一种治疗缺血性脑卒中的中药提取物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种治疗缺血性脑卒中的中药提取物及其制备方法和应用 (Traditional Chinese medicine extract for treating cerebral arterial thrombosis and preparation method and application thereof ) 是由 颜丙春 夏子豪 沈萌萌 盛鹏 赵林 于 2021-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种治疗缺血性脑卒中的中药提取物及其制备方法和应用,中药提取物为崧筋藤中乙酸乙酯部位；该中药提取物的制备方法：取干燥的崧筋藤药材,打粉机粉碎研磨成粗粉；用药材重量8倍量的95％的乙醇对崧筋藤粉末进行85℃下回流提取,将提取液过滤,得到滤液和滤渣；加入生药材重量5倍量95％的乙醇对滤渣进行提取过滤,混合滤液用蒸发器进行减压浓缩至无醇味并干燥,得到浸膏；依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液；乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥,得到崧筋藤中乙酸乙酯部位。通过本发明,能够减少脑梗死体积、增加脑血流量,增强缺血性脑卒中空间学习记忆能力。(The invention relates to a traditional Chinese medicine extract for treating ischemic stroke and a preparation method and application thereof, the traditional Chinese medicine extract is an ethyl acetate part in stem of cabbage; the preparation method of the traditional Chinese medicine extract comprises the following steps: pulverizing dry stem of cabbage into coarse powder; performing reflux extraction of caulis Seu folium Brassicae Capitatae powder with 95% ethanol 8 times the weight of the medicinal materials at 85 deg.C, and filtering the extractive solution to obtain filtrate and residue; adding 95% ethanol 5 times the weight of the crude drugs to extract and filter the filter residue, concentrating the mixed filtrate under reduced pressure by using an evaporator until no alcohol smell exists, and drying to obtain an extract; sequentially extracting with petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol of equal volume to obtain petroleum ether extract, ethyl acetate extract and n-butanol extract; the ethyl acetate extract is concentrated under reduced pressure and dried to obtain the ethyl acetate fraction of the stem of cabbage. The cerebral infarction volume can be reduced, the cerebral blood flow can be increased, and the learning and memory capacity of the cerebral arterial thrombosis space can be enhanced.)
技术领域
本发明涉及一种治疗缺血性脑卒中的中药提取物及其制备方法和应用，属于中药技术领域。
背景技术
