一种非离体胰岛素控释药物的包载设备及包载方法
阅读说明：本技术 一种非离体胰岛素控释药物的包载设备及包载方法 (Entrapment equipment and entrapment method for non-isolated insulin controlled-release drug ) 是由 夏栋林 冯灵子 李佳 陈超 顾海鹰 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种非离体胰岛素控释药物的包载设备,该包载设备用于血液透析器,包括：红细胞载药段,引入动脉全血,进行胰岛素包载,送至药物开关组装段；药物开关组装段,对包载胰岛素后的血液进行葡萄糖酶修饰,送至血液透析器。本发明以非离体方式进行胰岛素药物包载给药,利用患者自身的红细胞作为药物载体,充分利用了红细胞药物载体的优势,有效延长药物作用时间,同时避免了输血感染问题的出现。(The invention discloses an entrapment device of non-isolated insulin controlled release medicine, which is used for a hemodialyzer and comprises: the red blood cell loading section introduces whole arterial blood, carries out insulin entrapment and sends the whole arterial blood to the drug switch assembly section; and a drug switch assembly section for carrying out glucolase modification on the blood after the insulin is encapsulated and sending the blood to a hemodialyzer. The invention carries out insulin drug loading and administration in a non-isolated mode, utilizes the erythrocytes of patients as drug carriers, fully utilizes the advantages of the erythrocyte drug carriers, effectively prolongs the drug action time, and simultaneously avoids the occurrence of transfusion infection.)
技术领域
本发明涉及一种可采用非离体红细胞胰岛素给药方式的药物包载技术。
背景技术
糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一。血液透析可以延缓肾功能衰竭，帮助肾脏排泄人体代谢所产生的废毒物，维持生命。血液透析是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一。它通过将体内血液引流至体外，经一个由无数根空心纤维组成的透析器中，血液与含机体浓度相似的电解质溶液(透析液) 在一根根空心纤维内外，通过弥散/对流进行物质交换，清除体内的代谢废物、维持电解质和酸碱平衡；同时清除体内过多的水分。但是血液透析只能暂时性的控制血糖。因此糖尿病肾病病人需要定期做进行透析治疗，血糖控制还是需要定期注射胰岛素来控制。
红细胞载药体系作为一种较为新型的载药方式，具有延长药物的全身作用时间，减少药物的不良反应等优点。但现有红细胞载药体系给药均采用离体方式，红细胞来源较为紧张，同时给药后可能出现输血感染等问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种即能有效控制药物释放，又能避免出现输血感染等问题的新型药物包载方式。
