具体实施方式

示出了本公开的实施方案以描述本公开的技术精神。根据本公开的权利要求的范围不限于以下描述的实施方案或这些实施方案的详细描述。

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术或科学术语均具有本公开所属领域的普通知识人员通常理解的含义。本文中使用的术语只是为了更清楚地说明本公开，并不旨在限制根据本公开的权利要求的范围。

除非在包括这些表达的短语或句子中另有说明，否则本文中使用的表述“包括”、“提供”、“具有”等应被理解为开放式术语，其暗示包括其他实施方案的可能性。

本公开中使用的诸如“仅由……组成”的表述应当被理解为封闭式术语，其排除了除相应配置之外还包括其他配置的可能性。

除非另有说明，否则本文中使用的单数表述可以包括复数的含义，这同样适用于权利要求中所述的单数表述。

在本公开的一个方面，术语“约”用于包括特定数值的制造过程中的误差或落入本公开的技术思想范围内的轻微数值调整的目的。例如，术语“约”表示其所指值的±10％范围，一侧为±5％，另一侧为±2％。在本公开的领域中，该水平的近似值是合适的，除非该值被特别声明为需要更窄的范围。

下面，将给出根据本公开的一个方面的组合物的具体描述。

本公开的一个方面涉及一种组合物，所述组合物可以重新激活冻干益生菌以在益生菌的细胞表面上赋予适当的负zeta电位。作为冻干益生菌的激活剂，本公开的组合物可以通过重新激活冻干益生菌并赋予它们适当的负zeta电位而不是简单地再水化益生菌冻干物来提高肠道存活率和粘附性。zeta电位可用作细菌生存力的指标，zeta电位的变化反映了膜的损伤和渗透性的改变。去极化的zeta电位解释了完整的细胞膜。因此，本发明人首次将zeta电位概念引入冻干益生菌的再激活中，从而发现改变为负zeta电位会导致细胞再激活、从损伤中恢复并提高活力。

在本公开的一个方面，根据本公开的用于益生菌再激活的组合物可以包含选自由L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-酪氨酸和L-组氨酸组成的组中的至少一种作为激活剂，优选L-赖氨酸和/或L-酪氨酸，更优选L-赖氨酸。

在本公开中，L-赖氨酸可以是L-赖氨酸盐酸盐。

在本公开的一个方面，当激活剂溶解在溶剂中时，本公开的组合物可包含浓度为约0.01M至约0.15M、约0.01M至约0.1M、约0.02M至约0.07M、约0.02M至约0.05M或约0.03M至约0.05M的激活剂。当以低于下限的浓度使用时，激活剂可能无法充分激活冻干益生菌。在超过上限的浓度时，存在益生菌可能死亡、难以获得高浓度产品以及包含本公开组合物的产品味道变差的问题。

在本公开的一个方面，根据本公开的用于益生菌再激活的组合物可以进一步包含至少一种选自由果糖、蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖和低聚果糖的碳水化合物，优选地，低聚果糖。

在本公开中，选自由果糖、蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖和低聚果糖组成的组中的至少一种碳水化合物不仅对益生菌的冻干具有防止细胞损伤功能，而且还可以防止冻干的益生菌在再水化时遭受由渗透压引起的细胞膜损伤，并增加益生菌的肠道活力。在本公开中优选的是对激活剂赋予冻干益生菌细胞表面负zeta电位的功能没有影响的碳水化合物。

在本公开中，低聚果糖是一种功能性低聚糖，其甜味和物理性质与蔗糖相似，因此可以改善含有本公开组合物的产品的口感。作为益生元，低聚果糖可以延长保质期，对热和酸稳定，在通过胃肠道时对酸、蛋白酶和胆汁酸具有显著的抗性。由于对胃压力的抵抗力，低聚果糖可以提高益生菌的活力。此外，低聚果糖可以通过产生短链脂肪酸，在预防体重增加和肠道疾病方面提供有益的健康效果。低聚果糖还通过增加双歧杆菌等有益细菌的比例和减少人体肠道中的有害细菌，将微生物群调节至健康状态。特别是，当与氨基酸激活剂组合使用时，低聚果糖可在不平衡渗透条件下增强益生菌的抵抗力。