缺血性脑卒中(Cerebral Ischemic Stroke, CIS)约占脑卒中的80%，具有高发生率、高死亡率和高致残率的突出特点，是医学关注的一个重大公共健康问题。目前，通过溶栓或血管内取栓以达到恢复血流的目的是治疗急性缺血性脑卒中最主要、最有效的方法，但因其时间窗或技术限制导致其受益面极窄，即使患者成功接受溶栓或取栓治疗，受再通率、血管再通但无效血流、再灌注损伤等多因素影响，患者卒中后预后仍不尽人意。因此，血管新生和神经保护仍然是大部分缺血性脑卒中患者的防治及康复的主要的治疗原则及方向，血管新生及神经保护剂的研究有着十分迫切的需求。
崧筋藤是茜草科九节属植物，别名蔓九节、拎壁龙、风不动藤、穿根藤、娱蚣藤和上树龙等，产于浙江东南部、福建东部及南部、台湾、广东、香港、海南、广西及云南东南部。药用部位为干燥的带叶茎枝，具有舒筋活络、祛风止痛、凉血消肿等功效，常用于风湿痹痛、坐骨神经痛、痈疮肿毒、咽喉肿痛等症的治疗。截止目前，有关崧筋藤中的化学成分及其药理活性的研究报道较为罕见，尤其是在神经药理方面的研究少之又少，因而也没有研究报道其在制备治疗缺血性脑卒中药物中的用途。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种治疗缺血性脑卒中的中药提取物及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种治疗缺血性脑卒中的中药提取物，其特征在于：所述中药提取物为崧筋藤提取物，崧筋藤提取物为崧筋藤中乙酸乙酯部位。
一种治疗缺血性脑卒中的中药提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）取干燥的崧筋藤药材，中药打粉机粉碎研磨成粗粉；
（2）用药材重量8倍量的95％的乙醇对所述崧筋藤粉末进行85℃下回流提取3小时，将所获得的提取液过滤，得到滤液和滤渣；
（3）加入相当于生药材重量5倍量95％的乙醇对滤渣进行回流提取，并过滤，将所得到的滤液与步骤2)中的滤液进行混合，得到混合滤液；
（4）对步骤（3）得到的混合滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩至无醇味并干燥，得到浸膏；
（5）将步骤（4）得到的浸膏溶解于10倍量蒸馏水中，并依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和剩余水层；
（6）对步骤（5）得到的乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩并干燥，得到崧筋藤中乙酸乙酯部位，即治疗缺血性脑卒中的中药提取物。
利用一种治疗缺血性脑卒中的中药提取物的应用。
所述崧筋藤中乙酸乙酯部位在制备减小脑梗死体积药物中的应用。
所述崧筋藤中乙酸乙酯部位在制备改善认知功能障碍，增强空间学习记忆能力药物中的应用。
所述崧筋藤中乙酸乙酯部位在制备保护神经元细胞药物中的应用。
所述崧筋藤中乙酸乙酯部位在制备促进血管新生改善侧支循环药物中的应用。
所述崧筋藤中乙酸乙酯部位在制备保护血脑屏障药物中的应用。
所述崧筋藤中乙酸乙酯部位为单组份或复方制剂。
本发明观察崧筋藤中乙酸乙酯部位对缺血性脑卒中小鼠模型的神经保护作用。
本发明通过TTC染色、Morris水迷宫实验、免疫组织化学染色方法观察小鼠脑梗死体积、小鼠的空间学习记忆能力及神经元死亡情况。实验结果显示，崧筋藤提取物显著减少小鼠脑梗死体积、增加脑血流量，增强缺血性脑卒中小鼠空间学习记忆能力，减少小鼠海马区神经元的死亡。
本发明观察崧筋藤提取物对缺血性脑卒中后侧支循环再构建及半暗带区血管生成的促进作用。
本发明应用免疫组织化学染色、Western Blot方法观察崧筋藤提取物对小鼠血脑屏障的影响。免疫组化结果显示，崧筋藤提取物显著增加缺血性脑卒中后小鼠半暗带区血小板内皮细胞黏附分子(CD31)、血管内皮生长因子(VEGFR2)的表达；Western Blot结果显示，崧筋藤提取物显著增加小鼠半暗带区紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5的表达。
本发明的有益效果：本发明首次发现崧筋藤具有治疗缺血性脑卒中作用，是崧筋藤的新用途，扩大了其临床应用范围，有望对缺血性脑卒中的新药研发提供依据。
附图说明
图1为崧筋藤提取物对小鼠脑梗死体积及空间学习记忆能力的影响（*p< 0.05，与Sham组相比有统计学意义；#p< 0.05，与MCAO组相比有统计学意义）。注：(A)TTC染色；(B)梗死体积百分比柱状图；(C)Longa评分柱状图；(D)造模24h后水迷宫代表轨迹图；(E)逃逸潜伏期柱状图。