为了达到上述目的，本发明提供了一种非离体胰岛素控释药物的包载设备，该包载设备用于血液透析器，包括：
红细胞载药段，引入动脉全血，进行胰岛素包载，送至药物开关组装段；
药物开关组装段，对包载胰岛素后的血液进行葡萄糖酶修饰，送至血液透析器。
本发明采用的非离体载药设备，于患者血透的同时进行胰岛素给药操作，充分利用了红细胞载药体系的优势，同时由于采用的是患者自身的红细胞进行载药，避免了输血感染的情况，并通过进行红细胞表面葡萄糖酶修饰，达到血糖控释作用。
进一步的，红细胞载药段包括红细胞载药反应器、蠕动泵、低渗反应器、高渗反应器、等渗反应器；药物开关组装段包括GOx反应器；红细胞载药反应器内置半渗透袋，半渗透袋的两端通过导管伸出红细胞载药反应器外，并分别与动脉血取血端和GOx反应器相连通；半渗透袋上设有胰岛素注入口；红细胞载药反应器上设有胰岛素包载循环出口、胰岛素包载循环入口、GOX反应出口；胰岛素包载循环出口通过蠕动泵后，分为三路，通过导管分别经由低渗反应器、高渗反应器和等渗反应器后，与胰岛素包载循环入口相连通；GOx反应器的两端通过导管分别与GOx反应出口和血液透析器的动脉血取血端相连通；半渗透袋采用半渗透膜制备；低渗反应器、高渗反应器和等渗反应器的两端导管上、GOx反应器的两端导管上、半渗透袋与动脉血取血端连接的导管上均设有导管夹。
本发明通过低渗-高渗-等渗对胰岛素进行红细胞包载，利用红细胞载药反应器内置半渗透袋，并结合导管夹、低渗反应器、高渗反应器和等渗反应器的设置，使得低渗-高渗-等渗各步骤能够依次进行循环流动式反应，缩短了反应时间，与患者血透时间有效同步。
在部分实施例中，作为优选的，低渗反应器、高渗反应器、等渗反应器上均设有反应液注入口；GOx反应器上设有反应液注入口。
用各反应液注入口的设置，可有效推注对应的反应液。该反应液注入口可采用注射袋用橡胶塞式注射口，方便注入液体，同时能保持密封性。
在部分实施例中，作为优选的，红细胞载药反应器呈袋状；低渗反应器、高渗反应器、等渗反应器呈袋装；GOx反应器采用塑料管。
本发明非离体胰岛素控释药物的包载设备为一次性设备，避免患者交叉感染。其中红细胞载药反应器、低渗反应器、高渗反应器、等渗反应器采用袋式设计，GOx反应器采用医用塑料管式设计，成本低。
在部分实施例中，作为优选的，包载设备还包括低渗温控设备和高渗温控设备，分别对低渗反应器、高渗反应器进行温度控制。
在部分实施例中，作为优选的，低渗温控设备采用恒温箱，低渗反应器置于恒温箱内；高渗温控设备采用水浴锅，高渗反应器置于水浴锅内。
本发明还提供了进行非离体胰岛素控释药物的包载方法，包括以下步骤：
(1)胰岛素包载：从动脉引血至红细胞载药反应器的半渗透袋中，并向半渗透袋内注入胰岛素溶液，通过低渗反应器将低渗液循环引入红细胞载药反应器内，循环反应2-3h；然后通过高渗反应器将高渗液循环引入红细胞载药反应器内，循环反应0.5-1h；最后通过等渗反应器将等渗液循环引入红细胞载药反应器内，循环反应5-10min；
(2)药物开关组装：等渗液循环反应完成后，将半渗透袋内的血液推注至 GOx反应器中，进行生物素-葡萄糖酶修饰；
(3)将修饰后的载药红细胞推注至血液透析器中，去除未修饰到红细胞表面的生物素-葡萄糖酶。
本发明胰岛素包载过程采用循环流动式反应，加速了包载进程。
在部分实施例中，作为优选的，低渗循环反应的反应温度为4℃；所述高渗循环反应的反应温度为37℃；动脉引血时，引入2-10mL全血，向半渗透袋内注入100-150U/mL的胰岛素溶液，胰岛素溶液与全血的体积比为1:10。
在部分实施例中，作为优选的，动脉引血时，引入10mL全血，向半渗透袋内注入100U/mL或150U/mL的胰岛素溶液1mL。
本发明通过对胰岛素包载的工艺进行优化，以获得较高的胰岛素包载量。