在本公开的一个方面，本公开的组合物可以包含约0.1g至约8g、约0.2g至约6g、约0.3g至约5g、约0.5g至约4g或约1g至约4g的量的碳水化合物。当所述碳水化合物的含量低于下限时，很难期望在益生菌冻干物再水化后对受损细胞膜的恢复产生协同效应，并难以充分提高肠道存活率和对肠道细胞的粘附。

在本公开的一个方面，本公开的组合物可以包含浓度为约1×10⁸至约1×10¹²CFU/g的冻干益生菌。

在本公开的一个方面，可以用该组合物重新激活的冻干益生菌可以是乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、片球菌属、链球菌属或其组合。具体地，本公开的冻干益生菌可以是植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳酸歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、加氏乳杆菌、屎肠球菌、丁酸梭菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、粪肠球菌、两歧双歧杆菌或其组合。

在本发明的一个方面，组合物可通过在摄入之前溶解于溶剂中而在体外重新激活，或者通过在摄入之前或之后饮用溶剂而在体内重新激活。在本公开中，当冻干益生菌被重新激活时，益生菌在其细胞表面上可具有负zeta电位。

在本公开的一个方面，冻干益生菌可以是冻干粉的形式。

在本公开的一个方面，组合物可以进一步包含一种成分，例如氨基酸(例如，L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸等)、甜菜碱、牛磺酸、核黄素、硫胺素等，它们都能够通过恢复细胞膜来提高冻干益生菌的存活率。附加成分在组合物中的含量可以使得，当所述组合物溶解在溶剂中时，所述附加成分具有0.01M-0.15M的最终浓度。

本公开的一个方面涉及一种冻干益生菌的再激活方法，其中将本公开的组合物在摄入前溶解在溶剂中以赋予益生菌细胞表面负zeta电位，由此冻干益生菌被重新激活。在一个实施方案中，冻干益生菌可以通过在摄入溶剂之前或之后摄入本公开的组合物而被重新激活。只要允许对本公开的组合物和益生菌冻干物两者再水化，就可以使用任何方法，而不受其限制。

本公开的一个方面涉及一种冻干益生菌的再激活方法，所述方法包括将冻干益生菌与激活剂接触，激活剂包括选自由L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-酪氨酸和L-组氨酸组成的组中的至少一种。

在本公开的一个方面，溶剂可以是任何可饮用的溶剂，对其没有特别限制，并且可以优选地是水。

在根据本公开的冻干益生菌再激活方法中，将本公开的组合物溶解在溶剂中以在约30分钟、约10分钟、约5分钟、约1分钟、约30秒或几秒内激活益生菌。冻干益生菌是否在短时间内被激活，可以通过向本公开的组合物中添加颜色随pH值变化的可食用染料来确定。

在本公开的一个方面，本公开的组合物可与溶剂混合，溶剂的量是组合物重量的0.1至20倍，尤其是组合物重量的0.5至15倍或1至10倍。举例来说，溶剂的用量可为每10g组合物1-200ml、5-150ml或10-100ml。

本公开的一方面涉及包含本公开组合物的益生菌产品。在本公开的一个方面，包含本公开组合物的益生菌产品可以以冻干益生菌和其他成分的单独包装形式或以冻干益生菌和其他成分的集成包装形式提供。包含本公开组合物的益生菌产品可以以小袋或胶囊的形式提供。在本公开的一个方面，根据适当的说明，本公开的组合物可以在摄入之前溶解在溶剂中以重新激活冻干益生菌，或者可以在摄入溶剂之前或之后摄入以重新激活冻干益生菌。

本公开的一方面涉及筛选能够重新激活冻干益生菌的物质的方法，所述方法包括选择赋予冻干益生菌的细胞表面负zeta电位的物质。赋予冻干益生菌细胞表面负zeta电位的物质可以重新激活冻干益生菌，帮助增加存活率和对肠细胞的粘附，并恢复受损的细胞膜。

[实验例1]筛选能够通过赋予冻干益生菌细胞表面负Zeta电位来重新激活冻干益生菌的成分

在本实验例中，将在韩国专利申请第10-2017-0051574号中描述的植物乳杆菌HAC03(登录号：KCTC13242BP，韩国生物科学与生物技术研究所)(以下简称“HAC03”)用作益生菌菌株。