图2为缺血性脑卒中后，小鼠海马CA1区Neun、CD31、VEGFR2免疫组织化学染色情况（*p< 0.05，与Sham组相比有统计学意义；#p< 0.05，与MCAO组相比有统计学意义）。(A)海马CA1区Neun免疫组织化学染色；(B)海马CA1区CD31免疫组织化学染色；(C)海马CA1区VEGFR2免疫组织化学染色；(D) Neun细胞数量百分比柱状图；(E) CD31细胞数量百分比柱状图；(F) VEGFR2细胞数量百分比柱状图。
图3为缺血性脑卒中后，小鼠半暗带区紧密连接相关蛋白的表达情况（*p< 0.05，与Sham组相比有统计学意义；#p< 0.05，与MCAO组相比有统计学意义）。注：(A) ZO-1、Claudin5蛋白印迹条带图；(B) ZO-1蛋白灰度值比值结果；(C) Claudin5蛋白灰度值比值结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
崧筋藤(Psychotria serpens L.，SJT)由扬州大学医学院中西医结合老年病防治重点实验室购买自广西中药材市场，为崧筋藤的干燥茎枝，样品保留于扬州大学医学院中西医结合老年病防治重点实验室。取干燥的崧筋藤药材15kg，粉碎研磨成粗粉，用95％的乙醇85℃热回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到稠状浸膏，浸膏溶解于水中，采用乙酸乙酯萃取得到崧筋藤乙酸乙酯部位。
实施例2：动物模型制备
本发明采用国际学术界公认的雄性8周龄雄性ICR小鼠，体重18～22g，2～3月龄，购自扬州大学比较医学中心，保持适当温度(23℃)和湿度(60％)，12小时光照/12小时黑暗环境，适应性饲养1周。
实验试剂：异氟烷（瑞沃德科技有限公司）；
实验仪器：MCAO线栓（北京西浓科技有限公司），小动物麻醉机（美国Midmark公司）
1)分组：正常对照组(Sham组)、正常给药组(Sham+SJT组)、模型组(MCAO组)、模型给药组(MCAO+SJT组)(SJT,100mg/kg)，n＝30。
2)造模(MCAO)：选用健康雄性ICR小鼠，术前12小时禁食不禁水，先由33%O2、67%N2O及2.5%异氟烷混合气体持续麻醉，常规备皮及碘伏消毒后，沿颈部正中线先切开，暴露颈部筋膜、腺体及肌肉，分离左侧颈总动脉(Common carotid artery CCA)、颈外动脉(externalcarotid artery ECA)、颈内动脉(internal carotid artery ICA)及迷走神经，结扎ECA远心端，并穿一根细线打活节备用，用动脉夹暂时夹闭CCA近心端及ECA远心端，在靠近ECA的夹闭处用眼科剪剪一“V”型切口，下拉 ECA使其与ICA成一条直线，将栓线插入ECA,在进入ICA时松开ICA的动脉夹，栓线 顺着血管的方向慢慢进入颅内，并检测防止插入颞动脉，到达预计位置后结扎并剪断部分栓线，松开动脉夹，检测手术创口，消毒，于45min后拔出栓线，结扎细线。此外，手术全过程，使用保温毯维持体温在37摄氏度左右，直至动物复苏。
3)给药：在造模结束后，选取造模成功的小鼠，造模给药组于MCAO手术后6h、12h、18h灌胃给予崧筋藤提取物，正常给药组选取同一时间间隔灌胃给予崧筋藤提取物，正常对照组选取同一时间间隔灌胃给予等体积的生理盐水。
实施例3：TTC染色以及脑梗死体积的测定；
实验试剂：2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)（美国Sigma 公司）
本部分采用实施例2所述动物模型，小鼠脑缺血再灌注24h后，麻醉小鼠并快速处死，轻轻取出脑组织。将小鼠大脑放入脑槽中，每2mm冠状位切下。然后将这些脑片置于37℃下，2% TTC染液中染色30分钟，期间注意避光。染色结束后，将脑片固定在4%多聚甲醛中，4℃冰箱过夜。脑切片的红色部分表示正常区域，白色部分表示梗死区域。用Image-Pro Plus6.0软件对拍摄的TTC染色照片进行测量分析，脑梗死体积=脑片厚度（2mm）×面积。
结果如图1A、B所示，与造模组(约占全脑的40%)相比，造模给药组(约占全脑的12%)小鼠脑梗死体积显著减小。
实施例4：神经功能评分；
本部分采用实施例2所述动物模型，采用Longa 评分法对各组小鼠进行神经功能评分，参照标准分为5个等级：1）0分：无神经功能缺损；2）1分：小鼠左前肢屈曲（瘫痪侧）；3）2分：行走时，小鼠向瘫痪侧转圈；4）3分：行走时，小鼠偏瘫；5）4分：小鼠不能自发行走，失去意识。在规定的时间内进行随机评估试验，得分大于1意味着MCAO模型建立成功。
结果如图1C所示，造模组小鼠得分较高（神经功能为3.5分），而造模给药组小鼠的神经功能评分较佳（1分左右）。
实施例5：Morris 水迷宫实验；