在部分实施例中，作为优选的，低渗液为：250mM NaCl，12.5mM葡萄糖， 12.5mM丙酮酸钠，12.5mM肌苷，12.5mM NaH2PO4·2H2O，0.63mM腺嘌呤， 550mOsm/Kg，pH 8；高渗液为：250mM NaCl，12.5mM葡萄糖，12.5mM丙酮酸钠，12.5mM肌苷，12.5mM NaH2PO4·2H2O，0.63mM腺嘌呤配置而成， 550mOsm/Kg，pH 8；等渗液为：生理盐水(0.9％的氯化钠水溶液)；当进行生物素-葡萄糖酶修饰时，向GOx反应器内注入GOx反应液；所述GOx反应液通过以下方法制备：10mg生物素溶解于1mL二甲基甲酰胺中，然后加入5mL葡萄糖酶溶液(2mg/mL)及10mg N，N'-羰基二咪唑，室温条件下搅拌1小时，然后将这个溶液放到透析袋中，常温透析24小时；所述步骤(3)中生物素-葡萄糖酶修饰的反应时间为0.2-0.5h。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明以非离体方式进行胰岛素药物包载给药，利用患者自身的红细胞作为药物载体，充分利用了红细胞药物载体的优势，有效延长药物作用时间，同时避免了输血感染问题的出现。
2、本发明包载设备与血液透析器结合使用，并通过对胰岛素红细胞包载工艺的优化，在达到较佳包载效率的同时，与血透时间相适应，将胰岛素药物作用与血透同时进行，给患者带来了便利。
附图说明
图1为本发明非离体胰岛素控释药物的包载设备与血液透析器联用的结构示意图；
图2为本发明非离体胰岛素控释药物的包载及控释过程示意图；
图3为本发明非离体胰岛素控释药物的SEM表征图；
图4为本发明非离体胰岛素控释药物的激光共聚焦图；
图中，A为FITC标记的胰岛素在红细胞的荧光表征，B为罗丹明B标记的 GOx在红细胞上的荧光表征，C为GOx-INS-ER的荧光表征；
图5为不同胰岛素溶液浓度与胰岛素包载量的曲线；
图6为不同低渗时间与胰岛素包载量的曲线；
图7为不同低渗温度与胰岛素包载量的曲线；
图8不同葡萄糖溶液中胰岛素释放量，即“开关”试验曲线；
图9为采用本发明进行非离体给药后对糖尿病模型兔血糖浓度的影响。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明进行详细说明。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创作型劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
糖尿病肾病病人需定期进行血液透析，且须每餐后注射胰岛素血糖控制不好，会引起糖尿病肾病，导致肾功能衰竭，如果不进行透析治疗,就会有生命危险。但是由于需随身携带胰岛素，给患者带来了极大的不便，一旦遗忘或者剂量不够，就会有很大的危险。
本申请提供了一种非离体胰岛素控释药物的包载设备，联合血液透析器4 使用，包括了红细胞载药段、药物控制开关组装段，如图1所示为采用本发明包载装置进行胰岛素控释药物非离体给药，具体包括：
一、血液透析器部分，即血液透析段，包括导管夹1、蠕动泵2、5、血液透析器4、废液缸7、透析液缸6、导管夹3，其中：
蠕动泵2第一端与患者动脉相连，第二端与血液透析器4相连，连接蠕动泵 2与血液透析器4的导管上设置导管夹3；血液透析器4第一端与蠕动泵2相连，第二端与蠕动泵5相连，第三端连接废液缸7，第四端连接透析液缸6；蠕动泵 5第一端连接血液透析器4，第二端连接患者静脉，连接蠕动泵5与患者静脉的导管上设置导管夹1；
导管夹1、3用于控制液体是否流动，蠕动泵2、5用于控制液体流量与流动方向，废液缸7用于置换废液，透析液缸6用于置换透析液。
二、红细胞载药段包括红细胞载药反应器9、低渗液反应器14、高渗液反应器17、等渗液反应器20、导管夹，其中；