以1x10⁹ CFU/g的浓度将冻干的HAC03菌株粉末转移到50mL试管中，并与九种单一氨基酸成分(L-酪氨酸、L-鸟氨酸、苹果酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-抗坏血酸、L-精氨酸和脯氨酸)中的每一种混合以形成0.1M的最终浓度。向冻干的HAC03和单一成分的混合物中加入1mL DW并再水化1分钟。然后，将2mL pH 2.5的蒸馏水加入每个样品中，使用0.1N HCl重新调节pH，并将800μL校准样品装入DTS1080比色皿中。平衡2分钟后，通过Zetaizer Nano ZEN 3600(Malvern Panalytica,UK)测量电泳迁移率，并使用Smoluchowski方程将数据转换为zeta电位值。转换后的zeta电位值如图1所示。

在本实验中，考虑到高酸性的胃环境(这是显著降低细菌生存能力的最初障碍之一)，在pH值为2.5的条件下测量zeta电位。如图1所示，在HAC03冻干后，与新鲜培养的细胞相比，细菌细胞的zeta电位明显去极化。当细菌与九种氨基酸成分中的每一种混合时，L-酪氨酸、L-鸟氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸产生负zeta电位，就像在新鲜培养的HAC03中一样。然而，剩余的五种成分L-精氨酸、L-天冬氨酸、苹果酸、L-抗坏血酸和脯氨酸不能将去极化的zeta电位变为负值，而是表现出正的zeta电位。

[实验例2]通过赋予细胞表面负Zeta电位的成分增加冻干益生菌的肠道活力

使用根据Ji等人(Food control 31(2):467-473,2013)的体外模拟胃十二指肠通道(SSDP)(带有一些修改)评估实验例1中使用的HAC03菌株和八种成分的益生菌活性(耐酸性和胆汁抗性)。将HAC03菌株与每种单一成分和1mL蒸馏水混合1分钟。将这些成分配制成在1mL蒸馏水中溶解时的最终浓度为0.1M。此后，向每种混合物中添加9mL pH值被调整为2.5的蒸馏水。如果由于某些单一成分的性质导致pH值升高，则将pH值重新调整回2.5(为了不影响益生菌的存活)。将pH值调节至2.5后，将试管在37℃下培养1小时以施加低pH值胃压力状态。然后，将菌株在4mL胆盐(10％牛胆汁)和17mL pH 6.0合成十二指肠汁(6.4g/LNaHCO₃、0.239g/L KCl和1.28g/L NaCl)的条件下培养2小时，模拟小肠通道。在胃肠道测试期间，在培养后立即、1小时和3小时(t＝0、1和2)采集样品。通过计数活菌落，来计算每个样品在胃压力和胆汁压力后的益生菌存活率。测量结果总结见下表1。

表1

从表1的数据可以看出，当与赋予负zeta电位的四种成分(L-鸟氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸和L-组氨酸)一起培养时，与新鲜细菌相比，冻干益生菌的耐酸性和耐胆汁性增加，从而表现出改善的肠道存活率。相比之下，不能将zeta电位转变为负值的四种成分(精氨酸、抗坏血酸、天冬氨酸和苹果酸)使益生菌冻干物的肠道存活率远低于蒸馏水(存活率3.40％)。这些数据表明，赋予冻干益生菌细胞表面负zeta电位的物质对冻干益生菌的肠道存活率具有显著的积极影响。

[实验例3]能够重新激活冻干益生菌的成分的肠粘附性测定

在冻干益生菌中赋予负zeta电位和增加肠道存活率的四种成分中，在实验例2中表现出最高存活率的L-赖氨酸用于重新激活冻干益生菌以评估对细胞粘附到肠道的影响。本实验例考察了冻干益生菌的重新激活作用是否适用于各种菌株。就这一点而言，冻干的长双歧杆菌Bl-05(Dupont；以下简称为“Bl-05”)、植物乳杆菌Lp-115(Dupont；以下简称为“Lp-115”)、干酪乳杆菌Lc-11(Dupont；以下简称为“Lc-11”)和7-菌株混合物(400B)(Dupont；以下简称为“MIX”)用L-赖氨酸重新激活，然后测定它们粘附于人肠细胞样Caco-2/TC-7细胞系的能力。7-菌株混合物是指下表2中列出的7种菌株的混合物。在本实验例中，脯氨酸在冻干HAC03的细胞表面保持正zeta电位，用作对照。

