.2中分别与AML患者血浆外泌体和健康对照者血浆外泌体进行共培养的MSCs，再分别与1.1.1中提取的AML患者的AML细胞去除外泌体后，进行共培养，给予1.1.4中确定浓度的阿糖胞苷溶液处理，并参考1.1.4中CCK8实验步骤，同法检测AML细胞的增殖情况。

MTT检测AML细胞存活情况：

(1)在96孔板中接种已生长至对数期的细胞，体积为50μL/孔，每孔细胞数约为5×10³～1.2×10⁴，边缘的孔用完全培养液填充。

(2)将细胞置于37℃、5％CO₂的培养箱内孵育72小时；

(3)每孔加入20μL的MTT，用移液枪吹打几下后放于培养箱中，静置2～4小时；

(4)每孔加入100μL的增溶液，用移液枪吹打几下后置于培养箱中，静置过夜；

(5)用酶标仪在570nm和650nm波长处测定每孔的光吸收值，计算各浓度细胞存活率及IC50值。计算公式为：

存活率(viability)＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％

实施例3

如图3所示，在体外实验中研究AML来源的外泌体调控JAK/STAT3信号通路的作用机理

3.1与AML来源外泌体和JAK/STAT3信号通路可能相关的信号分子研究

根据现有技术文献调研，JAK/STAT3信号通路可以诱导一些细胞因子如VEGF的产生，促进血管形成，为肿瘤细胞的增殖与迁移提供便利；促进MMPs(基质金属蛋白酶，matrixmetalloproteinases)的合成，有利于肿瘤细胞的侵袭和远端转移；促进炎症因子IL-1β与TGFβ的分泌，抑制免疫细胞对肿瘤细胞的免疫反应。

基于以上研究背景，设计实验针对VEGF、MMPs、IL-1β与TGFβ，在AML来源的外泌体调控JAK/STAT3信号通路的机制进行相关研究。

提取2.1中分别用AML细胞外泌体和正常细胞外泌体培养过的MSCs中的总蛋白含量，用westernblot检测VEGF、MMPs、IL-1β与TGFβ的蛋白表达水平，明确AML细胞外泌体是通过影响哪个分子或哪几个分子(记为X)的表达水平，从而影响了MSCs中JAK/STAT3信号通路。

3.2验证X在AML来源的外泌体调控MSCs中JAK/STAT3信号通路的作用机制

在3.1实验完成后，对AML细胞中X信号分子进行表达干预或者过表达，提取AML细胞中的外泌体，与MSCs进行共培养，通过westernblot检测JAK、STAT3蛋白表达水平，来检测MSCs中JAK/STAT3信号通路是否被抑制或激活。通过此实验，对X信号分子在AML来源的外泌体调控MSCs中JAK/STAT3信号通路的机制进行验证。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。