红细胞载药反应器9内置半渗透袋，半渗透袋两端通过导管伸出红细胞载药反应器9外，一端与蠕动泵2相连，该连接导管上设置导管夹8，另一端与GOX 反应器11相连，该连接导管上同样设置导管夹10；低渗反应器14的第一端、高渗反应器17的第一端、等渗反应器20的第一端均与红细胞载药反应器9的第一端(胰岛素包载循环出口)相连，连接处导管上设有蠕动泵22；低渗反应器 14的第二端、高渗反应器17的第二端、等渗反应器20的第二端均与红细胞载药反应器9的第二端(胰岛素包载循环入口)相连。低渗反应器14、高渗反应器17、等渗反应器20两端的导管处分别设有导管夹15、13、18、16、21、19，通过导管夹15、13控制低渗液的循环流动，通过导管夹18、16控制高渗液的循环流动，通过导管夹21、19控制等渗液的循环流动。
三、药物开关组装段，包括GOx反应器11、导管夹，其中：
GOx反应器11第一端与红细胞载药反应器9第三端(GOx反应出口)相连，连接导管上设有导管夹10，GOx反应器11第二端与血液透析器4相连，连接导管上设有导管夹12。
本申请具体以实施例1和实施例2介绍此设备，具体地，实施例1为非离体给药整个过程，实施例2为红细胞包载GOx-INS-ER的过程。
实施例1：
具体参考图1，图1为本申请实施例1提供一种非离体红细胞包载胰岛素控制设备的整个给药过程的结构示意图。
打开导管夹8，通过蠕动泵2将所需血液泵入红细胞载药反应器9内置的半渗透袋后，关闭导管夹8。向半渗透袋的胰岛素注入口注射进胰岛素溶液，然后进行低渗-高渗-等渗的药物包载过程：首先与低渗液反应，打开低渗反应器14 两端的导管夹13、15，通过蠕动泵22将低渗液循环流至红细胞载药反应器9内，进行不断的循环，完成低渗反应，反应条件为4℃(通过将低渗反应器置于恒温箱内实现温度控制)、蠕动泵22，控制流量为0.2-0.5L/分钟，时间为2-3h；反应结束后，关闭蠕动泵22，关闭导管夹13、15，然后打开高渗反应器17两端的导管夹16、18，开启蠕动泵22，高渗液循环回流至红细胞载药反应器9内，进行不断循环的高渗反应，反应条件为37℃(通过将高渗反应器置于水浴锅内进行温控)、蠕动泵22参数为0.2-0.5L/分钟，反应时间为0.5-1h；反应结束后，关闭蠕动泵22，关闭导管夹16、18，打开等渗反应器20两端的导管夹19、 21，开启蠕动泵22，等渗液循环回流至红细胞载药反应器9内进行等渗常温反应，时间为10-20min；反应结束后，关闭蠕动泵22，关闭导管夹19、21，打开红细胞载药反应器9内置半渗透袋与GOx反应器11之间的导管夹10，让包载了胰岛素的血液流进GOx反应器11与GOx反应，关闭导管夹10，在4℃(通过将GOx反应器置于恒温箱内实现温度控制)下反应0.2-0.5h，打开导管夹12 和导管夹10，向半渗透袋的胰岛素注入口推注0.9％NaCl生理盐水，使得葡萄糖酶修饰后的血液注入血液透析器4进行常规血液透析，去除未包载的多余药物；最后打开患者与血液透析器4之间的导管夹1，让血液流回患者静脉。
实施例2：
具体参考图2，图2为本申请实施例2提供的一种非离体红细胞包载胰岛素控制设备的红细胞包载胰岛素并按照开关GOx的过程。
本实施例中，具体步骤如下：首先从动脉引血2-10mL全血，然后将红细胞低渗处理，将红细胞重悬于胰岛素溶液中，红细胞(全血)与胰岛素溶液的体积比为10:1，将细胞与胰岛素混合溶液悬置于红细胞载药反应器9内置的半透析袋中，并在4℃下与红细胞载药反应器9内循环流动的低渗缓冲液(250mM NaCl，12.5mM葡萄糖，12.5mM丙酮酸钠，12.5mM肌苷，12.5mM NaH2PO4·2H2O，0.63 mM腺嘌呤，550mOsm/Kg，pH 8)反应，放置2-3h；随后将红细胞高渗处理，使得高渗缓冲液(250mM NaCl，12.5mM葡萄糖，12.5mM丙酮酸钠，12.5mM 肌苷，12.5mM NaH2PO4·2H2O，0.63mM腺嘌呤配置而成，550mOsm/Kg，pH 8) 在红细胞载药反应器9中循环流动0.5-1h；再进行等渗反应，使得等渗液(0.9％ NaCl生理盐水)在红细胞载药反应器9中循环流动5-10min。最后将红细胞载药反应器9内置半透析袋中的溶液推注到GOx反应器11，GOx反应器11中加注的溶液为：10mg生物素溶解于1mL二甲基甲酰胺中，然后加入5mL葡萄糖酶溶液(2mg/mL)及N，N'-羰基二咪唑(10mg)，室温条件下搅拌1小时，然后将溶液放到透析袋中，常温透析24小时后即得GOx反应器内加注溶液。将生物素- 葡萄糖酶修饰载胰岛素的红细胞0.2-0.5h。打开导管夹12，将修饰完成的包载了胰岛素的红细胞进入血液透析器4，去除未能修饰到红细胞表面的生物素-葡萄糖酶，最终进入人体。