表2

将三种菌株和7-菌株混合物的冻干物调整为2x10⁸ CFU/g，并与0.03M L-赖氨酸或0.03M脯氨酸混合。将沉淀用1x PBS洗涤3次，并在10mL MEM细胞培养基中重悬，该培养基补充有20％FBS、2mM谷氨酰胺和1％非必需氨基酸。根据带有一些修改的Botes等人的方法(Arch.Microbiol,190(2008),pp.573-584)，进行细菌粘附测定。为了评估细菌细胞粘附，在37℃下在5％CO₂和95％空气中用2mL的各细菌悬浮液对1×10⁵CFU/Caco-2/TC-7单层处理1.5小时。将细胞用冷PBS洗涤3次以去除未附着的细菌，并通过添加40ng胰蛋白酶(Promega)在37℃下裂解15分钟。为了测量附着在Caco-2/TC-7细胞上的细菌数量，将样品连续稀释，在MRS琼脂平板上培养48小时(37℃)，然后计数以测量相对粘附率(测试组中附着细菌的计数与对照中附着细菌的计数之比)。结果在图2中描述。所有实验一式三份进行。

从图2中可以看出，与新鲜细胞(新鲜的)相比，Lc-11(图2A和2E)、Bl-05(图2B和2F)和Lp-115(图2C和2G)的冻干形式(FD)对Caco-2/TC-7细胞系的粘附性明显较低。。与冻干形式相比，用L-赖氨酸再激活显著增加了细菌细胞粘附。该结果也在7-菌株混合物(400B)中重复(图2D和2H)。然而，与在冻干益生菌的细胞表面上赋予正zeta电位的脯氨酸(对照)混合的冻干形式的肠道粘附性明显低于冻干形式本身(Lc-11、Bl-05、MIX)和那些用L-赖氨酸(Lp-115)重新激活的形式。换句话说，当用能够在其细胞表面赋予负zeta电位的物质(例如L-赖氨酸)重新激活冻干益生菌时，对肠道的粘附增加，而赋予正zeta电位的物质没有表现出改善的粘附作用。总之，数据表明细胞表面的负zeta电位与肠道粘附的改善相关。

[实验例4]可与冻干益生菌激活剂一起使用的其他成分

进行了一项测试，以检查可与能够在冻干益生菌的细胞表面上赋予负zeta电位的激活剂成分一起使用的成分。将HAC03冻干剂与下表3中列出的11种碳水化合物中的每一种混合，并以与实施例1相同的方式测定肠道存活率。结果总结在下表3中。

表3

从表3中可以看出，果糖、蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖和低聚果糖这七种成分使得存活率与新鲜细胞相似或更高，并观察到它们比新鲜细胞具有更高的胆汁抵抗力。因此，这些成分可与激活剂一起使用，以重新激活益生菌冻干物并提高其肠道存活率。

[实验例5]用本发明组合物再激活冻干益生菌后的存活率测定

进行实验以检查本公开的组合物对冻干益生菌再激活的影响。首先，根据下表4中列出的组合物制备本公开的组合物(下文缩写为“Zeta-bio组合物”)以包含L-赖氨酸、低聚果糖(FOS)和微生物(益生菌)。低聚果糖经测量具有接近0mV的zeta电位，因此不影响本公开内容的冻干益生菌的zeta电位。冻干Lp-115和MIX用作冻干益生菌。

表4

表4中的Zeta-bio组合物通过体外模拟胃十二指肠通道(SSDP)测定益生菌存活率，如实验例2。表4中的Zeta-bio组合物各自与1mL蒸馏水在25℃混合1分钟。就这一点而言，Zeta-bio组合物被制备为包括浓度为0.01M、0.02M、0.03M、0.04M或0.05M的L-赖氨酸(当溶解在1mL蒸馏水中时)。然后，将9mL调节至pH 2.5的蒸馏水加入到每个混合物中，当pH由于某些成分的性质而增加时，重新调整回pH 2.5(以排除对益生菌存活的任何影响)。将试管在37℃下培养1小时以对其应用低pH的胃压力。随后，将试管暴露于4mL胆汁盐(10％牛胆汁)和17mL pH 6.0的合成胆汁(6.4g/L NaHCO₃、0.239g/L KCl和1.28g/L NaCl)中2小时以模拟小肠通道。在胃肠道测定期间，在暴露后立即、1小时和3小时(t＝0、1和2)采集样品。通过计数活菌落来计算每个样品在暴露于胃压力和胆汁压力后的益生菌存活率。测量结果总结见下表5。