对各组小鼠组进行了行为测试，评估学习和记忆能力。在设备中装满水(25±1℃)，并在实验开始前使动物熟悉环境。第1天，让所有小鼠自由游泳。在第2天到第7天，小鼠需要借助几个空间距离线索找到唯一一个水下平台，平台被隐藏在水面下1.5厘米处，训练小鼠(n=7)在60s内找到平台，若小鼠没有在规定时间内找到平台，则将小鼠置于平台上休息15s。记录航行距离，潜伏期和游泳速度。从第8天到第12天，并且每天对每个小鼠进行4次试验，每条步道最多60s。记录爬上隐藏平台的等待时间以评估学习能力。在13天，动物接受了探查试验。移除隐藏的平台，并记录沙鼠越过隐藏平台先前所在位置的次数以测试记忆功能。
结果如图1D、E显示，与造模组相比，造模给药组潜伏逃逸时间明显缩短，穿越平台次数增加，轨迹较清晰，目的明确。提示造模给药后，小鼠神经功能障碍减轻，空间学习记忆能力增强。
实施例6：免疫组织化学染色；
试剂：兔抗Neun(1:1000 ,abcam，USA)，兔抗CD31(1:50 ,abcam，USA)、兔抗VEGFR2(1:1000 ,abcam，USA)，辣根过氧化物酶标记的二抗：山羊抗兔-HRP(1:1000，Santa Cruz，USA)，显微镜用中性树胶（北京索莱宝科技有限公司）；
本部分采用实施例2所述动物模型，采用ABC-DAB 免疫组织化学方法染色。为了消除内源性过氧化物酶的活性，脑组织切片先用0.3%过氧化氢（H2O2）孵育20min，接着在5%的BSA中处理30分钟。然后，将这些脑片浸于稀释的兔抗Neun、CD31、VEGFR2，4℃冰箱过夜。此后，将它们与生物素化的山羊抗兔IgG共孵育90分钟，用DAB进行显色，并依次将组织粘附在显微镜载玻片上。最后，经梯度酒精和二甲苯脱水后，用中性树脂进行封片。用免疫血清代替一抗进行阴性对照试验，以确定免疫染色的特异性，且本实验程序中涉及的所有溶液均由0.01 M PBS稀释配制。根据OD值来评估Neun免疫反应性，计算公式即OD=log（256/平均灰度）。Adobe Photoshop version 8.0和NIH image1.59软件分别用来校正相对OD值和分析结果。
结果如图2A、D所示，造模组小鼠海马CA1区很难观察到Neun阳性神经元（约为10%），而给药干预后可明显减轻Neun神经元的损伤，Neun阳性增加至52%左右。图2B、E显示,造模组CD31表达较正常对照组增加一倍，造模给药组CD31表达增加更加显著，约为正常对照组的7.5倍。图2C、F显示,与正常对照组相比，正常给药组VEGFR2略微增加，为正常对照组的1.2倍左右，造模组VEGFR2表达较正常对照组明显增加，约为正常对照组的2.3倍，造模给药组VEGFR2表达增加更加显著，为正常对照组的4倍左右。说明给药干预后可以减少神经元的死亡，促进血管新生。
实施例7：蛋白印迹实验；
试剂：BCA法蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物科技有限公司），兔抗ZO-1(1:1000,abcam，USA)、兔抗Claudin5(1:1000 ,abcam，USA)，兔抗β-actin(1:1000，Santa CruzBiotechnology，USA)，辣根过氧化物酶标记的二抗：山羊抗兔-HRP(1:3000，Santa Cruz，USA)；
本部分采用实施例2所述动物模型，小鼠脑缺血再灌注24h后，麻醉小鼠并处死，取脑，将缺血侧海马区分离出来，置于冰上。用全蛋白提取试剂盒充分裂解半暗带区组织。离心分离后，吸收上清液，并根据BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便将每个样品调整为等量蛋白质（40μg）。然后在样品中加入相应的还原性Loading buffer，于100℃水浴锅中煮5min使蛋白变性。变性的蛋白经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转移到PVDF膜上。为了防止非特异性蛋白结合位点与抗体结合，将PVDF膜置于含有0.1% Tween 20及5% BSA的TBS中封闭90分钟。按相应的分子量切取PVDF膜，分别与兔抗ZO-1、Claudin5、β-actin孵育，4℃冰箱过夜。与相应的二抗在室温下孵育2h，然后将PVDF膜暴露于超敏ECL化学发光试剂中并通过Bio-Rad自动凝胶成像系统进行可视化分析。最后用Image Pro Plus 6.0对条带进行灰度值分析来评价蛋白的相对表达水平。
结果如图3所示，正常给药组紧密连接蛋白ZO-1、Claudin5表达较正常对照组轻微增加，造模组ZO-1、Claudin5表达显著减少，造模给药组脑ZO-1、Claudin5表达较造模组明显增加。说明给药干预后可以保护血脑屏障的完整性。
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