实施例3
制备所得红细胞包载胰岛素的表征：
如图3为实施例2制备得到的非离体胰岛素控释药物的扫描电镜图(SEM)，可以看出包载了红细胞后细胞形态无明显变化。图4为该控释药物的激光共聚焦扫描显微镜表征图，被FITC标记过的胰岛素呈绿色荧光，被罗丹明B标记过的葡萄糖酶呈红色荧光，可以看出红细胞已经成功包载胰岛素和GOx。
实施例4
胰岛素初始浓度对红细胞对胰岛素的包载量的影响：
以实施例2的方法进行非离体胰岛素控释药物的包载，其中，全血抽取10mL，注入胰岛素溶液体积为1mL，低渗温度4℃，低渗反应时间1h。
以不同浓度的胰岛素溶液注入比对最终包载的胰岛素量。从图5中可以看出，红细胞对胰岛素的包载量与胰岛素初始浓度有关，随着胰岛素浓度的升高，红细胞包载的量也是随之提高，呈正相关，当浓度升高到150U/mL，包载量升高不明显。
考虑包载量，优选胰岛素溶液浓度150U/mL。或考虑到成本效益，直接以市面上常见的胰岛素注射药物浓度100U/mL作为注入浓度。
实施例5
低渗预膨胀法的条件优化对胰岛素包载量的影响：
以实施例2的方法进行非离体胰岛素控释药物的包载，其中，全血抽取10mL，注入100U/mL胰岛素溶液体积为1mL，低渗温度4℃。
以不同低渗温度比对最终胰岛素的包载量。从图6中可以看出，红细胞对胰岛素的包载量与低渗时间有关，低渗时间越长，红细胞对胰岛素的包载量越大。低渗时间3h以后达到平衡，包载量升高不明显。且患者进行血透的时间不宜过长，所以我们选择低渗时间控制在2h。
以同样的包载方式进行低渗温度比对，低渗时间为2h。
从图7中可以看出，红细胞对INS的包载量与低渗时的温度有关，当低渗温度为4℃时，包载量最大。
所以综合考虑，低渗预膨胀法的条件为2h，温度4℃。
实施例6
GOx开关释放效果对胰岛素的释放：
从图8中可以看出，通过在不同浓度的葡萄糖溶液中“激活”本发明所获得的胰岛素控释药物来测试GOx的开关释放效果对胰岛素的释放。随着葡萄糖浓度的升高，胰岛素释放量逐渐升高。这表明本研究中构建的包载胰岛素的红细胞具备葡萄糖响应释放胰岛素的特性，且这种释放作用是由其表面的GOx来发挥作用，达到释放胰岛素的效果。
实施例7
本发明控释药物的缓释效果
糖尿病模型兔的建立：禁食8h后，将四氧嘧啶用生理盐水配制成5％的溶液，按150mg/Kg于半分钟内由耳缘静脉注射入兔子体内，72h后血糖高于16mmol/L 即为造模成功。
血透联合非离体胰岛素给药：采用实施例2进行非离体胰岛素控释药物包载，并采用实施例1的给药方式对糖尿病模型兔进行非离体给药，糖尿病模型兔的血糖值变化如图9所示。
从图9可以看出，本发明非离体胰岛素控释药物给药方式，能较长时间实现对血糖的控制，经血透加非离体胰岛素给药后，糖尿病模型兔的血糖下降到 6.1mmol/L以下，并保持48h。
本领域技术人员在考虑说明书及时间这里发明的公开后，将容易想到本申请的其他实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或其他适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为实例性的，本申请的珍珠范围和精神由权利要求的内容指出。
以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。
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