表5

从表5中可以看出，在SSDP后，与新鲜细胞对照(新鲜)相比，Lp-115冻干形式的存活率显著降低(0.02％)。当用含有0.03M或更高浓度的L-赖氨酸的Zeta-bio组合物重新激活时，冻干的Lp-115在胃压力和胆汁压力下表现出与新鲜细胞相似或更高的存活率。用具有0.03M或更高浓度的L-赖氨酸的Zeta-bio组合物激活也保证了冻干的7-菌株混合物(400B)在胃压力和胆汁压力下的高存活率。因此，与冻干益生菌本身相比，用具有0.03M或更高浓度的L-赖氨酸的Zeta-bio组合物激活的益生菌冻干物在通过胃肠道后表现出更高的存活率。

[实验例6]用本发明组合物再激活冻干益生菌后肠粘附性的测定

进行实验以检查本公开的Zeta-bio组合物对冻干益生菌肠粘附的影响。当通过与实验例3中相同的对粘附于人肠细胞样Caco-2/TC-7细胞系的能力的测定进行测量时，观察到表3中的Zeta-bio组合物增加冻干LP-115和MIX中的肠粘附。结果如图3所示。

从图3中可以看出，在细菌细胞对Caco-2/TC-7细胞系的粘附方面，Lp-115(图3A和3B)的冻干形式(FD)显著低于新鲜细胞(新鲜)。然而，与冻干形式相比，用Zeta-bio组合物(LP-3到LP-5)再激活显著恢复了细菌细胞粘附。与冻干形式相比，Lp-115在所有测试的L-赖氨酸浓度下都表现出更高的肠粘附性。同样，当用分别含有0.03M和0.04M浓度的L-赖氨酸的MIX-3和MIX-4组合物重新激活时，7-菌株混合物(400B)表现出显著的高粘附性。因此，根据本公开的含有L-赖氨酸的组合物可以重新激活冻干益生菌，并增加冻干益生菌的存活率和肠粘附性。

[实验例7]根据L-赖氨酸浓度测定用本发明组合物再激活的冻干益生菌的存活率

进行实验以检查具有0.1M或更高浓度以及0.01M至0.05M浓度的L-赖氨酸的Zeta-bio组合物(如表2所示)对用其再激活的冻干益生菌的存活率的影响。本实验例中使用的Zeta-bio组合物在配置和含量方面与表2中的那些相同，但L-赖氨酸浓度不同，并对于MIX-6、MIX-7、MIX-8、MIX-9或MIX-10，制备为溶解于1mL蒸馏水中时分别包含浓度为0.1M、0.15M、0.3M、0.15M或3M的L-赖氨酸。

通过如实验例5所示的体外模拟胃十二指肠通道(SSDP)测定Zeta-bio组合物的益生菌存活率(耐酸性和耐胆汁性)。测量结果总结在下表6中。

表6

从表6中可以看出，含有浓度分别为0.03M、0.1M和0.15M的L-赖氨酸的组合物MIX-3、MIX-6和MIX-7对胃酸表现出57％或更高的显著存活率，对胆汁酸表现出11％或更高的显著存活率。因此，从实验例5和本实验例的数据可以理解，与冻干益生菌本身相比，用具有0.01到0.15M的激活剂(例如在其细胞表面上赋予负zeta电位的赖氨酸)的Zeta-bio组合物处理的冻干益生菌，通过胃肠道后表现出更高的存活率。

用本公开组合物再水化益生菌冻干物赋予负zeta电位以重新激活细胞，从而提高其中的存活率。本公开的组合物被认为通过向受损细胞提供营养物和必需细胞成分而在促进受损细胞恢复中起作用。此外，细胞活力的增加和zeta电位的改变可能会提高益生菌对肠细胞的粘附率。因此，即使在暴露于胃和胆汁压力之后，用本公开的Zeta-bio组合物再激活冻干益生菌产品也可以提高益生菌的活力，并且由于细菌对肠细胞的粘附增加而可以恢复其有益效果。

虽然本公开的技术精神已经通过一些实施方案中描述的和附图中所示的示例来描述，但是应当注意，在不脱离本公开所属领域的技术人员能够理解的本公开的范围的情况下，可以进行各种替换、修改和改变。此外，应当注意的是，这种替换、修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。